赤眼鱒形態特征及其兩種同工酶的組織特異性分析

張濤　陳建武　張林　周劍光　何力

摘要：【目的】從形態特征和生化遺傳層面上豐富赤眼鱒種質資源研究數據，同時為篩選出鑒定赤眼鱒種群的生化遺傳標記打下基礎。【方法】采用形態學測量觀察赤眼鱒的形態特征，并以聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其不同組織（心臟、眼睛晶狀體、肌肉、肝臟和腎臟）中的乳酸脫氫酶（LDH）和蘋果酸脫氫酶（MDH），分析兩種同工酶表達的組織特異性。【結果】赤眼鱒的眼上緣可見一紅斑，鰓耙短而疏，主要形態特征為背鰭D.iii-7，胸鰭Pi.14，臀鰭A.iii-7～8，腹鰭V.i-8，其齒式2·4·5/4·4·2或2·4·4/4·4·2。從赤眼鱒的心臟、眼睛晶狀體、肌肉、肝臟和腎臟等5種組織中共檢測到7條LDH酶帶和6條MDH酶帶，不同組織中的酶帶數目和活性各不相同，呈明顯的組織特異性，且同一組織不同個體間也存在明顯差異。【結論】同工酶表達的組織特異性除了受遺傳基因調控外，還與各組織的生化代謝活動相關，其中心臟LDH可作為鑒定赤眼鱒種質的生化遺傳標記。

關鍵詞：赤眼鱒；形態特征；乳酸脫氫酶（LDH）；蘋果酸脫氫酶（MDH）；組織特異性

中圖分類號：S965.199 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）12-2281-07

0引言

【研究意義】赤眼鱒（Squaliobarbus curriculus）俗稱野草魚、紅眼魚，原屬于江河野生魚類，除新疆和青藏高原外，我國各大河流湖泊均有發現，主要分布在長江水系和珠江水系，因具有生長快、抗逆性強、肉質細嫩、營養豐富等特點而深受人們喜愛，現已發展成為淡水養殖的主要對象。但近年來因過度捕撈、水資源污染、外來物種入侵及魚類生境遭到破壞，導致赤眼鱒種質資源銳減（chen et al.，2009），因此研究和保護其種質資源勢在必行。【前人研究進展】目前，有關赤眼鱒的研究報道主要集中在生物學特征（龍光華等，2005a；郭麗麗等，2009）、繁殖特性與人工繁殖（龍光華等，2005b，2005c；楊明生等，2005）、雜交育種（任麗珍等，2011；何美鳳等，2015；李迪等，2016）及分子遺傳特性評估（楊太有等，2008；邵芳等，2013；楊慧榮等，2013）等方面，并已證實赤眼鱒苗種包括仔魚后期、稚魚期和幼魚期3個時期，其中，仔魚后期卵黃囊消失，開始攝食；稚魚期出現鱗片至全身批鱗；幼魚期側線明顯，體形體色與成魚相似。這些研究結果為赤眼鱒的開口攝食和苗種培育提供了技術參考和指導。同工酶作為一種生化遺傳標記，在魚類的親緣關系研究、分類和物種鑒定及群體遺傳結構分析等方面已得到廣泛應用（Verspoor and Moyes，2005；張娟等，2011；Ardestani et al.，2014）。張瑞等（2014）研究表明，皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai，♀）與黑足鮑（H.iris，♂）雜交F₁代的同工酶主要來自母本皺紋盤鮑。楊鳳香等（2015）通過比較白氏文昌魚（Branchiostoma bel-cheri）、日本文昌魚（B.japonicum）和佛羅里達文昌魚（B.floridae）的4種同工酶[蘋果酸脫氫酶（MDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、酯酶（EST）、淀粉酶（α-AMY）]的酶譜，結果發現這4種同工酶的酶帶數目、染色程度及遷移率在不同文昌魚問的差異較明顯，可作為鑒定文昌魚種群的依據。張龍崗等（2017）研究發現，烏鱧（Ophicephalus argus）和雜交鱧（O.argus ♂×O.maeulata早）的MDH、乙醇脫氫酶（ADH）存在明顯的品種差異性，即這兩種酶可作為鑒別烏鱧和雜交鱧的新指標。【本研究切入點】至今，尚無涉及赤眼鱒生化遺傳特性方面的研究報道。【擬解決的關鍵問題】采用形態學測量觀察赤眼鱒的形態特征，并以聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其不同組織中的乳酸脫氫酶（LDH）和蘋果酸脫氫酶（MDH），擬從形態特征和生化遺傳層面上豐富赤眼鱒種質資源研究數據，同時為篩選出鑒定赤眼鱒種群的生化遺傳標記打下基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試赤眼鱒樣本均為池塘養殖群體，于2017年3月采自湖北宜昌，共30尾，體重范圍6.3～33.1 g/尾，體長范圍7.7～12.9 cm/尾。

