Clinprot技術篩選帕金森病血清標志物的研究

鄭明慧 李競 鮑蘊文 潘昆貽 朱樹華 胡坤華

【摘要】目的利用液體蛋白芯片-飛行時間質譜技術（CLINPROTTM MALDI-TOF/TOF MS，Clinprot技術）尋找帕金森病敏感的血清分子標志物。方法對51例帕金森病患者的血清和51例性別、年齡相匹配的正常對照者血清進行Clinprot技術分析， 選擇P≤0.05和表達差異大于2倍的蛋白峰進行質譜分析。采用遺傳算法建立疾病診斷模型，驗證模型敏感度和特異度。結果成功建立了帕金森病和正常血清的疾病診斷模型， 模型特異度為98.45%，敏感度為91.83%。采用Clinprot技術同時找到5個感興趣的蛋白差異峰，相對分子量分別為1 946、2 211、2 368、4 055和4 212，通過二級質譜檢索Mascot數據庫獲得匹配蛋白，分別為核苷二磷酸激酶6、睪丸表達序列13B蛋白、核糖核酸酶7、THAP結構域蛋白3、氨轉運蛋白Rh型C蛋白。結論Clinprot技術能夠客觀顯示出帕金森病患者與正常對照者血清差異蛋白，該研究鑒定出的5種蛋白有望成為帕金森病診斷的新分子標志物。

【關鍵詞】帕金森病；液體蛋白芯片-飛行時間質譜技術；蛋白質組學

【Abstract】ObjectiveTo utilize the matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry technique（CLINPROTTM MALDI-TOF/TOF MS， Clinprot technique）to identify the sensitive serum molecular biomarkers of Parkinsons disease. MethodsThe serum samples of 51 patients with Parkinsons disease and 51 gender- and age-matched healthy controls were collected and subject to Clinprot technique analysis. The protein peaks with P≤0.05 and differential expression of a >2-fold change were analyzed by MALDI-TOF/TOF MS. The diagnostic model of Parkinsons disease was established by genetic algorithm. The sensitivity and specificity of the diagnostic model were validated. ResultsThe diagnostic models of Parkinsons disease and normal serum were successfully established. The specificity was calculated as 98.45%， and 91.83% for sensitivity. Clinprot technique was used to detect 5 differentially-expressed protein peaks （1 946 Da， 2 211 Da， 2 368 Da， 4 055 Da and 4 212 Da）. The matched proteins were retrieved from the Mascot database including nucleoside diphosphate kinase 6， testis-expressed sequence 13B protein， ribonuclease 7， THAP domain-containing protein 3 and ammonium transporter Rh type C. ConclusionClinprot technique can objectively identify the differentially-expressed proteins between Parkinsons disease patients and normal controls. The five proteins identified in this investigation might become novel molecular biomarkers for the diagnosis of Parkinsons disease.

【Key words】Parkinsons disease； Clinprot technique； Proteomics

帕金森病是中老年神經變性疾病之一，中國發病人數約199萬，且逐年增加[1]。本病病理本質是黑質紋狀體多巴胺能神經元進行性缺失。當多巴胺能神經元不足50%時患者開始出現臨床癥狀，表現為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直、姿勢步態障礙[2]。目前本病的病因和發病機制尚未明確，可通過病史、臨床癥狀，結合CT或MRI，以及檢測對左旋多巴藥物的反應性達到診斷目的，但此時疾病往往已經發展為中晚期，療效差。早期發現早期治療可獲得良好效果，是影響帕金森病預后的關鍵，但現階段缺乏早期診斷手段，因此急需尋找一些更靈敏，特異度更高的分子標志物，以達到早期診斷的目的[3-5]。液體蛋白芯片-飛行時間質譜技術（CLINPROTTM MALDI-TOF/TOF MS，Clinprot技術）已被廣泛應用于尋找疾病分子標記物的研究，例如子宮內膜異位癥、乳腺癌、肝癌等，旨在從源頭尋找高效靈敏的分子標記物[6-8]。在本研究中，筆者以帕金森病患者和正常者血清為研究對象， 對其進行Clinprot技術分析， 初步篩選帕金森病發生發展相關的差異蛋白質。

