福州野生蕉隱花色素和光敏色素基因家族的克隆及其表達分析

劉轉霞 余運康 陳裕坤 馮新 劉煒婳 張梓浩 程春振 林玉玲 賴鐘雄

摘 要 采用RT-PCR結合RACE法從福州野生蕉試管苗中克隆隱花色素和光敏色素基因家族成員的cDNA序列，命名為MuCry1、MuCry2a、MuCry2b、MuPhyB、MuPhyC1。MuCrys和MuPhys的cDNA序列依次為2 330、2 859、2 752、3 272、3 912 bp，編碼698、666、669、1 089、1 003個氨基酸。生物信息學分析表明：MuCrys和MuPhys均屬不穩定、親水蛋白，具跨膜結構域和卷曲螺旋結構，都不具信號肽，均定位于細胞核。系統進化樹分析結果表明：Cry1和Cry2聚為兩大類，其中MuCry1與小果野蕉、海棗和油棕Cry1的親緣關系最近，與雙子葉植物大豆Cry1的親緣關系最遠；MuCry2a和MuCry2b與小果野蕉、水稻和小麥Cry2的親緣關系最近，與雙子葉植物碧桃Cry2的親緣關系最遠；MuPhyB與小果野蕉PhyB的親緣關系最近，與雙子葉植物毛果楊PhyB的親緣關系最遠；MuPhyC1與小果野蕉和馬來蘭花蕉PhyC的親緣關系最近，與雙子葉甜橙PhyC親緣關系最遠。qRT-PCR結果表明：MuCry的3個成員和MuPhyC1對不同光質響應存在差異，藍光都可促進MuCry 3個成員 mRNA的轉錄，紅光促進MuPhyC1 mRNA的轉錄，在黑暗、紅光、綠光和黃光下MuCry1的表達受到抑制；黃光和紅光對MuCry2a的轉錄水平影響不明顯，而黑暗、暖白光和綠光可抑制MuCry2a的表達水平；MuCry2b的轉錄水平受藍光和紅光的正調控，而受綠光的負調控；MuPhyC1在紅光處理下的表達量最高，藍光和暖白光下的表達量相近，白光、綠光、黃光和黑暗處理下的表達量差異不大，表明MuPhyC1積極響應紅光刺激。

關鍵詞 野生蕉；隱花色素；光敏色素；光質處理；表達分析

中圖分類號 S668.1 文獻標識碼 A

Abstract The RT-PCR combined with RACE method was used to obtain Cryptochrome and Phytochrome gene family in the wild banana of Fuzhou， named MuCry1， MuCry2a， MuCry2b， MuPhyB and MuPhyC1. respectively. The cDNA sequences of MuCrys and MuPhys were 2 330， 2 859， 2 725， 3 272， 3 912 bp， encoding 698， 666， 669， 1 089 and 1 003 amino acids. Bioinformatics analysis showed that All MuCrys and MuPhys belong to the instability and hydrophilous proteins， and had transmembrane structures， and had no signal peptide， subcellularlocation predictions of them locating were in the nucleus. Phylogenetic anglicizing of Cry and Phy in plants indicated that not only Cry1 and Cry2， but also PhyB and PhyC belonged to the different branches， but they all had farthest genetic relationship with dicotyledons； MuCry1 have a close genetic relationship with MaCry1（Musa acuminata）， EgCry1（Elaeis guineensis）， and PdCry1（Phoenix dactylifera）， MuCry2a and MuCry2b belongs to the same branch with a close genetic relationship with MuCry2， and TaCry2（Triticum aestivum）， and OsCry2（Oryza sativaJaponica）， MuPhyB have a close genetic relationship with MuPhyB（Musa acuminata）， MuPhyC1 have a close genetic relationship with MuPhyC（Musa acuminata）and OmPhyC（Orchidantha maxillarioides）. qRT-PCR results revealed that three members of Cryptochrome gene family and MuPhyC1 had different responses to different light quality， and blue light could promote the transcription of MuCrys mRNA， and red light could promote the transcription of MuPhyC1. The expression of MuCry1 was inhibited in dark， red， green and yellow light； The effect of light on the transcription level of MuCry2a was not obvious， while dark， warm white and green light could suppress the expression level of MuCry2a. The transcriptional level of MuCry2b was positively regulated by blue and red light， and was negatively controled by green light； MuPhyC1 had the highest expression in red light， The expression level of white red， green， yellow and dark light treatment was not significant， indicating that MuPhyC1 positively responded to red light stimulation.

