冠狀動脈微循環障礙加速大鼠心肌梗死后不良心室重構的機制研究

郭文玉 彭長農 柯曉 鄒春霞 王小慶

【摘要】目的探討大鼠心肌梗死后合并冠狀動脈微循環障礙出現心室重構與心功能變化的關系及可能的機制。方法使用月桂酸鈉構建冠狀動脈微循環障礙模型，行前降支血管結扎建立心肌梗死模型，40只SD大鼠隨機分為4組，分別為假手術組（Sham組）、心肌梗死組（MI組）、微循環障礙組（CMD組）、心肌梗死+微循環障礙組（MI+CMD組），4周后行UCG測量左室收縮末徑（LVESD）及舒張末徑（LVEDD）、LVEF，取心肌組織行組織病理學檢查、免疫組織化學染色（免疫組化），并采用蛋白免疫印跡法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達水平。結果與Sham組大鼠比較，其余3組的LVEDD和LVESD均升高，LVEF下降（P均<0.05），MI+CMD組改變最為明顯。病理組織學及免疫組化均提示與MI組或CMD組比較，MI+CMD組心肌纖維化程度及膠原表達水平最高；在蛋白表達方面，與Sham組相比，其余3組大鼠心肌Bax蛋白表達水平增加，而Bcl-2蛋白表達水平降低（P<0.05），其中MI+CMD組Bax蛋白表達水平最高，而Bcl-2蛋白表達水平最低。結論微循環障礙可影響心肌梗死后左心室重構，其加重左心室重構可能的機制包括誘導心肌細胞的凋亡、加重心肌膠原沉積以及促進心肌纖維化進展。

【關鍵詞】冠狀動脈微循環障礙；細胞凋亡；心室重構；Bax；Bcl-2

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship and potential mechanism between ventricular remodeling and cardiac function variation after myocardial infarction complicated with coronary microcirculation dysfunction in rat models. MethodsThe rat models with coronary microcirculation dysfunction were established by sodium laurate. The myocardial infarction models were established by the ligation of descending anterior branch vessels. Forty SD rats were randomly divided into four groups including the sham surgery group （Sham）， myocardial infarction group （MI）， coronary microcirculation dysfunction group （CMD） and myocardial infarction+coronary microcirculation dysfunction group （MI+CMD）. At postoperative 4 weeks， the left ventricular end-systolic diameter （LVESD）， the left ventricular end-diastolic diameter（LVEDD） and the left ventricular ejection fraction （LVEF） were quantitatively measured by echocardiogram. The myocardial tissues were subject to histopathological examination， immunohistological staining and detection of Bax and Bcl-2 proteins by western blot. ResultsCompared with the Sham group， the LVEDD and LVESD in the other three groups were significantly elevated， whereas the LVEF tended to decrease， especially the MI+CMD group （all P<0.05）. Histopathological and immunohistochemical staining prompted that compared with the MI or CMD group， the severity of myocardial fibrosis and the expression level of collagen in the MI+CMD group were the most significantly up-regulated. Compared with the Sham group， the expression levels of the Bax protein were significantly up-regulated， whereas the expression levels of Bcl-2 protein were dramatically down-regulated in the other three groups （all P<0.05）. The highest expression of Bax protein and the lowest expression of Bcl-2 protein were detected in the MI+CMD group. ConclusionsCoronary microcirculation dysfunction exerts a regulatory effect on the left ventricular remodeling after myocardial infarction. The underlying mechanisms probably include induction of myocardial cell apoptosis， aggravating collagen deposition and promoting the progression of myocardial fibrosis.

【Key words】Coronary microcirculation dysfunction； Apoptosis； Ventricular remodeling； Bax； Bcl-2

心肌梗死是威脅人類健康的重大疾病之一，心肌梗死后的心力衰竭和心臟破裂是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）致死、致殘的重要原因[1]。目前，AMI的再灌注治療已使冠心病患者預后獲得了極大的改善[2]。然而臨床實踐中發現，即使心外膜冠狀動脈再通，仍有相當一部分患者出現心臟進行性擴大、心功能惡化，這與心肌微血管損傷和微循環灌注障礙密切相關，提示冠狀動脈微循環障礙（CMD）可能參與心室重構，影響心功能。本研究中使用月桂酸鈉構建CMD模型，探討大鼠心肌梗死后合并CMD與心室重構及心功能變化的關系，以及可能的相關分子機制，現報告如下。

材料與方法

一、實驗動物

健康無特定病原體（SPF）級SD雄性大鼠40只，體質量220～260 g，由中山大學北校區動物中心提供。本研究實驗動物處置全程依照中山大學實驗動物福利和倫理學要求，在SPF級動物房完成。

