香蕉枯萎病菌4號生理小種cat1基因敲除與表型分析

王小琳 李春強 楊景豪 李文彬 孫建波 彭明

摘 要 前期蛋白質組學研究發現尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種（Foc4）中的過氧化氫酶1（cat1）基因受到巴西蕉誘導上調表達，為研究cat1基因在Foc4侵染香蕉過程中的作用，利用同源重組方法敲除Foc4的cat1基因，并對獲得的敲除突變體開展表型分析和致病性測定。結果表明：cat1基因缺失對Foc4的菌絲、孢子形態、菌落生長、抗滲透壓脅迫和細胞壁選擇性壓力等沒有影響；但引起菌株抵抗外源氧脅迫、細胞壁穿透能力、纖維素利用能力減弱和對巴西蕉的致病性減弱。顯示cat1基因的產物通過清除香蕉分泌的活性氧在Foc4對香蕉的致病過程中起作用，并參與病原菌對寄主纖維素成分的代謝。此結果為進一步深入研究香蕉枯萎病菌的致病機理奠定基礎。

關鍵詞 巴西蕉；尖孢鐮刀菌古巴?；?；cat1基因；基因敲除；致病性

中圖分類號 S436.681 文獻標識碼 A

Abstract It was found that the cat1 gene in Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4（Foc4）was up-regulated induced by Musa sp. AAA. cv. Baxi in our previous proteomics analysis. In order to investigate the function of cat1 during the host infection process of Foc4， the cat1 gene in Foc4 was deleted by the homologous recombination method. The phenotype and pathogenicity of the cat1 knockout mutants were then analyzed. The results indicated that there were no apparent difference between the mutants and the wild type strain on mycelium and spores morphology， colonial growth， osmotic stress resistance and cell wall selective pressure. However， the mutants showed significant decrease in the abilities of exogenous oxygen stress resistance， penetrability of cell wall， cellulose utilization， and the pathogenicity to Musa spp. AAA. cv. Baxi. These results suggested that the cat1 gene in Foc4 should be involved in pathogenesis by scavenging host-derived ROS， and participated in the process of host cellulose degradation.

Key words Musa spp. AAA. cv. Baxi； Fusarium oxysporum f. sp. cubense； cat1 gene； knockout； pathogenicity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.023

香蕉屬于芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa），是全球最大的草本開花植物。香蕉作為著名的熱帶和亞熱帶水果，其進出口貿易量和年交易量占各類水果之首，交易金額也達到了世界第二[1]。由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f. sp. cubense， Foc）引起的香蕉枯萎病是制約香蕉生產的重要原因之一。尖孢鐮刀菌屬半知菌類（Fungiimperfecti）梗孢目（Moniliales）痤孢科（Tubercular）鐮刀菌屬（Fusarium）。尖孢鐮刀菌通過侵染寄主植物維管束系統，破壞植物的輸導組織，并能夠在生長發育代謝過程中產生毒素危害作物，造成植物枯萎繼而死亡，影響產量。香蕉枯萎病是一種土傳病害，目前還沒有一種防治效果理想的化學藥劑，且化學防治存在田間藥劑流失嚴重、危害環境和人類的健康等問題，因此，培育抗病品種成為十分迫切的替代策略[2]。探討尖孢鐮刀菌的致病相關基因的功能，可深入了解尖孢鐮刀菌的致病機理，有利于抗病育種研究。