Key words Wild banana（Musa spp）； Crypthchrome； Phytochrome； light quality treatment； gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.016

隱花色素（Cryptochrome，Cry）是重要的光受體之一，是一類通過吸收藍光和近紫外光[1]，進而影響植物生長發育形態、新陳代謝和其自身對向光性反應的光敏受體[1-2]，大多數植物的隱花色素都是黃素類蛋白，主要包括氨基酸PHR（photolyase-related）和羧基端CCT（Cryptochrome C Terminal）兩個明顯的功能區[1-3]。研究表明隱花色素與DNA光裂解酶結構高度相似但功能各異，隱花色素無光裂解酶活性[1，4-5]，其廣泛存在于細菌、植物、動物和人體內[6-7]。最近新發現的隱花色素家族成員Cry-DASH[8]，僅在葉綠體和線粒體中檢測到，其缺少Cry蛋白典型的C末端延伸，但可能具有單鏈DNA光裂解酶活性[8-9]。植物隱花家族包括光裂解酶，Cry-DASH和植物隱花色素三類成員[1，7，9]。隱花色素作為藍光受體，其基因家族成員中Cry1和Cry2的C端包括一個可變區域，N端的相似性很高，包含碟呤和FAD兩種分子，Cry-DASH具有修復單鏈DNA的功能[8-9]，隱花色素出現于真核和原核分化之前，其DNA結合和依賴氧化還原的功能與光解酶一致，是一種轉錄抑制劑[1，7，9，10]。光敏色素（Phytochrome，Phy）是由4個生色團與脫輔機蛋白質共價結合形成的一種易溶于水的調節生長發育的色素蛋白復合體，廣泛存在于植物界，在光合細菌中的含量較光合植物中高[10]，光合植物中Phy的表達幾乎不受環境光照的影響。研究發現植物中光敏色素家族基因包括PhyA、PhyB、PhyC、PhyD和PhyE五個成員[4，11]。近年來植物中關于隱花色素的研究主要包括幼苗的去黃化[12-15]、植物開花調節[16-17]、植物生物鐘[18]和氣孔開放的調控[19]、引發晝夜節律性[20]和調控基因的表達模式[21]、并表現出趨光性彎曲[22]的特性等方面，其中Cry1蛋白主要介導生物鐘調節以及抑制幼苗下胚軸伸長[14]，Cry2調控去黃化[12，14]等。近來還發現隱花色素參與植物對磁場的感應[23]和細胞的程序性死亡[24]，同時林辰濤等[25]證明了植物隱花色素的光誘導蛋白質二聚化反應為其原初光反應的關鍵步驟，光敏色素對植物的生長發育的作用主要表現在調控植物花期[16-17]、介導植物光受體信號轉導[26]、促進種子萌發[13-14，27]和改變植物抗逆性[28]，通過調節植物自身的表達進而調控作物的產量[21，29]，其中PhyA介導遠紅光信號下幼苗的光形態建成，是紅光下種子萌發和去黃化的主要光受體[26]，同時PhyB也參與抑制胚軸的伸長和促進種子萌發[14]以及紅光信號下幼苗的光形態建成，其缺失則影響種子葉柄延長[14]、發育以及早花現象[16，27]，對于紅光感應較弱的PhyC，與PhyB、PhyD、PhyE共同參與避蔭反應和調節光下植物生長[13，19，28]，PhyD基因啟動子在植物不同組織的活性存在明顯差異[12，14]。此外隱花色素和光敏色素的磷酸化可改變其活性，其蛋白互作共同參與并調控紅藍光作用[10，13-14，29]。

光是影響植物生長發育最重要的環境因子之一，隱花色素和光敏色素分別作為藍光和紅光受體，當前研究已較為深入，但大多主要集中于擬南芥、水稻、小麥等模式植物幼苗去黃化、開花調節以及光形態建成等方面。目前關于隱花色素（MuCry）和光敏色素（MuPhy）在福州野生蕉（Musa spp.）[30]光形態建成方面的研究還未見報道，通過香蕉全基因組分析，香蕉基因組中隱花色素家族具有Cry1，Cry2a、Cry2b和Cry-DASH 4個成員，光敏色素有PhyA、PhyB、PhyC1和PhyC2 4個成員。香蕉作為世界4大水果之一，不僅在全世界種植廣泛，更是重要的經濟作物和糧食作物，但由于栽培過程中遭受光照不足、病害、低溫等脅迫使得產量下降和品質嚴重不佳。本研究以福州野生蕉為材料，克隆得到隱花色素和光敏色素基因家族不同成員的基因序列，進行基因結構以及蛋白的生物信息學分析，并借助qRT-PCR技術檢測各成員在不同光質處理下的表達情況，以期為探討隱花色素響應藍光和光敏色素響應紅光的機制提供理論依據，為隱花色素和光敏色素參與香蕉光質應答和光形態建成等方面的功能研究奠定理論基礎，同時為解決生產中香蕉光照不足導致產量和品質問題提供解決辦法的科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料與光質處理