二、 試劑及儀器

月桂酸鈉購自廣州艾斯金科技有限公司，3%戊巴比妥鈉、安定注射液、生理鹽水購自中山大學附屬第一醫院，兔抗大鼠Bax、Bcl-2單克隆抗體購自美國CST公司，兔抗大鼠CD31、Collagen I多克隆抗體購自英國Abcam公司，免疫組織化學染色（免疫組化）鏈霉親和素-生物素復合物（SABC）試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；小動物呼吸機購自美國Harvard Aparatus公司，小動物手術器械購自上海器械集團有限公司。

三、 實驗方法

1.動物分組

將40只SD大鼠按隨機數字表法分為4組：假手術組（Sham組）、心肌梗死組（MI組）、微循環障礙組（CMD組）、心肌梗死+微循環障礙組（MI+CMD組）。Sham組僅行假手術，不建立模型；MI組僅行前降支血管結扎建立心肌梗死模型；CMD組僅通過月桂酸鈉誘導大鼠冠狀動脈微血栓形成模型；MI+CMD組先建立心肌梗死模型后，再誘導冠狀動脈微血栓形成模型。

2.模型制備

4組大鼠均予腹腔麻醉后行氣管插管，插管成功后實施開胸手術：①MI組在顯微鏡直視下以5-0手術縫線行前降支近段結扎的方法建立大鼠AMI模型，觀察到左心室前壁運動減弱及顏色變白，判斷為建模成功；②Sham組手術絲線僅穿過左冠前降支主干而不結扎冠狀動脈，其余操作同MI組；③CMD組通過主動脈根部注射月桂酸鈉制作微循環障礙模型，開胸后分離大鼠主動脈，并用血管夾夾閉主動脈后，迅速以微量注射器從主動脈根部直接注入0.3 ml（1 g/L）月桂酸鈉，之后松開血管夾恢復供血；④MI+CMD組先予主動脈根部注射月桂酸鈉，再行前降支近段結扎。4組術畢均予胸腔內注入少量甲硝唑預防感染及減輕胸腔內粘連。術后4組大鼠均予室內飼養、規律照明、自由進食及飲水，繼續飼養4周。造模過程中如出現死亡大鼠以前述方法補充。

3.UCG檢測

飼養4周后，再次使用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，通過UCG行心臟超聲檢查，評價指標包括：①左心室舒張末期容積（LVEDD）與左心室收縮末期容積（LVESD）；②運用單平面Simpson法，超聲診斷儀自動得出LVEF與短軸縮短率（LVFS）。

4.組織病理學檢查

超聲檢查后，予戊巴比妥鈉過量麻醉處死各組大鼠，取出心臟，用4%多聚甲醛浸泡固定、石蠟包埋、切片。行蘇木素-伊紅染色、Masson染色，顯微鏡下觀察心肌纖維病理形態學變化，統計正常形態心肌細胞面積比、膠原纖維染色陽性面積比。

5.免疫組化

取4組大鼠左心室心肌組織，常規4%多聚甲醛固定后，石蠟切片常規脫蠟至水，檸檬酸抗原修復，內源性過氧化物酶阻斷，順序加入一抗、二抗，二氨聯苯胺（DAB）顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片、鏡檢。采用Leica顯微鏡采集圖像，鏡下200倍觀察，采集10個視野，并使用NIS-Element 3.0軟件進行圖像分析，統計各組的毛細血管密度（CD31陽性面積）及膠原表達量（CollagenⅠ陽性面積）。

6.Bax、Bcl-2蛋白表達水平的檢測

取各組新鮮大鼠左心室心肌組織，提取蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）比色法進行蛋白定量；配置10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白，蛋白樣品100℃煮沸，等量蛋白樣品行SDS-PAGE電泳，轉印至聚偏氟乙烯膜上，予Bax 、Bcl-2一抗及辣根過氧化物酶標記二抗孵育，增強化學發光法顯色，曝光后掃描，用Image J圖像分析軟件對曝光后的蛋白條帶進行統計分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的灰度值作為對照，計算Bax、Bcl-2蛋白相對表達水平。

四、統計學處理

采用SPSS 18.0分析數據。計量資料以±s表示，多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。結果

一、 4組大鼠的UCG指標比較

與Sham組大鼠比較，MI組大鼠的LVEDD和LVESD均升高，而LVEF下降（P均<0.05），提示心力衰竭模型構建成功。與Sham組相比，CMD組的LVEDD與LVESD也有所升高，EF值下降（P均<0.05），而MI+CMD組較MI組或CMD組，LVEDD與LVESD均進一步升高，EF及FS呈進行性下降（P均<0.05），見表1。

