橡膠樹膠胞炭疽菌T—900突變體生物學研究及其假定基因LV1敲除載體構建

鄭肖蘭 李秋潔 鄭行愷 劉先寶 李博勛 時濤 黃貴修

摘 要 從構建的橡膠樹膠孢炭疽菌RC178（Colletotrichum gloeosporioides）突變體庫中篩選獲得一株致病力明顯減弱突變體T-900，與野生菌株相比其菌落生長速率、產孢能力，孢子萌發率及附著孢形成率均明顯降低。通過對突變菌株T-900 T-DNA側翼序列克隆、比對和基因預測結果表明外源片段的插入破壞了一個預測基因的功能，該基因和組蛋白H3同源性為99%，暫命名為LV1。通過同源臂克隆構建了該基因敲除載體900-1A-900-1B-pCT74，為進一步研究該基因在病原菌致病過程中的作用機理提供了基礎。

關鍵詞 膠孢炭疽菌；T-900；生物學特性；基因敲除載體；轉化與再生

中圖分類號 S432.1 文獻標識碼 A

Abstract A mutant strain T-900 with weakened virulence to rubber trees was obtained from T-DNA insertion mutation library， and the conidia sporulation rate， spore germination and appressorium formation rate of T-900 were significantly lower than the wild-type stain RC178. The T-DNA flanking sequence of T-900 was obtained by TAIL-PCR and compared with the whole genome of C. gloeosporioides by sequence alignment. The results showed that the sequence in which the T-DNA was inserted contains a gene that was designated as LV1， The gene and histone H3 homology were 99%. In order to study the function of the pathogenicity gene LV1， The gene knockout vector 900-1A-900-1B-pCT74 was successfully constructed by homologous cloning and restriction endonuclease digestion. This method was successfully used to construct a high efficient gene knockout system of LV1， which provides a technical platform for the functional verification of the pathogenic genes of Colletotrichum gloeosporioides.

Key words Colletotrichum gloeosporioides； biological characteristics； T-900； gene knockout vector； transformation and regeneration

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.022

天然橡膠是一種世界性重要工業原料和重要戰略物資[1-3]。蔡志英、孫董董等發現由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）侵染引起的炭疽病是橡膠生產中常發的重要葉部病害，產量損失巨大[3-5]。劉艷等[6]發現膠孢炭疽菌幾乎可以在所有作物上引起炭疽病害，造成嚴重的經濟損失。

由于炭疽病寄主范圍廣、傳播途徑多、存活時間長、生理小種變異多等，蔡志英等發現炭疽病一旦大面積發病后很難利用藥劑進行防治[7-8]。培育和推廣抗病品種是一種經濟、安全、有效的措施，但多年來，利用常規育種方式很難得到對炭疽病菌耐病或高抗的品種[9]。所以目前從分子方面研究其致病基因顯得尤為重要，通過對炭疽菌分子致病機制的研究，希望能為病害的防治和品種抗病性的保持提供新的思路和途徑[1，9]。許多真菌包括膠胞炭疽菌的大規模測序工作為人們提供了大量的EST序列、ITS序列、全基因組序列等信息，其中大部分基因仍然是功能未知基因，通過現有數據庫進行序列比對分析僅能預測出其假設功能，而利用基因敲除方法可為研究基因功能提供最直接有利的證據[10-11]。

基因敲除是研究基因功能最具說服力的分子遺傳操作方法之一，是指對一個結構已知但功能未知的基因，從分子水平上設計一系列實驗，將該基因去除，然后從整體觀察突變體的表型性狀，通過分析突變體表型而明確基因功能的方法[9，12]。筆者研究團隊已經獲得農桿菌介導的遺傳轉化體系在膠孢炭疽菌成功應用，獲得1個致病相關突變體T-900，生物學特性研究發現其與野生型菌株RC178存在明顯差異，對其插入位點基因擬命名為LV1。為了研究假設基因LV1的功能，目前迫切需要一個十分高效的基因敲除策略來研究各個基因對于致病性和次級代謝物方面的影響。本實驗將潮霉素標記技術引入到炭疽菌基因敲除載體中。利用該載體，篩選在潮霉素選擇壓力下能正常生長的轉化子，提高轉化子的篩選效率。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：橡膠樹膠孢炭疽菌T-DNA插入突變體（T-900）及其野生型菌株RC178均由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所保存；突變體T-900致病力明顯減弱，且T-DNA單拷貝。