以福州野生蕉（Musa spp.）組培苗為供試材料提取總RNA；并選取大小和長勢一致的組培苗進行光質（紅、綠、黃、藍、白、暖白、黑暗）處理24 h，5個重復。取不同光質（功率18 W）處理后的香蕉葉片于液氮中速凍，并保存于-80 ℃用于后續基因表達分析，以上材料均由福建農林大學園藝植物生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與cDNA合成 采用Column Plant RNAOUT 2.0試劑盒（TIANDZ，China）進行香蕉總RNA的提取。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，后用紫外分光光度計檢測OD260/280在1.9～2.1之間且完整性良好的核酸備用。采用Thermo Scientific Rever-tAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，EU）將總RNA逆轉錄為帶AP（GGCCACGCGTC-GACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT）接頭的cDNA，作為ORF和3′-UTR擴增的模板。采用SMARTTM RACE cDNA Amplification kit（Takara，Japan）進行cDNA逆轉錄，用于5′-UTR的擴增。

1.2.2 引物設計及PCR擴增 保守區擴增：根據GenBank中馬來西亞小果野蕉（Musa.acuminata，AA group）全基因組（http：//banana-genome-hub.southgreen.fr/）結合GenBank中已經登錄的多種植物相應基因序列多重比對結果，選擇同源性比較高的基因片段進行福州野生蕉MuCrys和MuPhys基因保守區的引物設計與PCR擴增，選取與預期片段大小一致的條帶進行回收，以pMD18-T為載體、DH5α為感受態對回收片段進行TA克隆。菌液PCR后選取陽性克隆子測序，篩選與目的片段大小相符的結果，經BLAST進行同源比對確定保守區序列。

3′-RACE和5′-RACE：采用RACE法，在得到保守序列的基礎上分別設計2條3′-RACE和5′-RACE特異引物，以福州野生蕉試管苗cDNA為模板，進行巢式PCR反應進行3′未端序列和5′未端序列的擴增。

拼接驗證：對克隆所得保守序列、3′未端序列和5′未端序列的測序結果進行全長拼接，設計拼接驗證引物，PCR反應驗證拼接結果。以上引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。所有引物的序列、擴增的目的片段大小、退火溫度及擴增用途見表1。

PCR反應體系和擴增程序參照張銳[31]的方法，根據擴增片段的不同，對PCR擴增程序進行相應的調整。獲得目的片段后切膠回收，TA克隆后挑取陽性克隆子的菌液進行PCR擴增，將有目的條帶的菌液送至華大基因公司測序。

1.2.3 基因序列分析 采用DNAMAN6.0進行核苷酸序列比對和拼接。采用NCBI對福州野生蕉隱花色素和光敏色素家族基因及其推導的氨基酸序列進行同源性比對；以ExPASy Protparam軟件預測編碼蛋白的理化性質；應用SignalP 3.0 Server進行編碼蛋白的信號肽預測；以PSORT亞細胞定位；TMpered軟件進行蛋白質跨膜結構預測；應用NetPhos2.0軟件進行編碼蛋白的磷酸化位點預測，蛋白卷曲螺旋結構則以EMBnet COILS軟件進行預測；以NCBI blastp預測蛋白質保守結構域；經PSIPRED在線軟件預測蛋白質二級結構；蛋白質三級結構預測以SWISS-MODEL進行；最后采用Mega5.05軟件的Neighbor-Joining（鄰位相連法，NJ法）構建核苷酸序列的分子系統進化樹（P-distance法），并用bootstrap法（重復1 000次）評估系統進化樹。

1.2.4 福州野生蕉隱花色素和光敏色素家族基因在不同光質處理下的qRT-PCR分析 以Chen[32]等篩選的在非生物脅迫下表達較穩定的CAC基因作為本研究定量分析的內參基因，引物序列為CAC-qF（AACTCCTATGTTGCTCGCTTATG）和CAC-qR（GGC