1.2形態測定

按照GB/T 18654.3-2008《養殖魚類種質檢驗》中的相關規定，用游標卡尺（精確度0.1 mm）對樣品魚進行形態測定。其中，可數性狀包括背鰭、臀鰭、胸鰭和腹鰭的鰭式、側線鱗式及左側第一鰓弓外側鰓耙數，可量性狀包括體長、體高、頭長、吻長、眼徑、眼間距、尾柄長和尾柄高。

1.3組織酶液制備

參照賀剛等（2012）的方法制備組織酶液。用-剪刀剪除赤眼鱒鰓部后置于水中放血，冰浴條件下趁魚體尚存活時取心臟、眼睛晶狀體、肌肉、肝臟和腎臟等5種組織樣品，各組織樣品經預冷生理鹽水沖洗干凈后-80℃保存備用；或直接稱重后置于洗凈預冷的勻漿器中，按1：3（g/mL）的比例加人預冷雙蒸水，冰浴條件下反復研磨至漿狀，4℃下12000 r/min離心30 min，重復3次，收集上清液，分裝后-80℃保存備用。

1.4聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳及染色

同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳，其分離膠濃度7.5%，濃縮膠濃度3.0%，電極緩沖液為pH 8.3的Tris甘氨酸。電泳采用穩壓（220 V）方式，電泳時間5 h。電泳結束后取出凝膠板，室溫下避光染色，其中，LDH染色參照楊鳳香等（2015）的方法，MDH染色參照孟彥等（2009）的方法。待顯現清晰條帶后以去離子水漂洗凝膠板2～3次，然后將凝膠板平放在自制燈箱上采用尼康數碼相機拍照。

1.5統計分析

所測得可量性狀數據采用SPSS 20.0進行統計分析。

2結果與分析

2.1赤眼鱒的形態特征

赤眼鱒魚體延長，略呈圓筒形，腹部圓，后段較側扁，頭呈圓錐形，吻圓鈍；口端位，稍向上翹；口裂寬。上頜有兩對細小的須；眼大，靠近吻端，眼上緣可見一紅斑；鼻孔位于眼前上方。魚鱗較大，圓形，側線平直，向后延伸至尾柄正中。背鰭無硬刺，起點與腹鰭相對或略前，背鰭起點至吻端的距離小于至尾鰭基部的距離；胸鰭末端可達胸鰭起點至腹鰭基部距離的3/5處；臀鰭靠后，起點至腹鰭基部的距離大于至尾鰭基魚的距離；尾鰭分叉深（圖1）。赤眼鱒的主要形態特征為背鰭D.iii-7，胸鰭Ri-14，臀鰭A.iii-7～8，腹鰭V.i-8。

赤眼鱒通體銀白，但背部顏色較深。體側每一鱗片后部邊緣有黑斑，組成體色縱裂條紋。背鰭、尾鰭深灰色，尾鰭有黑色邊緣，其他各鰭灰白色（圖1）。鰾2室，前室膨大，后室向尾部逐漸變細，無鰾管。腹膜黑色。鰓耙很短，頂端尖，排列稀疏，鰓絲長。下咽齒3行，齒端呈鉤狀，齒式2·4·5/4·4·2或2·4·4/4·4·2。赤眼鱒的頭長大于體高，吻長大于眼徑，且尾柄長約是尾柄高的1.50～1.80倍（表1）。