對象與方法

一、研究對象

對2014年4月至2016年12月中山大學孫逸仙紀念醫院的帕金森病患者進行篩選，納入標準： ①符合2006年中華醫學會神經病學分會運動障礙及帕金森病學組所制訂的帕金森病診斷標準；②均行CT或MRI檢查，除有老年性腦改變外，未見其它特殊異常；③排除腫瘤、周圍神經炎以及腦部病變等原因所導致的帕金森綜合征。符合上述標準的患者51例為帕金森病組，其中男31例、女20例，年齡（61.5±5.0）歲，病程（4±2）年。另納入51例來源于中山大學孫逸仙紀念醫院體檢中心、經體檢明確無心腦血管及帕金森病的性別、年齡與帕金森病組相匹配的正常老年人為正常對照組。本研究經中山大學孫逸仙紀念醫院醫學倫理委員會批準，所有研究對象（或其家屬）均簽署知情同意書。

二、儀器及材料

Ultraflex Ⅲ TOF/TOF布魯克質譜儀、Clinprot軟件、AnchorChipTM質譜靶、磁珠分離器；磁珠試劑盒Profiling Kit 100 MB-WCX、標準品1 Peptide Calibration Standard、標準品2 Protein Calibration Standard I、基質a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，均購自布魯克道爾頓公司。

三、方法

采用Clinprot技術對2組受試者的血清樣本進行磁珠分離和質譜檢測，分組建立疾病模型，尋找差異蛋白峰。

1.血清樣本制備

于清晨空腹抽取所有受試者外肘靜脈血2 ml到無抗凝管內，室溫靜置2 h；當血液凝固后，離心300轉/分，小心將上清（即為血清）吸出，分裝，于-80℃儲存備用。

2.樣本磁珠處理

于4℃取出磁珠試劑盒復溫，完全混勻WCX免疫磁珠懸浮液，然后取出10 μl磁珠液，加入10 μl磁珠結合緩沖液（BS），混勻，再加入5 μl血清樣本，吹打5次混勻，于室溫靜置5 min。將樣品管放入磁珠分離器，使磁珠貼壁1 min，吸掉液體。

往樣品管加入洗脫液100 μl，磁珠分離器來回移動10次，靜止1 min，去除未結合的雜質。重復操作2次。

從磁珠分離器上取下樣品管，加入5 μl磁珠洗脫緩沖液（ES），混勻貼壁的磁珠，反復吸打10次，放置磁珠分離器2 min，磁珠與懸浮的液體充分分離后，將上清液移入干凈的1.5 ml離心管，加入 5 μl穩定緩沖液（SS），吸打混勻。

3.點樣上機

分別取2 μl磁珠洗脫液和2 μl標準品（肽段標準品∶蛋白標準品以1∶5比例混合）與10 μl肉桂酸基質溶液[濃度0.3 g/L，溶劑為2∶1的乙醇∶乙腈]，充分混勻。取上述混合液2 μl到直徑為600 μm的AnchorChipTM 600/384質譜靶上，室溫干燥。啟動質譜儀，校正儀器，放入質譜靶進行檢測。

4.質譜圖譜采集

采用質譜FlexControl 3.3軟件采集磁珠分選后的血清蛋白樣本的肽指紋圖譜：線性采集模式為LP-Clinprot，電壓為25 kV，用標準品校正系統，測量范圍為0～10 kDa，激光頻率為200 Hz，相對強度為40%～60%，使用軟件FlexAnalysis 3.3進行標峰，并進行基線和平滑處理，使數據校正和歸一化。

5.質譜圖統計學處理

把質譜圖譜用軟件ClinproTools 2.2分析，首先進行樣本分組（帕金森病組和正常對照組），接著利用GA基因遺傳算法，神經網絡算法SNN，快速分類算法QC分別建立疾病模型，并比較模型之間的敏感度和特異度。進一步對質譜數據進行t檢驗，計算出蛋白峰的組間差異程度，選擇滿足P≤0.05和差異倍數>2.0的峰作為有統計學意義的差異蛋白峰。

6.蛋白質的鑒定

利用LIFT軟件對差異蛋白峰進行二級串聯質譜（MS/MS）分析鑒定， 離子源加速電壓1為8.0 kV，加速電壓2為7.1 kV，LIFT1電壓為19 kV， LIFT2電壓為2.95 kV，頻率為200 Hz。使用Biotools軟件檢索獲得的圖譜，以Mascot為搜索引擎，數據庫為NCBInr、種屬為人，質量誤差范圍為0.5 Da。