TACTACTTCGGTTCTTTCAC），采用SYBR ExScript試劑盒（Takara，Japan）和羅氏LightCycler480儀器（Thermo Fisher，USA），以經不同光質處理的福州野生蕉組培苗的cDNA為模板，根據熒光定量引物設計的原則在MuCrys和MuPhys各基因的特異位置設計上下游引物進行qPCR擴增。qRT-PCR反應體系和擴增程序參照馮[33]等的方法。待反應結束后進行擴增曲線、溶解曲線（60～95 ℃）和凝膠電泳分析，檢測引物的特異性；每個反應包括3個重復，在樣品擴增的同時，將不同光質處理的cDNA模板的混合樣進行5倍梯度稀釋制作標準曲線。從擴增曲線圖中得到Ct值，并根據標準曲線獲得不同處理下福州野生蕉隱花色素Crys和光敏色素Phys各基因的mRNA相對含量，通過內參基因的校正最終得到目的基因的相對表達量，進行福州野生蕉隱花色素Crys和光敏色素Phys各基因在不同光質處理下的表達情況分析。數據分析采用Ex-cel和geNORM（version3.5）[34]軟件進行。

2 結果與分析

2.1 福州野生蕉MuCrys和MuPhys基因家族成員cDNA全長序列克隆及分析

本研究通過同源克隆的方法分別得到了MuCrys和MuPhys基因家族的保守區，并采用RACE法擴增得到MuCrys和MuPhys的3′末端序列和5′末端序列，通過DNAMAN6.0拼接驗證，得到MuCry1的cDNA序列2 330 bp，MuCry2a的cDNA全長2 859 bp，MuCry2b的cDNA全長2 725 bp，MuPhyB的cDNA序列3 272 bp，MuPhyC1的cDNA全長3 912 bp（具體見表2）。MuCry1和MuCry2a的終止密碼子是TAG，MuCry2b和MuPhyC1的終止密碼子是TAA，MuPhyB的終止密碼子是TGA。將以上序列的核苷酸和推導的氨基酸序列分別在NCBI上進行Blast分析，結果顯示MuCrys和MuPhys與數據庫中已知的毛果楊（Populus tremula）、海棗（Phoneix dactylifera）、油棕（Elaeis guineensis）等的Crys、Phys基因序列高度同源。因此推斷已經成功克隆得到福州野生蕉隱花色素Crys基因家族和光敏色素Phys基因家族的序列，分別命名為MuCry1（登錄號KX236155）、MuCry2a（登錄號KX236156）、MuCry2b（登錄號KX236157）、MuPhyB（登錄號KX247367）、MuPhyC1（登錄號KX247368）。

2.2 福州野生蕉MuCrys和MuPhys的生物信息學分析

利用ExPASy Protparam預測MuCry1、MuCry2a、MuCry2b、MuPhyB和MuPhyC1的理化性質，具體見表3。其信號肽、跨膜結構及其磷酸化位點預測等見表2，其中磷酸化位點MuCry1（Ser：27，Thr：6，Tyr：7）、MuCry2a（Ser：30，Thr：3，Tyr：7）、MuCry2b（Ser：33，Thr：3，Tyr：6）、MuPhyB （Ser：40，Thr：6，Tyr：12）和MuPhyC1（Ser：32，Thr：8，Tyr：6）。以PSORT預測可知MuCry1定位于微體，MuCry2a定位于細胞核和微體，MuCry2b定位于微體和質膜，MuPhyB定位于線粒體類囊體膜、線粒體基質和質膜，MuPhyC1定位于線粒體基質和質膜。經NCBI blastp預測，MuCrys都含有crypt_chrom_pln保守結構域（20～484 aa），其中MuCry1的N端含有與DNA光裂合酶相關（photolyase-related，PHR）的保守結構域（19～181 aa），中間為FAD綁定功能域（221～498 aa），C端為Cryptochrome-C超家族（524～637 aa）；MuCry2a和MuCry2b的N端分別含有與DNA光裂合酶相關（photolyase-related，PHR）的保守結構域（7～161 aa）和（7～162 aa），中間為FAD綁定功能域（212～489 aa），但C端無Cryptochrome-C超家族（圖1）。光敏色素包括有兩個中心區域，即N末端光感受區和C末端光調節區，其中MuPhyB的N末端光感受區包括一個PAS光感應區域（122～240 aa），GAF（cGMP phosphodiesterase-adenylyl cyclas-FhlA，GAF）綁定功能域（273～411 aa）和光敏色素結構域PHY（418～588 aa），C末端光調節區包括PAS光感應區（518～632 aa），HATPase區域（868～981 aa），HisKA區域（761-819 aa），MuPhyC1的N末端光感受區包括一個PAS光感應區域（57～141 aa），GAF綁定功能域（174～308 aa）和光敏色素結構域PHY（315～487 aa），C末端光調節區包括PAS光感應區（624～681 aa），PAS-8區域（725～833 aa），HATPase區域（967～1 079 aa），HisKA區域（855～910 aa），見圖2。經PSIPRED在線軟件預測蛋白質二級結構，MuCry1、MuCry2a和MuCry2b主要由無規則卷曲和α-螺旋組成，MuCry1中α-螺旋31.8%、無規則卷曲61.9%、β-折疊6.3%；MuCry2a中α-螺旋34.8%、無規則卷曲59.5%、β-折疊5.7%；MuCry2b中α-螺旋35.7%、無規則卷曲57.8%、β-折疊6.5%；MuPhyB主要以α螺旋結構為主，所占比例為45.91%；無規則卷曲為40.22%；β折疊13.87%；而MuPhyC11蛋白二級結構中無規則卷曲占43.37%；α螺旋41.87%，β折疊14.76%。采用SWISS-MODEL軟件進行三級結構預測，可見MuCrys蛋白的三級結構比較相近，N端區域主要由多個α-螺旋和β-折疊共同構成復雜的結構，而C端區域主要由無規則卷曲組成，與二級結構預測的結果相符（圖3），MuPhyB和MuPhyC1的三級結構差異較大。最后采用Mega5.05 軟件的Neighbor-Joining（鄰位相連法，NJ法）構建核苷酸序列的分子系統進化樹（P-distance法），并用bootstrap法（重復1 000次）評估系統進化樹（圖4、圖5）。

