1株拮抗細菌的分離鑒定及其對香蕉枯萎病等病原菌的抑制活性測定

張妙宜 陳志杰 陳宇豐 馮仁軍 高祝芬 張錫炎

摘 要 為了增加生防制劑的有效成分來源，從食物黃豆醬中分離篩選得到4株拮抗細菌，以香蕉枯萎病為指示菌，采用平板對峙法測定菌株抑菌譜，獲得1株具有穩定抑制活性的拮抗細菌。通過鑒定菌株的形態特征、生理生化特性及16S rDNA基因序列比對分析，初步確定該拮抗菌株Y-4是解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），并測定在不同狀態和處理操作下菌株的抑制活性。結果表明：菌株Y-4對香蕉枯萎病等12種病原真菌均有較強抑制活性，抑菌率為53.33%～86.67%。其中對香蕉枯萎病菌4號小種病原菌的抑菌率為63.33%，其發酵液也具有一定抑菌活性，對粗蛋白進行不同濃度活性測定，在2 000 μg/mL時對香蕉枯萎病菌4號小種的抑制效果最佳。乙醇萃取物對峙12種病原真菌的抑菌率最高達70%。從食物中分離出的菌株Y-4具有穩定的抑菌活性，為香蕉枯萎病生防制劑的研制拓展新的研究領域。

關鍵詞 甲基營養型芽胞桿菌；拮抗；生防制劑；廣譜

中圖分類號 S432.4 文獻標識碼 A

Abstract In order to increase the effective component of the Biocontrol Medicament， four antagonistic bacteria were isolated from the food of soybean paste in this article. The method of tablet confrontation was used to determine the bacterial strain of the bacterium， and to obtain a resistant bacteria with stable inhibitory activity.Preliminary identification of strain Y-4 was Bacillus amyloliquefaciens through the observation of morphology， and the analysis of physiological and biochemical characteristics， and 16S rDNA sequence. Measuring the different state and operation in the inhibition activity of the strain. The results showed：The strain of Y-4 had strong inhibiting activity in 12 Pathogenic fungus， such as Fusarium oxysporum f. sp. cubense， The bacteriostatic rate was 53.33%～86.67%. Among them， the bacteriostatic rate of Fusarium oxysporum f. sp. cubense was 63.33%， the Fermentation liquid has certain bacteriostas was activity. Performed the Inhibition effect to different concentrations of crude protein， and the inhibition effect to Fusarium oxysporum f. sp. cubense was the best in 2 000 mg/mL. The antibacterial rate of the twelve pathogenic fungi was up to 70% with Ethanol extract. The strain of Y-4 was isolated from the food had stable bacteriostatic activity， to develop new research fields for the Biocontrol Medicament of Fusarium oxysporum f. sp. cubense.

Key words Bacillus methylotrophicus； antagonism； biocontrol medicament；broad spectrum

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.025

香蕉（Musa nana Lour）系芭蕉科芭蕉屬大型草本植物，主要產區分布于南北緯20°之間，收獲期長。果實屬漿果類，富含多種微生物及維生素，被譽為“上蒼賜予人類的保健佳果”[1]。目前，全球種植香蕉國家及地區有130個，大多為發展中國家。據聯合國糧食及農業組織（FAO）數據顯示，2000～2014年全球香蕉產量從0.66億t增至1.062億t，其中亞洲地區香蕉產量占全球的54.1%[2]。雖然全球香蕉總產量呈現穩步遞增的趨勢，但“大面積、大產量”下引發的香蕉枯萎病病害防治仍是世界性的研究課題。

1874年，人們首次在澳大利亞發現由鐮刀菌侵染維管束引起的香蕉枯萎病，俗稱“黃葉病”[3]，這種病害會使蕉苗、流水、土壤、農具等帶病，一旦蔓延很難得到控制。全球報道的香蕉鐮刀菌枯萎病菌有1、2、3、4號4個生理小種，其中4號小種主要分布于澳大利亞、非洲和部分亞洲國家，危害品種種類十分廣泛，對所有香蕉和對其他小種有抗性的香牙蕉都有感染性，毀滅性最強，引發全球各香蕉產出國的廣泛關注與重視[4]。

為了應對香蕉枯萎病病害肆虐，多使用化學防治和生物防治等方法保護香蕉。雖然化學防治在一定條件下能快速控制病害，但長期使用化學農藥不僅會使病原菌產生抗藥性，還會破壞土壤活性，致使生態環境失衡。隨著農業可持續發展觀念的強化，生物防治得到廣泛推廣，利用種群間的相互作用抑制病原菌生長，既減少環境污染，又能持續控災，成本也相對較低。鐮刀菌枯萎病菌從根部侵入，產生毒素使維管束壞死，在植株死后隨殘體混入土壤，可在土壤中存活20年之久，是一種土壤習居菌，高溫多濕天氣更易使植株染病、災情蔓延[5]，所以研制預防控制這種土傳病害微生物制劑成為當今枯萎病防控課題的重要方向。

