白芨種子萌發及其原球莖高效增殖體系建立

劉敏　舒雨婷　張玉瓊　郭暢　徐國力　高俊山

摘要：【目的】篩選白芨原球莖誘導和增殖的最適培養基，建立白芨原球莖高效增殖體系，為白芨種苗工廠化組培生產提供技術支持。【方法】以白芨種子為外植體，篩選適宜其無菌萌發的滅菌方法；以MS或1/2MS為基本培養基，添加不同濃度的植物生長物質和附加物，通過單因素試驗，確定最佳光照和溫度條件，篩選最適合其原球莖誘導的培養基；通過正交試驗，篩選最適合其增殖的培養基。【結果】采用75%乙醇處理白芨蒴果10 min，無菌萌發率達90.0%，且種子萌發不受影響。在原球莖誘導過程中，30.0μmol/m²·s光照強度和25℃溫度環境有利于原球莖誘導；最適合原球莖誘導的培養基為1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。在原球莖增殖過程中，添加土豆泥、椰子汁、香蕉泥等附加物對原球莖增殖有益，其中添加50.0g/L土豆泥的增殖效果最佳。正交試驗結果表明，原球莖增殖的最佳培養基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+50.0 g/L土豆泥，增殖倍數達5.270。【結論】建立的白芨原球莖高效增殖體系可在白芨種苗工廠化組培生產中推廣應用。

關鍵詞：白芨；種子萌發；原球莖誘導；增殖體系

中圖分類號：S567.23 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）12-2223-05

0引言

【研究意義】白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]亦稱甘根、良姜等，是蘭科（Orchidaceae）白芨屬（Bletilla）多年生草本植物，喜潮濕，原產于我國長江流域（中國植物志編輯委員會，2004），安徽省是白芨主產大省。白芨為傳統中藥，性微寒，味苦澀，可用于止血斂瘡、消腫生肌（李雨晴等，2015），《中華人民共和國藥典》（中國藥典委員會，1995）亦有收載，可用于治療各種出血、疼痛及皸裂等。此外，白芨花大而艷麗，株形優雅，可作為性狀極佳的地被植物和景觀植物，其根狀莖中的白芨膠可應用于化妝品。由于白芨種子萌發率低、自然增殖緩慢，限制了白芨資源的開發利用，使白芨供需矛盾日趨突出，也嚴重威脅到白芨自然資源的保護。為了減輕對白芨野生資源的依賴，滿足生態綠色發展與林下經濟發展的需要，人工繁育白芨勢在必行。植物組培能快速繁衍大批種苗，且蘭科植物原球莖繁衍增殖技術已較成熟，但目前白芨原球莖的增殖系數僅2.00～3.00，與同為蘭科植物的蝴蝶蘭相差甚遠，難以滿足市場需求。因此，優化白芨原球莖誘導培養條件及擴大原球莖增殖倍數，對提高其快繁培養效率具有重要意義。【前人研究進展】管常東等（2010）研究發現，白芨種子十分細小又無胚乳，在自然條件下萌生艱難，需在潮濕的苔蘚上才能發芽；傳統的白芨栽培主要通過分株繁衍，耗時久、效果差，且材料消耗大，難以滿足大批量栽培需要。近年來，國內外正在探索白芨的組培技術，以實現人工種植，減少對野生資源的依賴。葉靜等（2010）研究認為，1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0%活性炭最適合白芨種子萌發；MS+1.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA最適宜白芨叢生芽增殖。趙漫麗等（2011）研究認為，最適合白芨種子萌發的培養基為MS+1.0～3.0 mg/L 6-BA+I.0 mg/L NAA+3.0 g/L碳粉；最適合白芨繼代增殖的培養基為MS+1.0～2.0mg/L 6-BA+2.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+4.0 g/L瓊脂+15.0 g/L魔芋粉；最有利于白芨生根的培養基為1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+I.5 mg/L NAA+1.5 mg/LIBA+70.0 g/L香蕉泥。李慧敏等（2013）研究發現，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.2 mg/L NAA+附加物最適合白芨假鱗莖誘導。葉秀仙等（2015）研究發現，較適宜素心建蘭種子無菌萌發的培養基為1/2MS+0.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2.0 g/L水解蛋白+1.0 g/L活性碳+30.0 g/L蔗糖。易雙雙等（2016）研究發現，最適宜樹蘭的增殖培養基為MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，增殖系數為5.20。【本研究切入點】目前，針對建立白芨原球莖高效增殖體系的研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】以白芨種子為外植體，篩選安全簡便高效的滅菌方法；優化種子萌發和原球莖誘導的環境因子，篩選最適宜原球莖誘導和增殖培養基，提高白芨原球莖增殖系數，建立白芨原球莖高效增殖體系，為白芨組培苗的規模化生產提供技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試白芨果莢飽滿未破裂，顏色均勻且品質優良，產自湖北宜昌遠安縣。