二、 4組大鼠的心肌組織病理學形態比較

1. 蘇木素-伊紅染色結果

光鏡下，Sham組大鼠心肌細胞排列整齊、結構清晰，細胞外間質較少，顯示正常的心肌細胞形態。MI組及CMD組與Sham組相比，心肌纖維排列明顯紊亂，心肌細胞間隙增寬，間質可見纖維化；而MI+CMD組與MI組比較，心肌纖維更加紊亂，間質纖維化程度更加嚴重。定量分析顯示，MI組、CMD、MI+CMD組正常形態心肌細胞面積比均低于Sham組，其中MI+CMD組的正常形態心肌細胞面積比最低（P均<0.05），見圖1。

2.Masson染色結果

Masson 染色正常的心肌組織被染成紅色，膠原纖維被染成藍色。Sham組膠原纖維較少，而MI組、CMD、MI+CMD組心肌藍染的膠原纖維較Sham組表達量明顯增多，其中MI+CMD組膠原纖維程度最高（P均<0.05），見圖2。

三、4組大鼠心肌組織CD31和Collagen I免疫組化表達結果比較

與Sham組相比，MI組、CMD組、MI+CMD組心肌組織中Collagen I陽性面積比升高（P均<0.05），而MI+CMD組中Collagen I陽性面積比最高，見圖3。與Collagen I陽性面積比相反，與Sham組相比，其余3組的CD31陽性面積比明顯降低，而MI+CMD組的CD31陽性面積比最低（P均<0.05），見圖4。

5討論

現有研究顯示，部分MI患者即使經過完全血運重建治療，仍然有反復心絞痛發生，最主要的原因可能是冠狀動脈微循環發生障礙，導致心肌細胞水平的灌注不充分，繼而出現心臟結構和功能的改變，影響預后[3]。這揭示探討CMD與心肌梗死后不良心室重構之間的病理生理機制，對制定冠心病的治療策略有重要意義。

冠狀動脈微循環系統不僅是心肌組織細胞營養交換的部位，同時也負責心肌細胞的營養供應及代謝產物清除。近年研究發現，CMD可導致心肌細胞的缺血、壞死及梗死面積增加、心功能下降[4]。隨著研究的深入，人們逐漸認識到導致心功能下降的基本機制就是心室重構。研究表明，心肌梗死后心室重構的程度依賴于心肌缺血程度或心肌梗死面積和修復治療[5-7]。前者提示冠狀動脈微循環損傷程度越重或心肌梗死面積越大對心臟結構、功能的損害越明顯，后者提示心肌梗死后多種機制或因素參與了心室重構的發生、發展[8]。心室重構包括心肌實質重構和心肌間質重構，后者主要指的是破壞了心肌間質纖維膠原的合成以及降解之間的動態平衡[9]。心室重構的發病機制復雜，主要機制包括細胞外基質和膠原蛋白的異常增多和過度沉積、心肌細胞的凋亡、相關基因表達異常等。本研究中，與Sham組相比，其余3組發生了LVEDD擴大，LVEF下降的變化；而MI+CMD組與MI組或CMD組相比，表現出更為嚴重的左心室重構及LVEF的下降，提示微循環障礙對于左心室重構起促進作用。研究表明，越多的心肌細胞凋亡，必將導致越多的膠原沉積以填充缺失的心肌細胞[10]。Bcl-2基因為調亡抑制基因，Bax基因為促凋亡基因。本研究顯示，MI+CMD組顯示出更高的Bax蛋白表達水平，而Bcl-2蛋白表達水平最低，提示合并微循環障礙可比單純前降支結扎導致更多的心肌細胞凋亡。

另有研究顯示，心肌梗死發生后大量的心肌細胞由于缺血、缺氧而發生壞死、凋亡，心肌細胞的增殖能力弱，從而激活增殖成纖維細胞，分泌大量膠原等細胞外基質填充缺失的心肌細胞[11]。CD31是最常用的評估組織血管新生的標志物。多項研究顯示，AMI后新生血管的增多可以減少及防止對心臟的二次損害，給即將缺氧的單核細胞提供更充分的血供，并縮短促炎反應以及減輕不良的重構[12-13]。本研究的免疫組化結果顯示，與Sham組比較，其余3組梗死心肌區域均出現CD31陽性面積比減少，Collagen I陽性面積比增多，而MI+CMD組的CD31陽性面積比減少更加明顯，蘇木素-伊紅染色和Masson染色也同樣提示MI+CMD組心肌纖維化程度尤為嚴重，說明在心肌梗死過程中，微循環障礙加重了心肌纖維化的進程，從而導致了心室重構的演變以及心功能的惡化。

綜上所述，本研究明確了微循環障礙對心肌梗死后左心室重構的調控作用，其加重左心室重構可能的機制包括誘導心肌細胞的凋亡，加重心肌膠原沉積，促進心肌纖維化進展。對于心肌梗死患者，如何保護其微循環障礙可能與單純開通心外膜血管同樣重要。

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（收稿日期：2017-07-28）

（本文編輯：林燕薇）