2.3 氨基酸序列比對及系統進化分析

本研究通過同源克隆的方法分別得到了福州野生蕉隱花色素基因家族MuCry1基因的保守區和5′末端、MuCry2a和MuCry2b的cDNA全長，光敏色素基因家族MuPhyB的保守序列以及MuPhyC1的cDNA全長。并通過NCBI進行blastn比對發現，MuCry1與油棕（Elaeis guineensis，XP_010939647.1）Cry1基因的同源性高達81%，MuCry2a與海棗（Phoenix dactylifera，XP_008790851.1）Cry2a的同源性達75%，MuCry2b與菠蘿（Ananas comosus，OAY67638.1）Cry2b基因的同源性高達74%，MuPhyB與海棗（Phoenix dactylifera，XP_008790851.1）PhyB的同源性高達77%，MuPhyC1與毛果楊（Populus tremula，XP_002318913.1）PhyC的同源性達75%。為了進一步研究MuCrys和MuPhys各基因的保守性，經NCBI blastp預測，MuCrys都含有保守結構域crypt_chrom_pln，MuCrys的N端含有與DNA光裂合酶相關（photolyase-related，PHR）的保守結構域，中間為FAD綁定功能域，且MuCry1C端具Cryptochrome-C超家族。NCBI blastn預測表明MuPhyB和MuPhyC1各含有一段可變剪接體，可能會造成MuPhyB和MuPhyC1在香蕉表達中的功能缺失。為了研究植物MuCry和MuPhy的進化關系，根據NCBI數據庫中油棕（Elaeis guineensis）、海棗（Phoenix dactylifera）、玉米（Zea mays）、小果野蕉（Musa acuminata）、菠蘿（Ananas comosus）、番茄（Solanum lycopersicum）和煙草（Nicotiana sylvestris）等的40多條Cry和Phy的氨基酸序列，利用Mega5.05軟件的鄰近相鄰法（NJ法）構建植物Cry和Phy的系統進化樹（圖4、5），結果表明：植物Cry1和Cry2根據種屬聚為兩大類，其中MuCry1與小果野蕉、海棗和油棕Cry1的親緣關系最近，與雙子葉植物大豆Cry1的親緣關系最遠；MuCry2a和MuCry2b與小果野蕉、水稻和小麥Cry2的親緣關系最近，與雙子葉植物碧桃Cry2的親緣關系最遠；MuPhyB與小果野蕉PhyB的親緣關系最近，與雙子葉毛果楊PhyB的親緣關系最遠；MuPhyC1與馬來蘭花蕉PhyC的親緣關系最近，與雙子葉甜橙PhyC親緣關系最遠。

