‘云香’水仙NAC基因克隆及表達分析

李夢思 趙瀟俐 吳用 李歡 李科 陳曉靜

摘 要 從‘云香水仙轉錄組文庫中篩選出1條NAC基因序列，采用PCR技術克隆得到其cDNA序列。序列分析表明，該NAC基因包含822 bp的開放閱讀框，編碼273個氨基酸，分子量30 903.9 u，命名為NtNAC3153（GenBank登錄號：KU375569）。理化性質分析和多重序列比對顯示，NtNAC3153蛋白是一個無跨膜區域的親水性蛋白，在N端具有一段保守結構域。系統進化樹分析表明，NtNAC3153與同為單子葉植物的小果野芭蕉MaNAC、二穗短柄草BdNAC和小米SiNAC親緣關系最近。實時熒光定量PCR分析顯示，NtNAC3153基因能夠被ABA、鹽脅迫和高溫誘導表達。研究表明：NtNAC3153可能參與‘云香水仙的抗逆調控機制。

關鍵詞 ‘云香水仙；NAC轉錄因子；基因克隆；序列分析；非生物脅迫

中圖分類號：S682.21 文獻標識碼 A

Abstract A sequence of one NAC gene from‘Yunxiangtranscriptome library was cloned using PCR technology. Sequence analysis indicates that the cDNA of NAC， named NtNAC3153（GenBank accession number： KU375569）， contained an open reading frame of length 822 bp（encoding 273 amino acids， molecular weight： 30.903 9 ku）. Physiochemical properties analysis and multiple sequence alignment showed that NtNAC3153 protein was a hydrophilic protein which was free of trans-membrane region and had a conserved N-terminal domain. Phylogenetic analysis indicated that the NtNAC3153 had the closest relationship with Musa acuminata MaNAC， Brachypodium distachyon BdNAC and Setaria italica SiNAC. Real-time PCR analysis showed that the expression of NtNAC3153 gene could be induced by ABA， salt stress and high temperatures. NtNAC3153 may be involved in the regulation of resistance mechanisms of‘Yunxiang.

Key words ‘Yunxiang； NAC transcription factor； cloning； sequence analysis； abiotic stress

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.020

NAC轉錄因子是植物所特有的最大的轉錄因子家族之一[1]，在陸生植物中分布廣泛。NAC家族的命名起源于矮牽牛（Petunia hybrida）NAM、擬南芥（Arabidoposis thaliana）ATAF1、ATAF2和CUC2基因[2-3]。目前，已在擬南芥、水稻、大麥、小麥、玉米和大豆等多種植物中分離得到NAC家族基因[4-8]。NAC轉錄因子主要在高等植物生長發育和脅迫應答中發揮作用，參與調控相關結構基因的表達[9-10]。近年來，大量關于NAC基因參與脅迫應答的研究相繼被報道[11-14]，Yu Xingwang等[11]將鷹嘴豆CarNAC4基因轉入擬南芥中進行研究，發現CarNAC4轉錄因子增強了擬南芥的抗旱性和抗鹽性；Liu Guanze等[12]將水稻SNAC1基因轉入棉花中進行研究，發現過量表達水稻SNAC1基因能夠增加根系生長和降低蒸騰速率，從而增強了轉基因棉花的抗旱性和抗鹽性；Xu Zhongyang等[14]將小麥TaNAC29基因轉入擬南芥中，發現TaNAC29通過增強抗氧化系統和參與調控非生物脅迫相關信號途徑來減少H2O2的積累和對細胞膜的傷害，從而增加了轉基因擬南芥的抗鹽性。由此可見，NAC轉錄因子在植物的脅迫應答反應中起著十分重要的作用，但目前為止，對其分子機制的研究報道主要集中在模式植物和糧食作物上，因此進一步開展NAC轉錄因子在園藝作物中的研究具有非常重要的意義。

‘云香水仙（Narcissus tazetta var. chinesis‘Yunxiang）是福建農林大學園藝植物遺傳育種研究所培育出的一個具有自主知識產權的水仙新品種[15]，與傳統中國水仙相比，植株大而健壯，鱗球較大且緊實，花期長，花香濃郁，抗病性強，在市場競爭中具有很大的優勢。本研究從‘云香水仙不同開花時期花瓣轉錄組文庫中篩選出一個差異表達的NAC基因，在NCBI上進行Blast比對，初步推測其可能與抗性相關，進而對其進行克隆、生物信息學分析和抗性表達分析，研究該基因與‘云香水仙抗逆機制的關系，為該基因功能的后續研究奠定基礎，為水仙抗性新品種的培育提供分子輔助育種資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗使用的‘云香水仙為大小一致，無病蟲害的一年生子球，由福建農林大學園藝植物遺傳育種研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和反轉錄 使用多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒（百泰克公司）提取‘云香水仙的總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA條帶的清晰度、完整性，將質量完好的RNA置于

