微小RNA與腦缺血再灌注損傷發病機制的研究進展

楊瑩 王超云

【摘要】缺血再灌注損傷是指組織缺血一段時間后再恢復血液供應，其生理功能不但未能恢復，反而呈現更加嚴重的功能障礙，引發更加嚴重的機體損傷。目前學者們對缺血再灌注損傷的發病機制仍持不同的意見，現有的防治方法仍未能取得令人滿意的效果。相關研究涉及的機制均存在局限性，且缺血再灌注損傷相關的調控通路間錯綜復雜的相互聯系，嚴重影響了臨床工作者對缺血再灌注損傷的認識及防治。因此近年來，學者們一直在尋找有效的治療方法，經過多年的探索，學者們發現微小RNA有助于治療腦缺血再灌注損傷，該文對微小RNA與腦缺血再灌注損傷的發病機制作一簡要綜述，以供同行們參考。

【關鍵詞】腦缺血再灌注損傷；病理機制；微小RNA

【Abstract】Ischemia-reperfusion （I/R） injury is defined as the blood supply restored after a certain period of tissue ischemia. The physiological function is not recovered but more severe tissue dysfunction occurs， leading to more severe organ injury. At present， scholars have different opinions on the pathogenesis of I/R injury. Current prevention and treatment cannot yield satisfactory outcomes. Previous studies related to the pathogenesis of I/R injury obtain limited findings. The complex interaction among I/R injury-related signaling pathways seriously affects the understanding， prevention and treatment of I/R injury. Hence， the researchers have been exploring effective approaches to treat I/R injury. Recently， microRNA has been proven to contribute to the treatment of cerebral I/R injury. In this paper， the relationship between microRNA and the pathogenesis of cerebral I/R injury is briefly reviewed， aiming to provide reference to the researchers.

【Key words】Cerebral ischemia/reperfusion injury； Pathogenesis； microRNA

腦缺血再灌注損傷是一個復雜的過程，包括許多環節，例如線粒體損傷、鈣超載、氧自由基的累積、炎癥反應及細胞凋亡等[1]。目前，該病發病率逐年升高，嚴重危害人類健康。腦是人體對缺氧最為敏感的器官，腦組織缺血將會導致局部腦組織及其功能的損害，短期不完全性缺血只引起可逆性損害，而長時間的完全缺血或嚴重缺血會引起梗死，且加重對腦組織的損傷。目前公認的引起腦缺血再灌注的病理生理機制有自由基增多、鈣離子超載、炎癥反應、興奮性氨基酸毒性、細胞凋亡。

微小RNA是一類內源性的，長度約21～27個核苷酸的單鏈非編碼小RNA，通過與靶基因3非翻譯區的堿基互補配對結合，使配對形成的RNA誘導沉默復合體，導致靶基因降解或翻譯抑制[2-3]。其也可以在基因的轉錄后階段調控細胞的增殖、分化，與多種疾病都有相關性，也已成為臨床研究熱點。1個微小RNA可以調控1個或多個靶基因，同時多個微小RNA也可以調控同一基因，所以微小RNA及其相應的靶基因能形成復雜的調控網絡，共同發揮作用。目前，國內外學者普遍認為微小RNA對腦缺血再灌注損傷有明顯的治療效果，并進行了大量的研究報道，涉及的信號通路也不盡相同。