主要試劑：潮霉素B（Roch）、Tap酶（北京天根生物公司）、T4 DNA連接酶（大連寶生物）、溶壁酶（廣東碧德）、氨芐青霉素（Solarbio）、PEG3350（Sigama）、膠回收試劑盒和PCR回收試劑盒（Omega）等。

培養基：MM培養基、CM培養基、LR培養基等配置方法參照蔡志英博士論文[1]。

1.2 方法

1.2.1 突變菌株T-900的生物學性狀分析 膠孢炭疽菌突變菌株T-900致病力測定：參照劉艷的方法[6]；菌落形態及生長速率測定方法參照鄭肖蘭論文[13]；產孢量及孢子形態測定方法、孢子萌發率和附著胞形成率的觀察方法參照劉艷論文[6]。

1.2.2 突變菌株T-900的T-DNA測定分子檢測

原理是依據T-DNA（其中包含1個潮霉素及其啟動子的片段，插入結構如圖1）隨機插入到炭疽菌野生型RC178 DNA中，具體方法參照劉艷論文[14]。檢測所用hph通用引物為Hf：5′-GGTAATGGT AACGCCATGCTCCTT-3′，Hr：5′-CCATTACTGCA ACACTCGAGGCT-3′，以RC178、T-900和AGL-PT的基因組為模板進行PCR檢測。

1.2.3 突變菌株T-900 T-DNA側翼序列的克隆

采用TAIL-PCR[1]方法擴增T-900的側翼序列，所采用的簡并引物及其結構圖和位置參照文獻[15]及劉艷[14]。

1.2.4 酶切法構建LV1基因敲除載體 傳統酶切法構建LV1載體示意圖見圖2。

（1）同源臂克隆與含酶切位點上下游片段的獲得。通過T-900的側翼序列所在膠胞炭疽菌全基因組中獲取預測基因LV1，并在基因LV1開放閱讀框外兩側各取1 000 bp左右的片段作為LV1基因兩個同源臂A，B（記為T-900-1A、T-900-1B）的備選區域，并對其進行酶切位點分析，同時結合pCT74載體上潮霉素抗性基因兩端的酶切位點選擇同源臂兩端合適的酶切位點。

基因LV1同源A臂5的酶切位點為ApaI，3端酶切位點為Xhol，B臂5端酶切位點為EcoRI，3端酶切位點為SacI，根據選擇的酶切位點和同源臂備選區的序列，設計引物如下：

A臂：T-900-1A-F： CGGGCCCCCTGTGTCTTT GCGTTTGG ApaI

T-900-1A-R： CCCTCGAG GGAGTGATTGTGT GCCAGAC Xhol

B臂：T-900-1B-F：CGGAATTC TTCTTCTCC TTCAAAGACAAGC EcoRI

T-900-1B-R：CGAGCTC GCGTAGTCAAGAC AATACAAGA SacI

以橡膠樹炭疽菌野生型RC178的基因組DNA為模板，擴增待敲除基因LV1上下游的AB臂。擴增到預期的目的條帶后分別命名為：900-1A、900-1B。

將900-1A和900-1B PCR產物膠回收，回收產物連接到pMD-18T載體上，轉化大腸桿菌。菌落PCR驗證轉化成功，挑取轉化成功的大腸桿菌，搖菌過夜培養，菌液用于提取質粒送測序。經測序獲得上下游基因正確的質粒，分別命名為：900-1A-T、900-1B-T；用于下步實驗的雙酶切。