2.2赤眼鱒LDH的表達情況

由圖2可看出，從赤眼鱒的心臟、眼睛晶狀體、肌肉、肝臟和腎臟等5種組織中共檢測到7條LDH酶帶，將分子量最小的酶帶命名為LDH1，分子量最大的酶帶命名為LDH7，不同組織中的酶帶數目和活性各不相同，呈明顯的組織特異性。其中，從心臟中共檢測到6條酶帶，以LDH5活性最強，LDH1活性最弱，4尾不同赤眼鱒個體的酶帶數目和活性程度基本相同；從眼睛晶狀體中共檢測到6條酶帶，4尾不同赤眼鱒個體的酶帶數目和活性程度各不相同，LDH1、LDH2、LDH4和LDH5為共有酶帶，1號魚和4號魚的酶帶數目完全相同，均有LDH3和LDH6；從肌肉中共檢測到7條酶帶，LDH1、LDH2、LDH4、LDH5和LDH6為共有酶帶，LDH6為所有酶帶中活性最強的酶帶，除3號魚外其他個體均有LDH3，只是酶帶活性有所差異；從肝臟中也檢測到7條酶帶，以4號魚的酶帶數目最多（7條），2號魚僅見1條酶帶，LDH7為所有酶帶中活性最強的酶帶；從4尾不同赤眼鱒個體的腎臟中均能檢測到6條酶帶，且以LDH3的活性最弱。

2.3赤眼鱒MDH的表達情況

MDH分上清液型（S-MDH）和線粒體型（M-MDH）兩種類型，分別由兩個基因位點控制，為二聚體。由圖3可看出，從赤眼鱒的5種組織中共檢測到6條MDH酶帶，將分子量最小的酶帶命名為MDH1，分子量最大的酶帶命名為MDH6，其數目和活性也存在明顯的組織特異性。其中，從心臟中共檢測到3條酶帶，MDH3為共有酶帶，MDH2活性最強，MDH1活性較弱，1號魚和2號魚的帶型相同，3號魚和4號魚的帶型相同；在4尾樣本魚的眼睛晶狀體中均未檢測到酶帶；從肌肉中共檢測到6條酶帶，MDH3為共有酶帶，以2號魚的酶帶數目最多（5條）、3號魚的酶帶數目最少（僅1條）；從肝臟中共檢測到5條酶帶，1號魚未檢測到酶帶，2號魚檢測到1條酶帶（活性較弱），3號魚的酶帶數目最多（4條），4尾樣本魚中未發現共有酶帶；從腎臟中共檢測到3條酶帶，MDH2為共有酶帶。

2.4赤眼鱒生化遺傳標記

除了心臟和腎臟外，其余組織的LDH和MDH均呈多態性，不適宜作為鑒定赤眼鱒種質的生化遺傳標記。同時考慮到腎臟成分相對復雜，易造成污染，故不建議采用腎臟作為生化遺傳標記。心臟組成主要是心肌，其成分相對簡單，制備同工酶樣本時不易造成提取成分污染。由圖4可看出，10尾赤眼鱒樣本的心臟LDH均呈單態，即不存在個體差異，且各酶帶分離清晰，因此建議采用心臟LDH作為鑒定赤眼鱒種質的生化遺傳標記。

3討論

3.1形態學方法在魚類種質鑒定中的應用

由于不同魚類具有不同的形態學特征，觀察其外部形態特征，或通過形態測量獲取可數性狀和可量性狀數據，可直觀、便捷地進行種類鑒定（丁嚴冬等，2015）。除傳統形態學數據外，近年來還有學者將框架數據運用到魚類種質鑒定中（宓國強等，2010；許淼洋等，2013）。通過與前人的相關研究結果進行對比分析，發現本研究選取的赤眼鱒與珠江水系赤眼鱒的部分形態特征存在明顯差異。本研究中，赤眼鱒的齒式2·4·5/4·4·2或2·4·4/4·4·2，體長為體高的4.50-5.00倍，尾柄長為尾柄高的1.50～1.80倍；而珠江水系赤眼鱒的齒式2·4·5/5·4·2或2·4·4/4·4·2或2·4·5/4·3·2，體長為體高的3.80～4.40倍，尾柄長為尾柄高的1.20～1.40倍（廣西壯族自治區水產研究所和中國科學院動物研究所，2006）。造成這種差異的原因除了與樣本量及規格差異有關外，可能還與測量方法有關，如可量性狀參數的起始點界定，常因研究者的不同而產生差異。此外，本研究挑選的赤眼鱒樣本為池塘養殖群體，其餌料來源相對野生群體更豐富，但是否會造成部分可量性狀差異，尚需進一步探究。