一、腦缺血再灌注損傷的發病機制

1.自由基與腦缺血再灌注損傷

自由基在腦缺血再灌注損傷的過程中發揮重要作用，其中兩大類主要的自由基是活性氧和活性氮。

機體內的活性氧會產生氧化應激，主要是由于機體內的氧化與抗氧化物質的不平衡引起的。在此過程中，機體內多種酶的活性會發生改變，如黃嘌呤氧化酶，超氧化物歧化酶等，均會使活性氧大量聚集。而腦是人體對缺氧最為敏感的器官，對氧化應激極其敏感，易產生大量的活性氧，造成神經元損傷[4]。在生理條件下，活性氧可以作為氧化還原信號分子，具有重要的生物學功能。例如，活性氧可以增強蛋白激酶C依賴的興奮性突觸后電位，也可以抑制中樞神經系統中多巴胺的釋放。然而，缺血再灌注損傷誘導的活性氧如果過度積累，則會導致缺血腦組織的損傷。近幾十年來，研究者們已深入調查了活性氧在腦缺血再灌注損傷中的作用，在缺血再灌注損傷中，活性氧的積累能激活炎癥因子，誘導脂質過氧化，并易于通過血腦屏障和擴大梗死。另外，當體內活性氧的產生大大超出機體的清除能力時，其會攻擊生物大分子。線粒體是活性氧的主要來源和促凋亡作用靶點。所以保護好線粒體則能夠減輕腦缺血再灌注損傷[5]。

活性氮在腦缺血再灌注損傷中的主要表現形式是一氧化氮和過氧亞硝基陰離子，低氧環境能使誘生型一氧化氮合酶生成增多，使氧化基團副產物如亞硝酸鹽等生成增加，進一步導致細胞損傷；同時高濃度的一氧化氮也能使眾多的線粒體呼吸酶失活。在腦缺血或腦缺血再灌注損傷過程中，一氧化氮能夠與超氧陰離子快速反應，以有限的擴散速率生成過氧亞硝基陰離子，而過氧亞硝基陰離子易于滲透到脂質雙層，介導酪氨酸殘基的硝化，抑制酪氨酸磷酸化，進而影響細胞信號轉導。因此，活性氧不僅是腦缺血再灌注損傷的關鍵因素，也是缺血再灌注的重要藥物靶點。

2.鈣離子超載與腦缺血再灌注損傷

在腦缺血再灌注損傷的早期，鈣離子超載是引起腦細胞損傷的關鍵，神經細胞內鈣離子濃度升高既是腦損傷的結果，也是腦損傷進一步加重的始動因子。腦缺血再灌注損傷之后，神經細胞內過量的鈣離子會激活鈣依賴性酶促蛋白，產生細胞毒性反應。研究表明，在腦缺血過程中會出現能量代謝障礙，導致細胞ATP缺乏，經過一系列連鎖反應致細胞內鈣超載，從而造成腦損傷。

同時鈣離子引起再灌注損傷的病理機制也十分重要。在腦缺血時，谷氨酸會在突觸處大量堆積，激活了N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體，細胞膜去極化，造成鈣離子內流加劇，損傷神經元，同時激活細胞內的細胞溶解途徑。在正常情況下，細胞外的鈣離子濃度遠遠高于細胞內，這個濃度梯度主要靠鈣離子的通透性和鈣泵來維持。細胞內高鈣離子的另一主要原因是離子泵不能正常運轉，電壓門控型鈣通道開放，促使鈣離子大量內流[6]。所以有學者認為，我們可以通過抑制電壓門控型鈣通道來保護神經元細胞。

二、微小RNA在腦缺血再灌注中的研究

目前已知，成熟的微小RNA可以通過部分互補或完全互補與下游靶基因的微小RNA結合，這些小分子也可以被釋放到血液循環中，調節多種基因的表達。有學者提出，微小RNA也能調節血管形成因子，例如微小RNA-210介導的內皮細胞血管的形成與其誘導的線粒體新陳代謝有關[7]。

1.微小RNA在腦組織中的表達

近年來，學者們從動物組織中分離出多種微小RNA，超過一半的微小RNA可以在腦組織中表達。這些微小RNA能夠調節大腦皮層的突觸和神經元細胞，對神經系統的功能起調控作用，也會影響缺血再灌注損傷。比如在腦缺血再灌注24 h后微小RNA-206、微小RNA-145、微小RNA-155、微小RNA-290蛋白表達增加，而微小RNA-221、微小RNA-27a、微小RNA-218、微小RNA-137蛋白表達下降。近年來有文獻報道，在腦中高表達的微小RNA也有區域差異性，例如微小RNA-let-7g、微小RNA-92b、微小RNA-146b等在大鼠海馬區的表達明顯高于大腦皮層；微小RNA-206、微小RNA-497在小腦中高表達，而微小RNA-132、微小RNA-212在小腦中則低表達。不同的微小RNA在腦中參與的生理調控機制不盡相同，具體的機制還需進一步探討。