2.4 福州野生蕉隱花色素MuCrys和光敏色素MuPhyC1在不同光質條件下的表達分析

采用qRT-PCR法研究福州野生蕉隱花色素MuCrys和光敏色素MuPhyC1基因家族共4個成員在不同光質處理（黑暗、紅光、綠光、黃光、藍光、白光和暖白光）條件下的表達模式（圖6），結果表明不同光質處理下，MuCry1對不同光質響應存在差異，其中藍光和暖白光下的表達量高于對照（白光），尤其是藍光下的相對表達量最高，說明藍光刺激可促進MuCry1 mRNA的轉錄，而在黑暗，紅光，綠光和黃光下表達量低于對照，說明這些光質處理抑制了MuCry1的表達。MuCry2a在藍光處理下的表達量高于對照，黃光和紅光處理與對照的相對表達水平相近，而黑暗、暖白光和綠光處理下表達量低于對照，說明藍光可提高MuCry2a的表達水平。MuCry2b也差異性的響應不同光質的處理，在藍光下的表達量最高，依次分別為紅光，黃光，白光（CK），暖白，綠光和黑暗，說明MuCry2b的轉錄水平受藍光和紅光的正調控，而受綠光的負調控。MuPhyC1對于不同的光處理也顯示出差異性表達，在紅光下的表達量最高，說明MuPhyC1 mRNA的轉錄受紅光的影響，其在藍光和暖白光下的表達量相近，白光、綠光、黃光和黑暗處理下的表達量差異不大，說明MuPhyC1積極響應紅光刺激。實時熒光定量PCR的結果說明了福州野生蕉隱花色素MuCry基因家族3個成員的光響應表達模式相似，它們都能正向響應藍光的刺激，綠光和黑暗處理則對3個成員的表達均起抑制作用。而光敏色素家族基因MuPhyC1作為紅光的受體基因之一，其轉錄水平受紅光的正調控，受綠光的負調控。結果表明藍光和綠光能調控隱花色素基因的表達，紅光和綠光調控光敏色素的表達，兩者通過在光形態建成中起作用乃至相互作用，進而影響植物的生長發育過程，參與光機制的建成。

3 討論

隱花色素和光敏色素家族基因在不同物種中的成員數量不同，如在擬南芥[8]中存在3個Cry成員，水稻、番茄和燕麥[3，6]中也存在至少3個Cry成員，在蘋果中也存在2個Cry成員，龍眼中存在3個Cry成員，蕨類和苔蘚[35]中亦存在至少5個Cry基因；光敏色素在蘋果、蘿卜[15]等雙子葉植物中有至少五個成員，而在香蕉、小麥、玉米[15]等單子葉植物中，目前只發現了三個成員。經過香蕉全基因組分析檢索獲得MuCry1、MuCry2a、MuCry2b和MuCry-DASH等4個具有完整CDS的Cryptochrome家族基因，分別位于6號、5號（MuCry2a、MuCry2b）和1號染色體上；同時獲得MuPhyA、MuPhyB、MuPhyC1和MuPhyC2等4個具有完整CDS的Phytochrome家族基因，分別位于1號、3號、6號和4號染色體上。生物信息學分析表明MuCrys和MuPhys均屬親水蛋白，具跨膜結構，不具信號肽，均定位于細胞核，MuCrys都含有crypt_chrom_pln保守結構域，但MuCry2a和MuCry2b無Cryptochrome-C超家族。MuCrys氨基酸末端區域PHR與光解酶的序列同源，但光解酶結合在DNA損傷部位和催化DNA修復的氨基酸殘基在隱花色素中不存在，因此除Cry-DASH外其余隱花色素雖為感光受體，但不具有光解酶的活性[2]。MuCrys和MuPhys的生物信息學分析結果與前人研究相符，故初步推斷MuCrys和MuPhys為福州野生蕉隱花色素和光敏色素，其可能參與并調控福州野生蕉光形態建成、幼苗去黃化以及蛋白互作等功能。

實時熒光定量PCR分析MuCrys和MuPhyC1在不同光質下的表達調控模式，結果表明MuCrys和MuPhyC1對不同光質響應存在差異，藍光刺激可促進MuCrys mRNA的轉錄，MuCrys都表現出積極響應藍光的特性，同時MuPhyC1正向調控紅光刺激，其mRNA的轉錄受紅光控制，作為編碼藍光受體的蛋白，MuCry2b在紅光條件下的相對表達量也較高，說明MuCry2b和MuPhyB蛋白互作進而調控光形態建成。擬南芥突變體研究表明，Cry1介導抑制擬南芥下胚軸伸長[2]；植物去黃化反應的研究發現，Cry1與PhyA和PhyB互作可以抑制種子下胚軸伸長和類黃酮生物合成[10，13，29]，促使子葉開放和改變基因表達[20]，除隱花色素外，光敏色素對藍光條件下的去黃化也起調節作用，擬南芥和番茄的研究表明藍光下PhyA和PhyB共同調節去黃化[4，8，19]，香蕉生長過程中易出現幼苗黃化現象，通過調控隱花色素和光敏色素可控制其黃化。同時藍光的磷酸化作用會因磁場變化而影響隱花色素的活性[9，27]，Ahmad等[7]認為Cry2需要在紅光下被Phy磷酸化才能完全激活，MuCrys和MuPhys均含有極其豐富的蛋白磷酸化位點，除此之外MuCrys含有其它潛在功能位點，如N-糖基化位點，蛋白酶C磷酸化位點。因此隱花色素還可能通過信號轉導、蛋白磷酸化或其他潛在功能位點等方式調控目標蛋白發揮其功能[38]。不同光質通過觸發光受體刺激其感知光信號，進而影響植物的光合特性、生長發育以及抗逆和衰老等[26，39]。香蕉生長過程中光照不足導致光合速率減緩，香蕉抗逆性降低，容易遭受一系列脅迫影響其生長發育，同時光照不足導致香蕉果實著色差，風味不佳，嚴重影響其產量和品質，因而研究隱花色素和光敏色素在香蕉光質應答以及光形態建成方面等的作用和機理顯得至關重要，其研究可以為香蕉產業增產增收增質奠定理論基礎。