3.2同工酶表達的組織特異性

本研究結果表明，LDH和MDH兩種同工酶在赤眼鱒組織中的表達均具有組織特異性，即某一同工酶在同一個體不同組織器官中的表達類型和程度皆有不同。從赤眼鱒的心臟中共檢測到5條LDH酶帶，在其腎臟中共檢測到6條酶帶，]tLDH在心臟中的表達活性整體上強于腎臟。同工酶在組織器官中的表達情況受遺傳基因調控，因此部分同工酶基因只在特定的組織或器官中表達。一般認為，脊椎動物同工酶LDH在胚胎發育和細胞分化中具有明顯的分化調控模式，表現出高度的發育和組織特異性（張娟等，2011）。從本研究結果來看，赤眼鱒心臟和腎臟中的LDH均為單態，可考慮作為鑒定赤眼鱒種質的生化遺傳標記，但在實際操作中采集赤眼鱒腎臟組織時易摻入其他組織而影響研究結果，而心臟組成主要是心肌，成分相對簡單，制備同工酶樣本時不易造成提取成分污染，故建議采用心臟LDH作為鑒定赤眼鱒種質的生化遺傳標記。

3.3同工酶表達的活性強弱

同工酶的表達與組織器官的代謝活動也密切相關。LDH是糖酵解過程中的一種重要酶系，能促使乳酸與丙酮酸問發生可逆的轉化（余敏等，2006）；MDH是參與三羧酸循環的酶系，在葡萄糖異生和糖酵解過程中發揮重要作用（林文燕等，2010）。本研究從赤眼鱒肝臟中檢測出7條LDH酶帶，眼睛晶狀體中檢測到6條酶帶，且LDH在肝臟中的表達活性比在眼睛晶狀體中的強；在MDH方面，從赤眼鱒肝臟中檢測出5條酶帶，而在眼睛晶狀體中未檢測到對應的酶帶。肝臟是機體重要的代謝功能器官，具有解毒、儲存糖原、促進蛋白合成、分泌膽汁促消化等重要生理作用，因此同工酶在肝臟中的普遍表達與其行使復雜、重要的生理功能密切相關。

3.4同工酶表達的個體差異

同工酶在同一物種不同個體相同組織中的表達差異可能與其生長發育階段、健康狀態、地理環境（生境）等均有關聯。薛俊增（2002）研究發現，病蟹和健康蟹的同工酶分離圖譜存在明顯差異，如健康蟹的心臟和肌肉LDH均有2條譜帶，而病蟹只有1條譜帶。賈守菊等（2004）研究表明，中華絨螯蟹不同發育階段ADH的酶帶數目及其活性均呈減弱趨勢，而EST在抱卵蟹時的酶帶數最多、活性最強。余敏等（2006）研究發現，云南高背鯽魚心臟EST-5在10尾樣本魚中僅部分表達，存在明顯的個體差異。黃孝湘等（2012）推測，造成不同水域克氏原螯蝦同種組織LDH酶帶數目差異的原因是水質問題。本研究結果表明，除了心臟和腎臟外，其余組織的LDH和MDH均呈多態性，如2號魚肌肉中檢測到7條LDH酶帶，而3號魚肌肉中僅檢測到6條酶帶，其差異可能與不同個體的大小或健康狀況有關，但具體原因有待進一步探究。

4結論

同工酶表達的組織特異性除了受遺傳基因調控外，還與各組織的生化代謝活動相關，其中心臟LDH可作為鑒定赤眼鱒種質的生化遺傳標記。