2.微小RNA在腦缺血再灌注中的調控作用

研究表明，在中樞神經系統中存在著多種微小RNA，它們與神經系統的分化和生物學功能密切相關，而且這些微小RNA也會參與到中樞神經系統的調控網絡中[8]。在神經系統中，存在著大量的神經膠質細胞，當發生腦缺血或腦組織損傷時，小膠質細胞會被激活，釋放出多種促炎癥因子和神經毒性因子，對神經元造成不可逆轉的損傷。因此，我們可以通過抑制小膠質細胞的激活來減輕腦組織的損傷。比如，在腦缺血引發的促小膠質細胞激活的過程中，微小RNA-181c能直接調控TNF-α的表達，參與小膠質細胞介導的凋亡。微小RNA在腦缺血再灌注中的調控機制不盡相同，還有的微小RNA是參與缺血后的神經再生調節、星形膠質細胞的凋亡等[9]。

2.1微小RNA參與腦缺血再灌注中小膠質細胞的激活

腦缺血時，損傷的細胞會釋放出大量的促炎癥因子，同時神經系統中的小膠質細胞受刺激也會由靜息狀態變為活化狀態，進一步釋放出有害物質，損傷神經元細胞。在此過程中，許多微小RNA會參與其中，通過抑制小膠質細胞的活化來減輕腦組織的損傷。

目前，已有大量文獻報道，微小RNA-let-7c可以調控膠質細胞激活引發的炎癥反應從而影響腫瘤細胞的生長[10]。微小RNA-let-7c-5p對腦缺血損傷有保護作用，主要是由于其直接靶向Caspase-3而發揮抗炎作用，同時抑制了小膠質細胞的激活。

微小RNA-155也是微小RNA家族中的成員，其可參與多種炎性反應。最近研究結果顯示，在小鼠體內注入微小RNA-155抑制劑可以減少小鼠缺血后的腦梗死區，減少組織損傷，改善組織功能恢復。此外，微小RNA-155抑制劑也能改變遠端大腦中動脈閉塞中幾種細胞因子基因的表達[11]。有研究表明，微小RNA-155具有多功能，參與了炎癥和免疫等多種生物學過程。在神經小膠質細胞受刺激后，微小RNA-155的表達迅速上調，抑制了微小RNA-155后，一氧化氮的產生以及炎癥細胞因子、誘導型一氧化氮合酶的表達也明顯減少，對神經細胞起保護作用。Ship1、Socs-1是微小RNA-155的靶蛋白，可以通過對相關通路的研究為腦缺血再灌注的治療提供依據。

2.2微小RNA參與腦缺血后的神經再生調節

血管新生相關缺血性疾病的研究大部分集中于心肌梗死、腫瘤等領域，但缺血性腦卒中后血管新生的研究并不多見。目前，微小RNA-210已成為國內學者研究血管新生的熱門目標，并且體外實驗也驗證了微小RNA-210可以結合其靶基因Ephrin-A3，使內皮細胞遷移，促進新生毛細血管生成[12]。

2014年有學者首次提出微小RNA-296是腦缺血梗死后血管新生的正調控因子之一[13]。形成結構完整且有生物學功能的血管，管腔化過程是必不可少的。而微小RNA-296的過表達可明顯促進血管內皮細胞形成管腔樣結構，達到促進血管新生的作用。

2.3其他的微小RNA在腦缺血中的調控

微小RNA-185是近幾年新發現的微小RNA，在動物的不同組織細胞中廣泛表達，在腫瘤、神經發育、脂質代謝中起著不可或缺的作用，此外其還參與血管生成、缺血性卒中過程[14]。微小RNA-185已經被證實在多種疾病的發生發展中起著重要的調控作用，其可通過調節下游靶基因NTRK3等起治療作用。目前，大部分國內外學者對微小RNA-185缺乏深入研究，但趙凱濤等[16]已證實在缺血再灌注損傷的大鼠大腦皮層微小RNA-185的蛋白表達量明顯高于正常大鼠的相同區域，故提出可以通過抑制微小RNA-185的表達來減少腦缺血損傷。