（2）900-1A-T連接至載體pCT74。用ApaI和Xhol酶對900-1A-T、pCT74進行雙酶切，酶切產物進行膠回收，將回收得到的產物連接至pCT74。然后將連接后含有目的片段pCT74轉化至大腸桿菌，過夜培養，提取質粒后用ApaI和Xhol酶雙酶切鑒定。鑒定正確的質粒命名為900-1A-pCT74。

（3）900-1B-T連接至載體900-1A-pCT74。用EcoRI和SacI酶對900-1B-T，900-1A-pCT74進行雙酶切，酶切產物進行膠回收，將回收得到的900-1B連接至900-1A-pCT74。將連接后含有目的片段900-1A-pCT74轉化至大腸桿菌，過夜培養，提取質粒后用EcoRI和SacI酶雙酶切鑒定。鑒定正確的質粒命名為900-1A-900-1B-pCT74，即為LV1基因的敲除載體。

（4）結合上述酶切法驗證后，將用相應的酶也能獲得預測大小相等的目的片段載體送測序，利用序列正確進行再次驗證。

用ApaI和SacI酶雙酶切900-1A-900-1B-pCT74，獲得的目的片段用于原生質體轉化。

1.2.5 原生質體的制備、原生質體轉化與再生

具體方法參照蔡志英[1]。

1.3 數據分析

采用SAS9.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 突變菌株T-900的生物學性狀分析

2.1.1 T-900 致病性測定結果 致病性測定發現：接種后第5天觀察，結果如圖3：空白對照基本沒有產生病斑，僅僅是培養基的印痕；T-900發病輕，病斑小；RC178則發病嚴重，病斑大。

2.1.2 T-900與RC178生長速率測試結果 由圖4得知，RC178平均生長速率為（0.933±0.003） cm/d，而T-900則為（0.503±0.011） cm/d，明顯低于野生型RC178，由此推測，菌落生長速率的減弱可能是由于T-DNA插入導致突變體代謝紊亂造成的。

2.1.3 T-900與RC178產孢量的測定及分生孢子大小觀察結果 橡膠樹炭疽菌主要是通過分生孢子侵染為害橡膠樹，因此，產孢量的多少勢必對其致病性起著舉足輕重影響。從圖5-A可見，T-900產孢量與RC178產孢量方差分析結果顯示，在產孢能力上存在極顯著差異。

通過顯微鏡觀察并對分生孢子大小進行測量發現（圖5-B），突變體T-900分生孢子形態與RC178相比，也存在變異。野生型RC178菌株分生孢子大小為（14.41±0.34） μm × （4.03±0.07） μm，長柱型或長圓型，表面光滑，兩端鈍圓。而T-900分生孢子大小為（10.27±0.31） μm × （5.09±0.08） μm，較短粗，呈橢圓形或短棍棒形。方差分析結果顯示，突變體T-900分生孢子長度與野生型RC178差異顯著。

2.1.4 T-900與RC178分生孢子萌發及附著孢形成觀察結果 分生孢子萌發及附著胞形成是炭疽菌侵染寄主過程中非常關鍵的一步，分生孢子萌發產生附著胞才有可能再分化出一系列侵染結構侵染寄主，因此較低的萌發率或者附著胞形成率同樣可能是致病性降低或者喪失的原因之一。統計了T-900與野生型RC178的萌發率和附著胞形成率：其中孢子萌發率分別為32.00%、86.00%；而附著胞形成率則分別為28.00%、80.00%，相比較均存在顯著差異（圖6）。

2.2 突變菌株T-900的T-DNA分子檢測結果

從圖7可知，參試菌株T-900和含有載體質粒AGL-PT的PCR檢測結果發現均可擴增到約800 bp的潮霉素片段，而陰性對照野生型菌株RC178和空白對照則沒有任何條帶。表明參試的突變體基因組中確實插入了潮霉素磷酸轉移酶基因hph。