近年來，雖然關于香蕉枯萎病菌致病相關基因的研究已經取得了一定的進展[3-5]，但離詳細闡明枯萎病菌的致病機理還有一定的距離。本研究室通過蛋白組學的研究發現Foc4中過氧化物酶系統中的過氧化氫酶1（catalase1，cat1）受到巴西蕉誘導后蛋白表達量上調了2.4倍，而Foc1中卻無明顯變化（未發表），提示cat1可能在Foc4的致病過程中起作用。眾所周知，病原真菌中存在的抗氧化系統對其成功感染宿主起重要作用。人體病原真菌能夠成功侵染寄主的前提是它們能夠抵抗在侵染過程中寄主效應細胞產生的活性氧，而過氧化氫酶在植物和某些人類病原菌的致病機理中起著重要作用，包括空腸彎曲菌[6]、結核桿菌[7]、根癌土壤桿菌[8]等。但cat1基因在尖孢鐮刀菌古巴?；椭械墓δ苌形匆妶蟮?。為了闡明Foc4中的cat1基因是否在病原菌的致病過程中發揮作用，筆者利用DNA同源重組的方法對Foc4的cat1基因進行敲除，并對敲除突變體的致病性和表型進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f.sp. cubense）4號生理小種B2菌株，由黃俊生研究員惠贈，分離自海南島并進行了基因組測序。pCT74質粒由本研究室保存（福建省農科院惠贈）。巴西蕉（Musa spp. AAA. cv. Baxi）由中國熱帶農業科學院組織培養中心提供。試驗用到的培養基或試劑有：PDA、PDB培養基和纖維素剛果紅培養基（購自海博生物）；再生培養基、STC溶液和PTC溶液按黃東杰等[9]的方法進行配制；Driselase崩潰酶（20 mg/mL，Sigma），Lysing Enzyme溶壁酶（20 mg/mL，購自廣東省微生物研究所）；V8培養基（V8果汁200 g/L，CaCO3 3.0 g/L，瓊脂20 g/L，pH值5.8）。

1.2 方法

1.2.1 真菌基因組DNA的提取 將野生型B2菌株接種于PDB培養基中，200 r/min、28 ℃搖床振蕩培養5 d，過濾收集菌絲體，之后用CTAB法[10]提取基因組DNA。

1.2.2 cat1基因敲除載體的構建 根據野生型基因組DNA測序序列，分別在cat1基因的上下游截取800～1 500 bp左右的DNA序列，記為同源臂A和同源臂B，并設計引物，記為cat1-AF和cat1-AR、cat1-BF和cat1-BR（表1）。用這2對特異引物以野生型基因組DNA為模版進行PCR擴增，獲得cat1基因開放閱讀框上游5′端的同源臂A和下游3′端的同源臂B的DNA。PCR擴增采用2×Taq PCR master Mix試劑（TIANGEN），PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，31個循環；最后72 ℃延伸補齊7 min。經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后回收PCR產物。

將回收DNA用pLB零背景快速克隆試劑盒連接至pLB載體，構建pLB-A和pLB-B克隆載體；用限制性內切酶KpnⅠ和ApaⅠ將pLB-A克隆載體進行酶切，之后連接于經相同限制性內切酶線性化的pCT74載體（包含潮霉素抗性基因hph和GFP基因表達盒）中，構建pCT74-A克隆載體；用限制性內切酶EcoRⅠ和SpeⅠ將pLB-B克隆載體進行酶切，之后連接于經相同限制性內切酶線性化的pCT74-A克隆載體中，構建cat1基因敲除載體，即A-pCT74-B敲除載體；以A-pCT74-B敲除載體為模版，用同源臂A的前引物cat1-AF和同源臂B的后引物cat1-BR進行PCR擴增，獲得用于轉化的線性DNA片段，即A+hph+gfp+B。PCR擴增采用PrimeSTAR Max Premix（2×）試劑（TaKaRa），PCR反應條件為：98 ℃變性10 s；55 ℃退火5 s；72 ℃延伸30 s，35個循環。最后回收純化備用。

1.2.3 尖孢鐮刀菌原生質體制備和DNA轉化 參照黃東杰等[9]和李春強等[11]的方法進行，連續培養4代獲得穩定轉化子。

1.2.4 cat1基因敲除突變體的鑒定 用CTAB[10]法提取轉化子基因組DNA，以轉化子和野生型菌株的基因組DNA為模板，根據基因組序列設計特異引物，對轉化子進行PCR擴增檢測。引物H1和H2檢測hph+GFP片段是否整合到基因組中；引物F1和F2檢測轉化子是否在目的基因上游5′端發生同源重組；引物F3和F4檢測轉化子是否在目的基因下游3′端發生同源重組；引物cat1-F和cat1-R檢測轉化子是否敲除掉目的基因。預計的擴增片段分別約490、2 000、2 100、600 bp。如果引物H1和H2、F1和F2、F3和F4的PCR擴增結果均為陽性，且引物cat1-F和cat1-R的PCR擴增結果為陰性，就可確定該轉化子為cat1基因敲除突變體。PCR擴增采用2×Taq PCR master Mix試劑（TIANGEN），PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，31個循環；最后72 ℃延伸補齊7 min。