-80 ℃冰箱中儲存備用。用Fermenta Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉錄，所得cDNA用于克隆目的基因；用TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time）進行逆轉錄，所得cDNA用于熒光定量分析。具體步驟，見試劑盒說明書。

1.2.2 云香水仙NAC基因的克隆 用DNAMAN對基因序列進行分析，根據其ORF兩端序列設計出1對特異性引物。以‘云香水仙的cDNA為模版，以NAC3153-F和NAC3153-R（表1）分別為上、下游引物進行PCR擴增，克隆NtNAC3153基因ORF。反應采用25 μL體系：Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，Ex Taq酶0.2 μL，ddH2O 18.3 μL。反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，48.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環30次；72 ℃延伸5 min。4 ℃恒溫保存。將PCR產物進行凝膠電泳后回收目的片段DNA，連接至pMD18-T載體（TaKaRa）后轉化大腸桿菌DH5α，菌液PCR鑒定后送陽性克隆菌液至博尚測序。

1.2.3 NAC3153基因生物信息學分析 使用DNAMAN軟件對基因ORF及編碼氨基酸序列進行預測；用在線軟件ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam）對氨基酸理化性質進行分析；使用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對氨基酸序列進行跨膜預測；利用SOPMA分析蛋白的二級結構，通過Swiss-model（http：//swissmodel，expasy.org/）在線預測蛋白的三級結構。用NCBI中的Blastp程序來檢索NtNAC3153的同源蛋白，用DNAMAN進行氨基酸序列的多重比對，在MEGA5.05中用鄰近相法進行系統進化樹的構建。

1.2.4 ‘云香水仙NAC3153基因的脅迫表達分析

將‘云香水仙子球消毒處理后水培，待長出新葉達到3～4 cm后，用100 μmol/L ABA、250 mmol/L NaCl分別浸泡鱗球1、3、6、12、24和48 h，將水培的鱗球置于50 ℃高溫，處理同樣的時間，用清水處理的水培水仙作為對照。提取清水處理的和ABA、NaCl與高溫處理1、3、6、12、24和48 h后的‘云香水仙葉片RNA，逆轉錄為cDNA模版，將其稀釋10倍后作為初始模板，以中國水仙actin（genebank accession： JN204912.1）為內參基因，NAC3153-Q-F和NAC3153-Q-R為上下游引物檢測NtNAC3153基因的表達水平（表1）。qRT-PCR使用25 μL體系：SYBR Premix ExTaqTM（2×）12.5 μL，cDNA 2 μL，Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μL，Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μL，ddH2O 9.5 μL。每種處理做3個生物學重復，qPCR時重復3次。qRT- PCR反應程序為：1.94 ℃ 3 min；2.94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40個循環；溶解曲線。采用2-△△Ct法進行目的基因的相對表達量分析。

2 結果與分析

2.1 ‘云香水仙NAC基因cDNA克隆

以‘云香水仙RNA 反轉錄成的cDNA為模板，PCR擴增得到1條1 000 bp左右的條帶（圖1）。測序結果得到1條為984 bp的cDNA片段，命名為NtNAC3153。結合NCBI上Blast比對，用DNAMAN進行序列分析表明，NtNAC3153包含長度為822 bp的ORF，編碼蛋白由273個氨基酸組成（圖2）。

2.2 ‘云香水仙NAC基因的生物信息學分析

理化性質分析表明，NtNAC3153編碼蛋白的分子式為C1 363H20 91N373O414S18，分子量為30 903.9 u，等電點為6.09，屬于穩定蛋白；NtNAC3153蛋白是親水性蛋白，其親水性氨基酸多于疏水性氨基酸；NtNAC3153蛋白沒有明顯的跨膜結構域，可能不是膜蛋白。

二級結構預測結果顯示，NtNAC3153編碼蛋白的氨基酸序列中有59處α-螺旋（Alpha helix），占二級結構的21.53%；55處延伸鏈（Extended strand），占二級結構的20.07%；25處β-轉角（Beta turn），占二級結構的9.12%；135處無規卷曲（Random coil），占二級結構的49.27%（圖3-A）。無規則卷曲所占比例最高，推測其作用主要為連接其他二級結構原件。

用Swiss-model分析NtNAC3153蛋白的三級結構（圖3-B），結果顯示，NtNAC3153蛋白與水稻抗性相關NAC1蛋白的三級結構相似性為51.88%。

將NtNAC3153蛋白的氨基酸序列與其他9個物種的NAC蛋白氨基酸序列進行同源性比對，這9個NAC蛋白分別為：大豆GmNAC（Glycine max，XP_003554001.1）、葡萄VvNAC（Vitis vinifera，XP_