1.2試驗方法

1.2.1滅菌方法篩選 將白芨蒴果用自來水沖洗30 min，用洗潔精清洗蒴果表面，然后隨機分成3個處理，處理1蒴果先用75%乙醇浸泡30～45 s，然后用0.1%升汞消毒8～10 min，無菌水沖洗5-8次，無菌濾紙吸干表面水分；處理2蒴果在75%乙醇中浸泡10min，取出后置于超凈工作臺上吹干；處理3蒴果用10%次氯酸鈉消毒8～10 min，然后用無菌水沖洗5～8次，無菌濾紙吸干表面水分。各處理均浸泡8個蒴果，浸泡液沒過蒴果。隨后剖開果莢將種子接種于1/2MS培養基中，每處理組接種20瓶，每組6次重復，培養7 d后統計污染數，計算無菌萌發數和萌發率。

無菌萌發數=總瓶數-污染數-不萌發數

萌發率（%）=無菌萌發瓶數/總瓶數×100

1.2.2原球莖誘導培養基篩選 以1/2MS和MS為基本培養基，添加不同濃度6-BA和NAA組成8個培養基配方，篩選出白芨原球莖誘導的最佳植物生長物質組合。

1.2.3原球莖誘導環境因子篩選 以1/2MS為基本培養基，分別添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，置于光照強度梯度為黑暗、10.0μmol/m²·s、20.0μmol/m²·s和30.0μmol/m²·s及溫度梯度為10、15、20和25℃等條件下進行單因素試驗，篩選出原球莖誘導的最佳條件。

1.2.4原球莖增殖培養基篩選 分別以1/2MS、3/4MS和MS為基本培養基，添加0.5、1.0、1.5 mg/L 6-BA和0.1、0.2、0.3 mg/L NAA及50.0 g/L香蕉泥、土豆泥和椰子汁，通過正交試驗設計（表1），篩選出白芨原球莖增殖系數最高的培養基配方。

培養條件：選擇形態大小相近、未開裂的白芨蒴果，滅菌后將果莢內的種子接入不同設置的培養基，各組處理均添加7.8 g/L瓊脂粉和30.0 g/L蔗糖，并將pH調整為5.8～6.0，每天光照14 h。

1.3統計分析

試驗數據采用Excel 2010和SPSS 18.0進行統計分析。

2結果與分析

2.1不同滅菌方法對白芨種子萌發的影響

從表2可看出，白芨果莢3種滅菌處理方式的污染率存在顯著差異（P<0.05，下同），其中處理2的滅菌效果最好，無菌萌發率達90.0%，顯著高于處理1和處N3。綜合考慮操作簡便、成本較低及環境友好等因素，后續試驗選擇處理2滅菌方法進行滅菌。

2.2不同基本培養基和植物生長物質濃度配比對白芨原球莖誘導的影響

從表3可看出，不同配方培養基對白芨原球莖誘導效果明顯不同，以1/2MS培養基中原球莖誘導萌發和生長速度較快，其中又以1號培養基的培養效果最佳，培養約17.00 d即萌發，萌發兩周見綠，且顏色很深，說明較低濃度的植物生長物質組合（1.0 mg/L6-BA+0.1 mg/L NAA）有利于白芨原球莖誘導和生長。

由表4可知，基礎培養基類型、6-BA和NAA濃度對白芨原球莖的誘導均有極顯著影響（P<0.01，下同），以基礎培養基類型和6-BA濃度的影響更突出。

綜合分析白芨種子的萌發時間和生長情況，在培養基1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA中，白芨原球莖的誘導速度最陜，長勢最佳。

2.3不同光照強度對白芨原球莖誘導的影響

由表5可知，不同光照強度對白芨原球莖誘導存在顯著影響，在一定范圍內光照強度提高有利于白芨原球莖誘導，其中光照強度為30.0μmol/m²·s時白芨原球莖誘導效果最佳，種子萌發時間最短（僅20.00 d），原球莖長勢極佳，而黑暗處理的白芨種子幾乎不萌發，處理50 d后轉入光照條件下培養可萌發。