Lcn-2是Lipocalin蛋白超家族中的重要成員之一，在多種動物組織中廣泛存在，可以參與細胞對鐵的攝取。在腦缺血時，星形膠質細胞受到損傷，其中的海馬區域會高表達Lcn-2[17]。微小RNA-138可以直接靶向Lcn-2，其低表達會上調Lcn-2表達，提高細胞對鐵的攝入量，導致細胞滲透壓的改變或鐵中毒，最終影響細胞的增殖能力，進而誘導細胞凋亡，對機體造成損傷[18]。因此可以調控微小RNA-138的表達減輕腦缺血區域的損傷。

微小RNA可通過相關的自噬途徑調控內皮祖細胞的正常自噬水平及其存活、抑制低氧誘導的線粒體自噬，可以達到治療腦血管疾病的作用。例如微小RNA-137通過抑制線粒體自噬受體FUNDC1和NIX的表達進而抑制低氧誘導的線粒體自噬[19]。

三、診斷腦血管疾病的微小RNA生物標志物

近年來越來越多的研究表明，微小RNA與血管疾病密切相關，并且在血管疾病的診斷和預后中扮演著重要的角色。例如在腦缺血再灌注過程中，微小RNA-221的表達下調，Tsai等[20]的實驗結果顯示，在缺血性腦卒中患者外周血清中，微小RNA-221的表達量明顯低于健康人，所以微小RNA-221可以成為缺血性腦病的生物標志物。有學者應用高通量測序技術檢測出微小RNA-127、微小RNA-99b、微小RNA-320等19個微小RNA在小動脈閉塞性腦卒中患者血漿中表達上調，而微小RNA-451等5個微小RNA則表達下調，這些均可以作為腦血管疾病的生物學標志物。

四、微小RNA在腦缺血再灌注損傷中的應用

社會的快速發展，使人們承受了更多的生理、心理負擔，使得缺血性腦損傷的發病率逐年升高，找到有效的治療方法刻不容緩。從近幾年的研究進展來看，治療腦缺血的方法有以下幾種：①抑制一氧化氮的過量生成；②抑制細胞凋亡；③應用新型化合物，例如5D化合物；④近年來提出的調控微小RNA的相關通路，這為以后治療腦缺血開辟了一條新路。

2015年有學者首次報道了在腦缺血缺氧后微小RNA-376b-5p與血管新生的關系，并提出微小RNA-376b-5p可能通過調控HIF-I-VEGF-Notch信號通路來參與抑制血管新生的過程，因此可以通過降低微小RNA-376b-5p的表達促進血管新生。促進血管新生是一種改善腦組織血流供應的有效方法，也是近幾年來學者研究的熱點之一。

缺血性腦損傷時，微小RNA-124的表達也會發生明顯改變，其可以靶向多種目標基因，但具體的調控機制尚未明確，其可能通過調節Usp-14增加缺血后神經血管重塑，調控Bcl-2、Bcl-x和iASPP等抗凋亡蛋白來調節腦缺血時的細胞凋亡，激活Notch信號通路促進神經再生，促進DNA修復等以減輕對腦組織的損傷。

五、展望

腦缺血再灌注損傷是極其復雜的過程，發病機制也有多種，至今仍存在多項爭議。目前的相關研究主要集中在動物模型的建立之上，如動脈線栓模型、轉基因小鼠模型等。微小RNA在腦缺血再灌注中的作用越來越受到重視，未來將有更多的微小RNA會被學者們發現，為臨床治療腦缺血再灌注損傷提供有力的理論基礎，為腦缺血再灌注的防治提供實際應用價值。

參考文獻

[1]王紅梅，賀永貴，伊紅麗，李海波. 腦缺血再灌注損傷發生機制及治療進展.河北聯合大學學報（醫學版），2014，16（02）：186-188.

[2]Kim BK，Kim I，Yoon SK. Identification of miR-199a-5p target genes in the skin keratinocyte and their expression in cutaneous squamous cell carcinoma. J Dermatol Sci，2015，79（2）：137-147.