002277068.1V）、木本棉GaNAC（Gossypium arboreum，KHG13515.1）、朝鮮薊CcNAC（Cynara cardunculus var. scolymus， KVI00075.1）、無油樟AtNAC（Amborella trichopoda，XP_006827310.1）、小果野芭蕉MaNAC（Musa acuminata subsp. malaccensis，XP_009420240.1）、荷花NnNAC（Nelumbo nucifera，XP_010276452.1）、油棕EgNAC（Elaeis guineensis，XP_010938118.1）和綠豆VrNA（Vigna radiata var. radiata，XP_014491001.1）。經DNAMAN比對，結果顯示（圖4），所有10個NAC轉錄因子都在N端有一段保守的氨基酸序列，包括約150個氨基酸，含有A、B、C、D、E 5個亞結構域，與前人研究結果相一致，由此斷定NtNAC3153為NAC蛋白。

2.3 NtNAC3153蛋白的系統進化樹分析

為了研究NtNAC3153蛋白的進化關系，使用MEGA5.05軟件將NtNAC3153和與其同源的其他植物NAC轉錄因子構建了系統進化樹（圖5）。結果表明，NtNAC3153與同為單子葉植物的小果野芭蕉MaNAC（芭蕉科）、二穗短柄草BdNAC（禾本科）和小米SiNAC（禾本科）親緣關系最近。

2.4 NtNAC3153基因的脅迫表達分析

熒光定量實驗結果表明，ABA、鹽脅迫和高溫，均可明顯誘導NtNAC3153基因的表達。其中，ABA處理后，NtNAC3153基因的表達明顯上升，在24 h達到最大值，而后下降；250 mmol/L NaCl處理強烈誘導了NtNAC3153基因的表達，但卻出現3 h和24 h兩個峰值，呈現出先上升，后下降，再上升，而后又下降的趨勢；高溫處理后，NtNAC3153基因的表達迅速上升，在3 h即達到最高水平，而后逐漸下降（圖6）。

將3種處理后達到最高峰值的時間進行比較，NaCl處理和高溫處理后，NtNAC3153基因的表達迅速上升，在3 h即達到最高峰值，而ABA處理后，NtNAC3153基因的表達是逐漸上升，在24 h才達到最高峰。

由此可見，ABA、鹽脅迫和高溫誘導了NtNAC3153基因的表達，而且隨處理時間的延長，趨勢明顯。由此推斷，NtNAC3153基因可能參與了‘云香水仙的抗逆調控機制。

3 討論

本研究克隆得到了‘云香水仙NtNAC3153基因，其編碼蛋白在N端有一段保守的氨基酸序列，與其他物種NAC轉錄因子相同，而C端結構則與其他物種差異很大，高度變異，與前人研究結果一致[16]。已有研究報道表明，NAC轉錄因子的N端保守氨基酸序列可以被分為A、B、C、D 和E 5個亞結構域[17]，可能參與調控DNA與其他蛋白的結合[18]，而C端是高度變異的，這與不同類型NAC轉錄因子的不同功能相關。

植物NAC家族成員在響應非生物脅迫的進程中起重要作用，研究NAC轉錄因子參與植物脅迫反應的機制具有重要的意義。目前，多種植物的NAC基因已經被克隆出來，不同植物NAC基因在逆境脅迫下的表達模式存在差異。小麥中，TaNAC29參與了NaCl、PEG和ABA脅迫的應答反應[14]。胡楊PeNAC1基因能被干旱和高鹽脅迫誘導表達，而ABA脅迫處理下相應較弱，超表達PeNAC1基因提高了轉基因擬南芥的抗鹽能力[19]。甘菊中DlNAC1基因可以被低溫、高鹽和干旱脅迫分別誘導，對ABA和高溫脅迫不敏感[20]。過表達水稻SNAC1基因，增加了棉花的抗旱性和抗鹽性[12]。本研究中，‘云香水仙NtNAC3153基因，能夠被ABA、NaCl和高溫3種非生物處理分別誘導表達，且趨勢明顯。在ABA、NaCl和高溫處理下，NtNAC3153基因的表達量都是先上升，后下降，在最高處，表達量分別為對照的18倍、24倍和16倍，與小麥TaNAC29基因[14]在ABA處理下和NaCl處理下的表達情況相似。不同的是，在NaCl處理下，NtNAC3153基因的表達在3 h即達到最高峰，而小麥TaNAC29基因在NaCl處理下表達則在12 h才達到最高峰。高溫處理時，NtNAC3153基因的表達也是在3 h即達到高峰。由此，可以推測，NtNAC3153基因是‘云香水仙逆境脅迫應答基因，并且在非生物脅迫處理下有特異的表達模式，但其在參與逆境脅迫中的作用尚不清楚，有待進一步的研究。

轉錄因子可能同時參與多個基因的表達調控，因而僅通過調控1個轉錄因子，就可能調控多個相關功能的基因發揮作用，達到改良植物性狀的目的[16]。目前，筆者通過對‘云香水仙NAC轉錄因子基因進行了克隆，研究分析了其在幾種脅迫下的表達情況，初步了解了其在‘云香水仙遭受脅迫后的應答，對其調控抗性表達提供了直接依據，為進一步通過轉基因技術對其進行功能驗證打下了基礎，為日后培育水仙抗性新品種提供了基因資源。

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