1.2.5 突變體表型觀察

（1）菌落形態觀察：在敲除突變體和野生菌的培養皿上打取Φ=5 mm的菌餅，分別接種于PDA和V8培養基上，每個菌株接種3個重復，28 ℃培養6 d后拍照記錄。

（2）玻璃紙穿透實驗：分別從敲除突變體和野生型的菌落上打取菌餅倒貼至PDA平板中央，將半徑為4 cm的半圓形玻璃紙滅菌后貼在培養基上，并使其覆蓋住3/4的菌塊，3個重復，28 ℃倒置培養5 d后拍照記錄。

（3）纖維素利用實驗：打取Φ=5 mm的敲除突變體和野生菌的菌餅分別接種于纖維素剛果紅培養基中，3個重復，28 ℃培養7 d后觀察菌落形態，并拍照記錄。

（4）過氧化氫耐受性實驗：打取Φ=5 mm的敲除突變體和野生菌的菌餅，分別接種于含有不用濃度H2O2的PDA（0.1%、0.25%、0.5%）平板上，每個梯度做3個重復，28 ℃培養5 d后觀察菌圈大小，并拍照記錄。

（5）滲透壓脅迫實驗：打取Φ=5 mm的敲除突變體和野生菌的菌餅分別接種于不同濃度NaCl（1、2 mol/L）的PDA平板上，每個梯度做3個重復，28 ℃培養5 d后觀察菌落形態，并拍照記錄。

（6）細胞壁選擇性壓力實驗：打取Φ=5 mm的敲除突變體和野生菌的菌餅分別接種于不同濃度山梨醇（1、2 mol/L）的PDA平板上，每個梯度做3個重復，28 ℃培養5 d后觀察菌落形態，并拍照記錄。

1.2.6 致病性測定

（1）離體葉片實驗：將巴西蕉葉片用75%酒精消毒，并用無菌水沖洗晾干后，再用滅菌針在葉片正面葉脈上刺出傷口，分別打取Φ=5 mm的敲除突變體和野生菌的菌餅，接種在傷口處，使用蘸有無菌水的滅菌棉片覆蓋在接種的傷口上保濕，3個重復，確保每個重復使用同一片葉片。28 ℃培養5 d后觀察菌落形態，并拍照記錄。

（2）香蕉苗致病性實驗：選取長勢良好苗期相同的巴西蕉（株高約10 cm，有5～6片葉子），用滅菌針頭對香蕉苗的健康白色的根進行刮傷處理，分別打取Φ=5 mm的敲除突變體和野生菌的菌餅，接種在傷口處，同時接種PDA作為對照，并用保鮮膜固定。每株苗刮傷2～4個傷口，每個菌種接種10株巴西蕉。實驗重復3次。根據天氣和土壤條件適當澆水。45 d后將球莖切開觀察拍照，并記錄每株幼苗發病級數[12]。

1.3 數據處理

香蕉幼苗發病情況用病情指數表示：病情指數=[∑（發病級數×該級株樹）]/（最高級數×總株樹）×100。同時計算香蕉苗的發病率，公式如下：發病率=（發病株樹/實驗測試總株數）×100%[12]。所得數據采用GraphPad Prism 6.02進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 cat1基因敲除載體的構建