[3]Liang CY，Wang YB，Murota Y，Yukiko Murota，Liu X，Smith D，Siomi MC，Liu QH. TAF11 assembles the RISC loading complex to enhance RNAi efficiency. Mol Cell，2015，59（5）：807-818.

[4]常虹，盧祖能.微小RNA-151a-3p對大鼠腦缺血再灌注神經損傷的影響及其機制.中華實驗外科雜志，2016，33（3）：678-681.

[5]閆曉英，姜亞磊，狄烊，孟天嬌，金宏，齊玲.腦缺血損傷后Ca2+超載引起神經細胞凋亡的機制.吉林醫藥學院學報，2013，34（4）：277-280.

[6]王曉平，倪京滿.腦缺血再灌注損傷的研究及藥物治療進展.中國新藥雜志，2016，25（6）：659-691.

[7]葛曙雄，王涌.微小RNA與腫瘤微環境.新醫學，2016，47（1）：7-11.

[8]黃立剛. miRNA-29c通過靶向調控凋亡基因Birc2和Bak1參與電刺激小腦頂核在大鼠腦缺血再灌注損傷中的神經保護作用.廣西：廣西醫科大學，2015.

[9]劉利群.MicroRNA-34b-5p調控發育期驚厥后海馬星形膠質細胞凋亡及其機制的研究.湖南：中南大學，2014.

[10]Zhan M，Qu Q，Wang G，Zhou HH. Let-7c sensitizes acquired cisplatin-resistant A549 cells by targeting ABCC2 and Bcl-XL. Die Pharmazie，2013，68（12）：955-961.

[11]Caballero-Garrido E，Pena-Philippides JC，Lordkipanidze T，Bragin D，Yang YR，Erhardt EB，Roitbak T. In vivo inhibition of miR-155 promotes recovery after experimental mouse stroke. J Neurosci，2015，35（36）：12446-12464.

[12]Zeng L，He X，Wang Y，Tang Y，Zheng C，Cai H，Liu J，Wang Y，Fu Y，Yang GY. MicroRNA-210 overexpression induces angiogenesis and neurogenesis in the normal adult mouse brain. Gene Ther，2014，21（1）：37-43.

[13]馮潔.MicroRNA-296對腦缺血梗死后血管新生的調控機制研究.湖南：中南大學，2014.

[14]Hou JY，Liu L，Zhu Q，Wu YB，Tian Bei，Cui L，Liu Y，Li XM. MicroRNA-185 inhibits angiogenesis in human microvascular endothelial cells through targeting stromal interaction molecule 1. Cell Biol Int，2016，40（3）：318-328.

[15]Li SH，Su SY，Liu JL. Differential regulation of microRNAs in patients with ischemic stroke. Curr Neurovasc Res，2015，12（3）：214-221.

[16]趙凱濤，楊婷，郝明華，呂彥，王雙，陳會生.miR-185與Apba-1在大鼠腦缺血再灌注損傷的表達變化及調控關系. 解放軍醫藥雜志，2016，28（3）：13-17.

[17]于澎，顏秀麗，黃朔，吳江，奚國華，華雅，董銘.腦出血后星形膠質細胞表達運鐵蛋白LCN2. 中風與神經疾病雜志，2013，30（7）：598-601.

[18]楊明環，張波，湯祥軍，張力，羅杰. microRNA-138在大鼠腦缺血再灌注神經損傷中的作用與機制研究.湖北醫藥學院學報，2015，34（4）：347-352.

[19]Wang P，Liang J，Li Y，Li J，Yang X，Zhang X，Han S，Li S，Li J. Down-regulation of miRNA-30a alleviates cerebral ischemic injury through enhancing beclin1-mediated autophagy. Neurochem Res，2014，39（7）：1279-1291.

[20]Tsai PC，Liao YC，Wang YS，Lin HY，Lin RT，Hank Juo SH. Serum microRNA-21 and microRNA-221 as potential biomarkers for cerebrovascular disease. J Vasc Res，2013，50（4）：346-354.

（收稿日期：2017-08-30）

（本文編輯：洪悅民）