2.3 突變菌株T-900 T-DNA側翼序列克隆結果

參試簡并引物AD004在T-900右邊界擴增到特異條帶，從圖8-A可見，第3輪擴增的特異條帶比第2輪的小，與理論擴增結果吻合。將PCR產物送樣測序結果見圖9。序列在NCBI上進行比對，結果如圖8-B，與Conocephalum supradecompositum，Colletotrichum alienum，Colletotrichum ignotum的H3 gene相似性為99%，據此初步推測該T-DNA 插入位點相關基因為組蛋白H3相關基因。

2.4 酶切法構建LV1基因敲除載體

2.4.1 同源臂的克隆與含酶切位點的上下游片段的獲得 同源臂的克隆和同源臂的PCR擴增結果如圖10，泳道1、2均擴增到預期的目的條帶分別命名為：900-1A、900-1B。對900-1A、900-1B的PCR擴增產物進行膠回收、轉化、克隆、測序，測序獲得上下游基因正確的質粒，分別命名為：900-1A-T、900-1B-T，用于下步實驗的雙酶切。

2.4.2 900-1A-T連接至載體pCT74 用ApaI和Xhol酶對900-1A-T、pCT74進行雙酶切，結果獲得預測的目的片段，見圖11-A，此外酶切產物進行膠回收，回收得到的產物連接至質粒pCT74。將連接后含有目的片段pCT74轉化至大腸桿菌，過夜培養，提取質粒后再使用ApaI和Xhol酶雙酶切鑒定，結果見圖11-B。酶切檢測目的片斷大小與預測一致的質粒送測序，鑒定正確的質粒命名為900-1A-pCT74。

2.4.3 900-1B-T連接至載體900-1A-pCT74 利用EcoRI和SacI對900-1B-T、900-1A-pCT74進行雙酶切，酶切產物進行膠回收，將回收得到的900-1B連接至900-1A-pCT74。將連接后含有目的片段900-1A-pCT74轉化至大腸桿菌，過夜培養，提取質粒后用EcoRI和SacI酶雙酶切鑒定。經鑒定正確的質粒命名為900-1A-900-1B-pCT74，即為LV1基因的敲除載體（圖12）。

2.4.4 驗證 將載體送去測序，測序結果表明：900-1A-900-1B-pCT74同源上、下臂插入的方向正確，序列正確，證明LV1敲除載體構建成功。

利用ApaI和SacI酶雙酶切900-1A-900-1B-pCT74后，獲得的目的片段用于原生質體轉化。

2.5 原生質體的制備

通過炭疽菌野生型菌株RC178孢子在CM液體培養基中的培養，以及溶壁酶的酶解，最終用1.2×STC溶液把原生質體濃度調整為1×107～3×107個/mL，獲得的原生體質體形態完整、呈球形、大小比較均一、未破裂，符合原生質體轉化的要求（圖13）。

2.6 原生質體轉化與再生

原生質體轉化處理后取200 μL均勻涂抹于SR培養基平板上，培養5 d后，在SR培養基上長出多個菌落，有些菌落菌絲稀薄透明，無氣生菌絲，有些菌落，相對較小，菌絲透明，但不能擴散，這類不能擴散的菌落一般認為是沒有轉化成功的野生型菌株。挑取能擴散的單菌落轉接到潮霉素濃度為250 μg/mL的SR培養基，5 d后，挑取正常生長的菌落，在含有350 μg/mL的SR培養基進行復篩。最終獲得LV1疑似突變菌株18個。其中未轉化成功的轉化子和RC178在含潮霉素（350 μg/mL）的培養基上培養5 d未長出菌落（圖14）。