從圖1-A可看出，用限制性內切酶KpnⅠ和ApaⅠ對pCT74-A克隆載體進行酶切，可切下約900 bp的DNA條帶，即同源臂A；用EcoRⅠ和SpeⅠ對A-pCT74-B敲除載體進行酶切，可切下1 500 bp的DNA條帶，即同源臂B。以A-pCT74-B敲除載體為模版，用引物cat1-AF和cat1-BR進行PCR擴增，擴增出一條5 000 bp左右的DNA條帶（圖1-B），與預計的條帶大小相符，且測序結果表明克隆的DNA序列正確。上述結果表明cat1基因敲除載體構建成功。

2.2 cat1敲除突變體的PCR鑒定

轉化共獲得10個轉化子，并在含有潮霉素抗性的PDA平板上再生培養后，隨機選取其中6個轉化子進行PCR擴增鑒定。以其基因組DNA為模板，分別用4對引物（H1和H2、F1和F2、F3和F4、cat1-F和cat1-R）進行PCR擴增鑒定（圖2-A）。用H1和H2引物對進行PCR擴增，結果顯示6個轉化子和pCT74對照均能擴增出一條約490 bp的目的條帶，野生型基因組DNA和清水對照均無條帶（圖2-B）。用cat1-F和cat1-R引物對進行PCR擴增，2號和4號轉化子及清水對照均未擴增出條帶，其他的轉化子和野生型基因組DNA均能擴出一條600 bp左右的DNA條帶（圖2-C）。用F1和F2引物對進行PCR擴增，2～6號轉化子均能擴增出一條2 000 bp左右的DNA條帶，1號轉化子、野生型基因組DNA和清水對照均無條帶；用F3和F4引物對進行PCR擴增，1～6號轉化子均能擴增出一條2 100 bp左右的DNA條帶，野生型和清水對照均無條帶（圖2-D）。綜上所述，可確定2號和4號轉化子均為cat1基因敲除突變體。

2.3 cat1敲除突變體的表型觀察

選取2號轉化子作為cat1基因敲除突變體（即敲除子Δcat1）進行表型觀察。

2.3.1 菌落形態觀察 在激光共聚焦顯微鏡480 nm激發光下，Δcat1的孢子和菌絲均能夠發出強而穩定的綠色熒光（圖3-A），說明GFP蛋白在細胞中呈現組成型表達。對Δcat1在PDA平板上的生長觀察發現，與野生型相比，Δcat1的長勢稍慢一些，但并無明顯差異；在V8培養基上，Δcat1和野生型長勢相同；兩者在PDA培養基上的菌落均以平鋪為主，而在V8培養基上菌絲則呈現簇立狀（圖3-B）。

2.3.2 玻璃紙穿透實驗 用玻璃紙可替代植物細胞壁來評測病原菌的穿透能力。野生型菌株可透過玻璃紙正常生長，而Δcat1則幾乎不能透過玻璃紙生長（圖3-C）。說明cat1基因的敲除能夠大大減弱野生型菌株的穿透能力。

2.3.3 纖維素利用實驗 在纖維素剛果紅培養基上，Δcat1的菌絲相對于野生型明顯薄很多（圖3-D）。Δcat1利用纖維素的能力明顯降低，顯示cat1基因可能在Foc4纖維素利用的相關途徑中起作用。

2.3.4 過氧化氫耐受性實驗 在0.1% H2O2的PDA平板上，Δcat1和野生型菌株的形態和大小均無明顯差異；在0.25% H2O2的濃度下，Δcat1開始表現出與野生型菌株的差異，菌落大小明顯小于野生型菌株；而在0.5% H2O2濃度下，Δcat1幾乎不能生長，而野生型菌株卻還能生長（圖3-E）。Δcat1對H2O2敏感性的增加，說明cat1基因對Foc4野生型菌株對抗外源氧化脅迫非常重要。

2.3.5 滲透壓脅迫實驗 在1 mol/L和2 mol/L NaCl的PDA平板上，Δcat1和野生型均表現出一致的長勢。兩者均在2 mol/L NaCl的濃度下生長受到明顯的抑制（圖3-F）。