蛋白質組學技術飛速發展，已被廣泛應用于帕金森病的病因學研究，包括雙向電泳、高效液相色譜-電噴霧三重四極桿質譜法、同位素相對標記與絕對定量技術、表面增強激光解吸電離飛行時間質譜技術等，揭示了SNCA、DJ-1、LRRK2等重要蛋白質與帕金森病發生的潛在關系。對于帕金森病患者血清、腦脊液的蛋白質組學研究，更有助于發現特異度和靈敏度高的生物學標志物，對帕金森病的早期診斷、治療及預防具有重要的臨床價值[10]。雙向電泳根據分子量和等電點分離蛋白質，具有可重復性好、結果直觀、實驗成本較低的特點，已成為蛋白質組學研究中最常用的分離技術。然而，該技術需憑借凝膠為載體，僅適用于研究高峰度表達和高分子量段多肽及蛋白，不適用于鑒定低豐度蛋白；對于小分子蛋白特別是分子量低于3 000 Da小肽段，高效液相色譜/固相色譜很難通過全蛋白組胰蛋白酶消化方式檢出；表面增強激光解吸電離飛行時間質譜技術診斷效率較高，但技術的重復性差，靈敏度欠佳[11-13]。

Clinprot技術是蛋白質組學技術的有效補充，其專門針對臨床體液。因為血清取材方便，從血清中發現相關標志物是目前診斷疾病的有效途徑，高豐度蛋白質如白蛋白和免疫球蛋白約占血清蛋白總量的80%～90%，但能反映機體狀況的血清蛋白質多屬于低豐度蛋白質，而這類蛋白質難于鑒定，這已經成為蛋白質組學發展的瓶頸。Clinprot技術針對這類問題應運而生，通過磁珠分離，直接去除樣品中的高豐度蛋白，同時富集低豐度蛋白，再結合多級質譜分析，直接鑒定差異蛋白。其優勢為：①高靈敏度、高分辨率，1滴血（10～50 μl）即可檢測低至1 fmol的蛋白；②操作簡單，重復性好，高通量的特性[14]。

睪丸表達序列13B蛋白的功能尚未明確，通常被認為與編碼精原細胞表達相關[15]。此蛋白在帕金森病患者血清中的表達升高，推斷可能與帕金森病好發于男性有關。核糖核酸酶7具有強大的RNA酶活性，具有廣譜的抗微生物活性[16]。帕金森病本身是一類神經免疫性疾病，表現為小膠質細胞大量激活損傷多巴胺神經元，核糖核酸酶7在帕金森病患者血清中的表達升高，可能起抗炎保護作用[17]。核苷二磷酸激酶6的功能在于從三磷酸核苷轉變為二磷酸核苷時轉移磷酸基團，產生ATP，帕金森病也是線粒體病，核苷二磷酸激酶6下調會導致ATP產生障礙，進而損傷呼吸鏈，這提示核苷二磷酸激酶6與帕金森病的發病密切相關[18]。THAP結構域蛋白3是THAP1/THAP3-HCFC1-OGT complex的成分之一，參與調控核糖核酸氧化還原酶M1亞基的轉錄活性。核糖核酸氧化還原酶M1在調節DNA合成中起重要作用，該蛋白表達下調可能與酪氨酸羥化酶的轉錄水平降低有關，從而導致多巴胺神經元選擇性死亡[19]。氨轉運蛋白Rh型C蛋白屬于氨轉運相關蛋白，近年來帕金森病也被認為是一類代謝性疾病，與錳、鐵代謝失衡相關，推測可能與氨轉運代謝相關，以上推測有待進一步研究證實[20-22]。

至今，國內外均未有以上5個蛋白與帕金森病相關的文獻報道，我們下一步擬擴大樣本量，進一步證實本研究結論的可靠性，同時利用ELISA、免疫熒光原位等技術繼續探討這些蛋白與帕金森病之間的關系，為帕金森病的臨床診療提供有效依據。

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（收稿日期：2017-09-01）

（本文編輯：洪悅民）