3 討論

目前已經進入后基因組時代， 基因功能研究勢必越來越受重視， 通過基因的改造和干預進行控制植物病害， 相關基因的功能研究是必經階段。基因敲除技術是20世紀80年代后期發展起來的特異性敲除特定基因的技術，該技術定位性強， 是一種理想的修飾改造生物遺傳物質的方法， 使人們有可能真正按自己的設想去改造生物的遺傳物質， 并能穩定遺傳， 具有其他研究方法無法替代的作用， 在基礎研究和實際應用中都有著廣闊的前景[16]。目前對病原真菌膠胞炭疽菌的分子機制研究還相當薄弱，利用基因敲除篩選鑒定膠胞炭疽菌致病相關基因對其致病機制的研究及闡明相當重要。而基因敲除轉化子的篩選是研究真菌基因敲除的關鍵點。本研究首先通過T-DNA插入突變技術構建了一個含有啟動子潮霉素標記的農桿菌載體對膠胞炭疽菌野生型菌株RC178進行隨機插入突變，獲得了致病力明顯減弱突變菌株T-900，并對該菌株進行了系列生物學特性研究，結果發現T-900與RC178相比較致病力、生長速率、產孢量、孢子萌發率和附著胞形成率均明顯下降，據此推測T-DNA隨機插入突變菌株T-900其插入位點相關基因LV1與其致病力等生物學特性表型相關，為了進一步研究該插入位點基因LV1的功能，很有必要通過對野生型菌株RC178敲除LV1進行驗證，因此本研究通過傳統酶切法成功構建該基因的敲除載體。本研究在構建的基因敲除載體中導入質粒pCT74，其含有1個潮霉素hygB抗性基因，使基因敲除轉化子獲得潮霉素抗性，通過潮霉素培養基的篩選，可直接獲得基因敲除轉化子。在目前研究中，有關優化轉化子篩選的報道較少，其中劉曉妹[17]將含全部編碼序列的CCK1毒素基因片段克隆在pMD18-T載體的克隆位點上，經酶切后反向插入潮霉素hygB基因，成功構建了CCK1毒素基因敲除載體。毛建才等[9]在一種新的大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）基因敲除載體的構建中成功構建了一個攜帶GFP篩選標記的大麗輪枝菌敲除載體，使隨機插入轉化子在熒光顯微鏡下呈現綠色，而敲除轉化子在熒光顯微鏡下不呈現綠色。由于該技術必須單孢分離后才能獲得純正的基因敲除轉化子，相對來說也增加了大量的工作量；王曉亮[18]通過使用 USER酶克隆技術，在hph基因兩側引入USER酶特異位點，構建了一系列用于禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum Schwabe）基因敲除和熒光融合蛋白表達的基因敲除載體pKH-KO。但在實際操作過程中發現，不同基因重疊 PCR條件差異較大，經常出現重疊失敗或者重疊擴增效率低、產物量少，不足以進行下一步轉化的情況，摸索最佳條件往往花費很長時間。安樂等[19]利用根癌農桿菌介導真菌遺傳轉化方法進行核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary]交配型基因mat1-1敲除載體構建。此外Zeilinger[20]利用傳統的PEG介導方法對深綠木霉（Trichoderma atroviride）進行轉化，同源重組的頻率很低，而利用農桿菌介導轉化法獲得了60%的同源重組轉化子，成功實現了對tmkl和tga3基因非編碼區的基因破壞[20]。而本方法所采用的全部是最基礎的分子生物學實驗技術，成功率高，更易于上手操作。雖然成功獲得假定基因LV1敲除載體，但如果能把LV1基因與綠色熒光蛋白基因融合后再導入T-900和LV1缺失株中，通過熒光檢測LV1基因的初步表達位置及表達量（有些基因在菌絲表達，有些基因在分生孢子表達，有些在細胞壁表達，有些在細胞核表達），并通過比較T-900和LV1缺失株中及野生型菌株RC178的基因表達差異，分析差異表達基因功能，以便更深入地了解到LV1基因的作用機制。

本試驗利用反向遺傳學的手段，應用傳統酶切法構建了橡膠樹膠孢炭疽菌T-900突變體的致病相關基因LV1敲除載體，以期通過同源重組策略敲除橡膠樹膠孢炭疽菌野生型菌株RC178的LV1基因，為進一步研究該基因的功能及其他相關基因的研究奠定了基礎，結果還發現這種方法對于在實驗室條件下進行炭疽菌基因敲除和蛋白定位等基因功能的研究有著很大的應用前景。

參考文獻

[1] 蔡志英. 橡膠樹膠孢炭疽菌突變體庫的構建及其CgATPase基因功能分析[D]. 海口： 海南大學， 2013.