2.3.6 細胞壁選擇性壓力實驗 在含有不同濃度山梨醇的PDA平板上生長5 d后，Δcat1和野生型的菌落均沒有明顯的差別（圖3-G）。

2.4 cat1敲除突變體的致病性測定

2.4.1 離體葉片實驗 在香蕉的離體葉片正面葉脈接種5 d后，野生型在離體葉片上能形成較大面積的褐色病斑，且葉片背面有較多菌絲定殖；而Δcat1形成的病斑明顯小許多，且背面只有少數菌絲定殖（圖4-A）。這說明Δcat1的定殖能力大大減弱。

2.4.2 香蕉苗致病性實驗 利用巴西蕉盆栽苗對Δcat1進行致病性測定。接種培養45 d后觀察，結果發現接種野生型菌株的巴西蕉苗葉片表現出嚴重黃化枯萎現象，植株的葉片大面積黃化，且切開球莖觀察到球莖部位褐化程度嚴重，發病癥狀達到了4～5級；而接種Δcat1菌株的巴西蕉苗葉片則表現出輕微的黃化現象，葉片頂部及邊緣出現黃化現象，切開球莖觀察，發現球莖有黃線，發病癥狀約在2～3級；接種PDA的對照巴西蕉苗均沒有出現葉片黃化現象，且球莖發病癥狀為0級，無癥狀（圖4-B、圖4-C）。根據病情指數和發病率數據統計，接種Δcat1菌株的巴西蕉植株平均病情指數（37.4）和發病率（53.3%）低于野生型菌株的平均病情指數（62.9）和發病率（80%）（圖5）。這表明cat1缺失突變體對巴西蕉的致病性減弱。

3 討論

活性氧迸發是植物對病原菌的入侵產生的最明顯的早期防御反應之一[13]。 當病原真菌入侵植物寄主時，植物會通過有氧呼吸和代謝等產生大量的活性氧，對病原真菌造成氧化脅迫。而病原真菌存在一至幾種抗氧化系統，可逃避來自寄主細胞的活性氧簇的殺害。在真菌中，過氧化氫酶被認為是植物和病原菌互作過程中幫助病原菌消除寄主分泌的活性氧物質的重要成分[14]。

多數植物病原真菌含有一至數個過氧化氫酶[15]。新生隱球菌（Cryptococcus neoformans）的4個過氧化氫酶（Cat1、Cat2、Cat3、Cat4）在對抗內外源性的氧化脅迫時，能有相互功能性地重疊和互補[16]。煙曲霉中cat1基因編碼的Cat1P過氧化氫酶參與體外過氧化氫的消除，且能與其他的cat基因一起作用，短暫地保護真菌免受寄主的防御反應活性氧迸發的傷害[17]。粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）中的cat1主要存在孢子中，相比其他的過氧化氫酶更耐高溫，且具有良好的鹽堿穩定性，還可通過調節細胞內的氧濃度而使細胞抗氧化[18]。有報道稻瘟病菌catB突變株對大麥的致病力嚴重減弱，且對H2O2非常敏感，結果還發現catB在增強真菌細胞壁方面扮演著重要的角色，對真菌能夠強有力地入侵寄主起到很大的作用[19]。

在Foc4中，齊興柱等[20]研究發現catA和catC在H2O2誘導下上調表達。但catP2基因缺失突變體對外源氧化脅迫不敏感[21]。本研究結果發現，Foc4中的cat1基因敲除突變體玻璃紙穿透能力下降，對H2O2的敏感性增加，且在香蕉葉片的定殖能力大大減弱，對巴西蕉的致病性明顯減弱，推測cat1能夠透過消除寄主分泌的活性氧物質來參與病原菌對外源氧脅迫的反應，從而參與Foc4的致病過程。這與Foatf1基因的功能相似[3]，他們之間可能存在某些聯系。但cat1與其他幾個cat之間的關系及其調控機制及其在病原菌致病性中的具體機理還有待進一步研究。

同時，本研究結果還發現Δcat1對纖維素的利用能力明顯降低。過氧化氫酶能夠通過共價修飾綁定到纖維素[22]，但具體如何影響菌株對纖維素的利用，或者是cat1在Foc4的纖維素利用調控途徑中起著某種作用，還需進一步研究。

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