2.4不同溫度對白芨原球莖誘導的影響

由表6可知，不同溫度對白芨原球莖誘導存在顯著差異，低溫延緩白芨種子萌發和原球莖形成，適宜溫度對原球莖的誘導較有利，在20～25℃時種子萌發及原球莖形成更快，以25℃為白芨原球莖誘導最佳溫度，誘導23.00 d原球莖即萌發，且長勢極佳。

2.5不同培養基對白芨原球莖增殖的影響

從表7可看出，不同培養基配方對白芨原球莖增殖效果的影響明顯不同。其中，MS培養基中添加0.5 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA和50.0 g/L土豆泥，白芨原球莖的增殖倍數達5.270。正交試驗結果表明，培養基成分對原球莖的增殖倍數有顯著影響，其中，最佳基本培養基類型為MS培養基，最佳6-BA濃度為0.5 mg/L，最佳NAA濃度為0.2 mg/L，最有利于原球莖增殖的附加物為50.0 g/L土豆泥。綜合考慮，原球莖增殖的最佳配方為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/LNAA+50.0 g/L土豆泥。

3討論

本研究探索不同滅菌方法、基本培養基、環境因素、植物生長物質和附加物等對白芨原球莖誘導和增殖的影響，篩選適合原球莖誘導和增殖的最佳培養基，以構建白芨原球莖高效增殖體系。其中，75%酒精滅菌方式操作環節少，對白芨無毒害作用，滅菌效果（滅菌率達90.0%）優于次氯酸鈉和升汞。Thompson等（2006）研究發現，對多種非洲蘭科植物果實最適宜的滅菌方法是先噴灑75%酒精，再用1.75%次氯酸鈉和1%吐溫-20滅菌20 min，然后用1%苯菌靈消毒10 min，最后用無菌水沖洗，滅菌率達65%以上，滅菌效果較本研究差。胡琦敏等（2016）研究表明，最適合蘭科植物灰巖金線蓮蒴果的滅菌方法是0.1%升汞浸泡20 min，種子萌發率最高，但滅菌方法比本研究繁瑣，耗時較長。

管常東等（2010）研究發現，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA是白芨原球莖誘導最適培養基，本研究結果與其相似，白芨原球莖誘導最適培養基為1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。袁寧等（2009）研究認為，1/2MS+1.0 mg/L 6-BA是適宜白芨種子無菌萌發的培養基，種子在無菌播種約45 d時萌發，生長狀態良好，但萌發時間比本研究長，可能與本研究中加入0.1 mg/L NAA并在光照下培養可促進原球莖萌發生長有關。

本研究中，在30.0μmol/m²·s和25℃條件下白芨種子即可萌發，萌發后10.00 d即變綠，約20.00 d可見原球莖生長，而袁寧等（2009）對白芨種子采用20～25℃、暗培養條件，45 d左右種子才萌發，葉靜等（2010）對白芨原球莖先進行暗培養5 d，20 d后變成綠色，27 d產生原球莖，33 d長出芽尖，結合本研究中暗培養50 d種子不萌發分析，光照是促進白芨種子萌發的重要條件。Thompson等（2006）在25℃和8.5μmol/m²·s光照下培養多種非洲蘭科植物種子，種子萌發后生長狀態良好，所使用的光照強度小于本研究，說明不同種蘭科植物種子的無菌萌發可能需光程度不同，提供光照可明顯縮短其萌發時間，加速原球莖形成進程。本研究中，白芨種子萌發和原球莖生長的較佳溫度為20～25℃，與Jhompson等（2006）、袁寧（2009）的研究結果一致，可作為白芨原球莖規模化培養溫度。

Jiang等（2011）研究發現，以獨花蘭嫩芽為外植體，在最佳增殖培養基1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA中增殖倍數為1.4-3.3。石云平等（2013）研究認為，MS+1.0 mg/L 6-BA+3.0 mg/L 2，4-D為最適宜增殖培養基，叢芽增殖倍數達2.88。本研究中，白芨原球莖增殖的最佳培養基為MS+0.5 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA+50.0 g/L土豆泥，增殖倍數達5.270，明顯高于上述研究結果，可能與適當降低植物生長物質濃度特別是NAA濃度及添加50.0 g/L土豆泥有利于原球莖增殖有關。本研究的增殖培養基可提高白芨原球莖增殖倍數，有利于白芨批量繁殖，可在工廠化生產中投入使用。

4結論

本研究建立的白芨原球莖高效增殖體系為：使用75%乙醇浸泡白芨果莢10 min消毒滅菌，以1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA為原球莖誘導培養基，以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+50.0 g/L土豆泥為增殖培養基。該體系可在白芨種苗工廠化組培生產中推廣應用。