[2] 許海平， 傅國華. 我國天然橡膠產業發展趨勢[J]. 中國熱帶農業， 2007（2）： 15-16.

[3] 孫董董. 橡膠樹膠孢炭疽菌P型ATP酶基因的克隆及其與致病相關性分析[D]. 海口： 海南大學， 2015.

[4] 崔昌華. 橡膠老葉炭疽病病原菌的生物學，對藥物的敏感性及ITS序列分析[D]. 儋州： 華南熱帶農業大學， 2006.

[5] 蔡志英， 黃貴修. 巴西橡膠樹炭疽病研究進展[J]. 西南林業大學學報， 2011， 31（1）： 89-93.

[6] 劉 艷， 賀春萍， 易克賢， 等. 橡膠炭疽病菌致病相關突變體的篩選及表型分析[J]. 熱帶作物學報， 2014， 35（11）： 2 278- 2 283.

[7] 蔡志英， 李加智， 王進強， 等. 橡膠膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌對殺菌劑的敏感性測定[J]. 云南農業大學學報， 2008， 23（6）： 787 -790.

[8] 蔡志英， 林春花， 翟李剛， 等. 橡膠樹重要品系對膠孢炭疽菌抗性評價[J]. 植物保護， 2013， 39（6）： 110-115.

[9] 毛建才， 張 婷， 高 云， 等. 一種新的大麗輪枝菌基因敲除載體的構建[J]. 新疆農業科學， 2015（10）： 1 878-1 883.

[10] Frandsen R J， Frandsen M， Giese H. Targeted gene replacement in fungal pathogens via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation[J]. Methods in Molecular Biology， 2012， 835： 17-45.

[11] Santhanam P. Random insertional mutagenesis in fungal genomes to identify virulence factors[J]. Methods in Molecular Biology， 2012， 835： 509-517.

[12] Vasquez K M， Marburger K， Intody Z， et al. Manipulating the mammalian genome by homologous recombination[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2001， 98（15）： 8 403-8 410.

[13] 鄭肖蘭， 賀春萍， 高亞男， 等. 咖啡炭疽病菌生物學特性及其毒力測定[J]. 熱帶農業科學， 2015（12）： 94-98， 102.

[14] 劉 艷. 橡膠炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）致病相關突變體表型分析及插入位點定位[D]. 海口： 海南大學， 2010.

[15] Mullins E D， ChenX， Romaine P， et al. Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum： an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer[J]. The American Phytopathological Society， 2001， 91（2）： 173-180.

[16] 王維蘭， 孫立軍， 陳喜文， 等. MIBP1基因敲除載體的構建[J]. 天津醫藥， 2007（10）： 755-757.

[17] 劉曉妹. 巴西橡膠樹棒孢霉落葉病病菌MAPK基因（CCK1）和毒素基因（ct）克隆與功能鑒定[D]. 海口： 海南大學， 2012.

[18] 王曉亮， 張 昊， 潘 逸， 等. 適用于鐮刀菌基因敲除和熒光融合蛋白表達的高效通用載體的構建[J]. 植物保護， 2014（3）： 106-112.

[19] 安 樂， 趙文生， 張世宏， 等. 核盤菌交配型基因mat1-1敲除載體的構建及轉化[J]. 吉林大學學報（理學版）， 2010（1）： 140-145.

[20] Zeilinger S. Gene disruption in Trichoderma atroviride via robacterium-mediated transformation[J]. Curr Genet， 2004， 45（1）： 54-60.