參考文獻

[1] Lin C T. Blue light receptors and signal transduction[J]. Plant Cell， 2002， 14（1）： S207-S225.

[2] ZHU C L（朱春利）， ZHANG G R（張桂榮）， CAI A J（蔡愛軍）， et al. Advances in the Structure and Function of Cryptochrome in Plant[J]. Genomics and Applied Biology（基因組學與應用生物學）， 2009， 28（01）： 174-178.

[3] Li Q H， Yang H Q. Cryptochrome Signaling in Plants[J]. Photochemistry and Photobiology， 2007， 83（1）： 94-101.

[4] Todo T. Functional diversity of the DNA photolyase/blue light receptor family[J]. Mutation Research， 1999， 434（2）： 89-97.

[5] Kleine T， Lockhart P， Batschauer A. An Arabidopsis protein closely related to Synechocystis cryptochrome is targeted to organelles[J]. Plant， 2003， 35（1）： 93-103.

[6] Cashmore A R， Jarillo J A， Wu Y J， et al. Cryptochromes： blue light receptors for plants and animals[J]. Science， 1999， 284（5 415）： 760-765.

[7] Ahmad M， Cashmore A R. HY4 gene of Arabidopsis thaliana encodes a protein with characteristics of a blue-light photoreceptor[J]. Nature， 1993， 366： 162-166.

[8] Castrillo M， Bernhardt A， Batschauer A， et al. Biochemical Characterization of the DASH-Type Cryptochrome CryD from Fusarium fujikuroi[J]. Photochemistry and Photobiology， 2015， 91（6）： 1 356-1 367.

[9] YAN H（閆 海）， ZHOU B（周 波）， LI Y H（李玉花）， et al. Plant Cryptochrome and Its Light Signal Transduction[J]. Plant Physiology Communications（植物生理學通訊）， 2005， 41（6）： 841-846.

[10] KhudairA K A， Rboleda O P. Phytochrome-mediated carotenoid biosynthesis and its influence by plant hormones[J]. Physiology Plant， 1971， 10（1 111）： 8-22.

[11] Alba R， K elmenson P M， Cordonnier-Pratt M M， et al. The phytochrome gene family in tomato and rapid different evolution of this family in angiosperms[J]. Molecular Biology and Evolution， 2000， 17（3）： 362-373

[12] Lin C， Yang H， Cashmore A R， et al. Enhancement of blue-light sensitivity of Arabidopsis seedlings by a blue light receptor cryptochrome2[J]. Science， 1998， 95（5）： 2 686-2 690.

[13] Quail P H. Phytochromes： photosensory perception and signal transduction[J]. Science， 1995， 268（5 211）： 675-680.

[14] Zeng Jianxin， Wang Qiming， Lin Jianzhong， et al. Arabidopsis cryptochrome-1 restrains lateral roots growth by inhibiting auxin transport[J]. Journal of Plant Physiology， 2010， 167（8）： 670.

[15] Fankhauser C， Chory J. Light control of seeding development[J]. Plant Physiology and Plant Molecular Biology， 1997， 47（7）： 215-243.

[16] Hirose F， Shinomura T， Tanabata T， et al. Involvement of rice cryptochromes in de-etiolation responses and flowering[J]. Plant and Cell Physiology， 2006， 47（7）： 915-925.

[17] Guo H W， Yang H Y， Mockler T C， et al. Regulation of flowering time by Arabidopsis photoreceptors[J]. Science， 1998， 279（5 355）： 1 360-1 363.

[18] Somers D E， Devlin P F， Kay S A. Phytochromes and cryptochromes in the entrainment of the Arabidopsis circadian clock[J]， Science， 1998， 282： 1 488-1 490

[19] Kang C Y， Lian H L， Wang F F， et al. Cryptochromes， Phytochromes and COP1 regulate light-controlled stomatal development in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2009， 21（9）： 2 624-2 641

[20] Xu Chun xiao， Yan lu. Blue light-dependent phosphorylations of cryptochromes are affected by magnetic fields in Arabidopsis[J]. Advances in Space Research， 2014， 53（7）： 1 118-1 124.

[21] Imaizumi T， Kadota M， Wada M. Cryptochrome light signals control development to suppress auxin sensitivity in the moss Physcomitrella patens[J]. Plant Cell， 2002， 14： 373-386.

[22] Zhao X（趙 翔）， Zhao Q P（趙青平）， Yang X（楊 煦）， et al. Specificity and Crosstalk of Phototropin with Cryptochrome and Phytochrome in Regulating Hypocotyl Phototropism[J]. Chinese Bulletin of Botany（植物學報）， 2015， 50（1）： 122-132.

[23] Johnsen S， Mattern E， Ritz T. Light-dependent magnetoreception： quantum catches and opponency mechanisms of possible photosensitive molecules[J]. Experimental Biology， 2007， 210： 3 171-3 178.

[24] Danon A.， Coll N. S and Apel K. Cryptochrome-1-dependent execution of programmed cell death induced by singlet oxygen in Arabidopsis thaliana[J]. Proceeding of the National Academy of Sciences， USA， 2006， 103（45）： 17 036-17 041.

[25] Wang Q， Zuo Z C， Lin C T， et al. Photoactivation and inactivation of Arabidopsis cryptochrome2[J]. Science， 354（6310）： 343-347.

[26] Briggs W R， Olney M A. Photoreceptors in plant photomorpho genesis to date five phytochromes， two cryptochromes， one phototropin， and one superchrome[J]. Plant Physiology， 2001， 1（125）： 85-88.

[27] Casal J J， Miguel L D， Burgin M J. Antagonistic action of low-fluence and high-irradiance modes of response of phytochrome on germination and β-mannanase activity in Datura ferox seed[J]. Journal of Experimental Botany， 2000， 51（347）： 1 127-1 133.

[28] Sharrock R A， Lissemore J L， Quail P H. Nucleotide and amino acid sequence of a Cucurbita phytochrome cDNA clone， identification of conserved features by comparision with Aveda phytochrome[J]. Gene， 1986， 47（2-3）： 287-95.

[29] Yang H Q， Wu Y J， Tang R H， et al. The C termini of Arabidopsis cryptochromes mediate a constitutive light response[J]. Cell， 2000， 103（5）： 815-827.

[30] Lai Z X（賴鐘雄）， Chen Y（陳 源）， Lin Y L（林玉玲）， et al. Discovery and taxonomy of wild banana （Musa spp.， ‘AA Group）in Fuzhou[J]. Subtropical Agriculture Research（亞熱帶農業研究）， 2007， 3（1）： 1-5（in China）.

[31] 張 銳.福建野生蕉資源RAPD分析、離體培養與SOD基因克隆[D].福州： 福建農林大學， 2011.

[32] Chen L， Zhong H Y， Kuang J F， et al. Validation of reference genes for quantitative RT-qPCR studies of gene expression in banana fruit under different experimental conditions[J]. BMC Research Notes， 2011， 234（2）： 377-390.

[33] Feng X（馮 新）， Xu L（徐 蕾）， Lai G T（賴恭梯）， et al. Clone and Expression Analysis under Cold Stress of FeSOD Family Genes from the Wild Banana in Fuzhou[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica（西北植物學報）， 2015， 35（5）： 853-864.

[34] Vandesompele J， D E Preter K， Pattyn F， et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biology， 2002， 3（7）： 31-34.

[35] Small D G， Min B， Lefebvre P A. Characterization of a Chlamydomonas reingardtii gene encoding a protein of the DNA photolyase/blue light photoreceptor family[J]. Plant Molecular Biology， 1995， 28（3）： 443-454.

[36] Jiao Y， Lau S O， Deng X W. Light-regulated transcriptional networks in higher plants[J]. Nature Reviews Genetics， 2007， 8： 217-230.

[37] Toth R， Kevei E， Hall A， et al. Circadian clock-regulated expression of phytochrome and cryptochrome genes in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2001， 127（4）： 1 607-1 616.

[38] Wang X Q， Huang W D. Effects of Weak Light on the Ultmstructural Variatiom of Phloem Tissues in Source Leaves of Three-Year-Old Nectarine Trees[J]. Journal of Integrative Plant Biology（植物學報）， 2003， 45（6）： 688-697.

[39] Franklin K A， Davis S J. Mutant analyses define multiple roles for phytochromes C in Arabidopsis thaliana photo-morphogenesis[J]. Plant Cell， 2003， 21（15）： 981-1 989.