目前用以防治香蕉枯萎病病害的生物制劑有效成分種類有：假單胞桿菌、芽胞桿菌、木霉菌、放線菌。其中芽胞桿菌對外界有害因子具有強抵抗力，分布于土壤、水、空氣等處，開發潛力大、適用性廣。利用生物技術選育具有特定強勢拮抗功能的菌株能為防治植物病蟲害、活化土壤養分做出突出貢獻。Johnson等[6]首次在枯草芽胞桿菌分離出抑菌物質，引起越來越多的國內外學者關注與研究，并從不同芽胞桿菌中分離得到抑菌蛋白類等抑菌物質。2007年解淀粉芽胞桿菌FZB42全基因組測序的完成也使人們對芽胞桿菌的多次生代謝物生產功能有了更加深刻的認識，這對解淀粉芽胞桿菌在生物防治上的利用具有階段性突破[7]。李玉洋等[8]從棉花根際土壤中分離得到1株對尖孢鐮刀菌防效率達65.19%的解淀粉芽胞桿菌SN06，黃建鳳等[9]則從發病蕉園的健康香蕉根際分離篩選獲得1株解淀粉芽胞桿菌菌株H-7，對香蕉枯萎病的生防效率可達53.0%。多年來的研究報道表明，生物制劑的有效成分來源多種多樣，本研究通過分離篩選黃豆醬中的微生物，發現菌株Y-4在不同狀態和處理下對多種常見病原菌均有穩定抑制活性，為香蕉枯萎病防治難題提供有利理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試拮抗菌株Y-4：由筆者購自大潤發超市的海天黃豆醬中分離得到；供試病原真菌：共12種（表1），均保藏于筆者所在研究組；培養基：固體PDA培養基、固體LB培養基、液體LB培養基。

1.2 方法

1.2.1 拮抗細菌的分離篩選與拮抗能力評估 取10 g黃豆醬樣品放入90 mL無菌水中，充分攪拌均勻后，在無菌操作條件下，配制濃度梯度為10-4、10-5、10-6的懸浮液，各吸取100 μL滴加于LB培養基上，用三角型玻棒涂布平板法涂布均勻，每個梯度設3個重復，常溫下倒置培養1～3 d，觀察細菌菌落形態特征。用多次劃線將挑取到的特征相異的單菌落純化至純培養。

以香蕉枯萎病菌4號小種為指示菌，在PDA培養基中間接入直徑為5 mm的病原菌菌絲塊，將篩選得到的純菌株活化后平行對稱接種到平板中心距邊緣25 mm處，每個平板接4處，設3個重復，常溫下培養72 h，觀察測量其抑菌圈，挑取抑菌效果好的菌株保存至LB培養基上擴大培養。

采用平板對峙培養法測定菌株對病原真菌的抑制活性，以其他11個病原菌為靶標菌株。方法同上，并以只接病原菌為對照，常溫下培養3～7 d至對照平板長滿菌絲，用十字交叉法測量靶標菌落大小和該細菌與各病原菌之間的抑菌帶寬度，計算抑菌率，評估細菌拮抗能力的大小。抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%，抑菌帶寬度=（抑菌帶外徑的平均值-試樣直徑）/2（下同）。

1.2.2 拮抗細菌的分類鑒定 活化菌株并采用革蘭氏染色法觀察其形態和培養特征，然后參考《常見細菌鑒定手冊》[10]、《伯杰氏細菌鑒定手冊》[11]對菌株進行生理生化鑒定。

菌株16S rDNA序列測定及系統發育樹構建：選用16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCC TG-GCTCAG-3′），1492R（5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′）[12]對菌株進行PCR擴增（表2）。

4 ℃下保存擴增處理后DNA樣品，用1%瓊脂糖凝膠電泳預檢測后送華大基因純化測序，雙向測通拼接后在GenBank進行Blast相似序列比對，在MEGA5.05中以鄰接法（Neighbor Joining method[13]）選取相似度較高的模式菌株作為參比對象，進行系統發育樹構建與分析。

1.2.3 不同處理發酵液抑菌活性測定 發酵液原液制備：將純化的菌株Y-4采用平板劃線法在LB培養基上劃線，置于常溫下培養24 h，挑取單菌落接種于LB液體培養基中，放置在搖床上200 r/min 充分震蕩3 d。得到發酵液原液。

發酵液上清液提取：將500 mL發酵液原液分裝于50 mL離心管中，常溫下12 000 r/min離心30 min，棄沉淀保留上清，再用孔徑0.22 μm的過濾器除菌，4 ℃保存，備用。

硫酸銨處理上清液提取：將1 000 mL發酵液原液置于離心機中 4 ℃、8 000 r/min離心40 min，取上清，緩慢加入430 g硫酸銨，并邊攪拌調整至 65%溶液飽和度，4 ℃靜置24 h。分裝后置于離心機中4 ℃、8 000 r/min離心40 min，分別收集上清液及沉淀。上清液用細菌過濾器除菌，得到硫酸銨處理上清液，沉淀待用。

發酵液粗蛋白液提取：上步驟得到的沉淀用少量10 mmol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）溶解，置于透析袋中，用同一濃度PBS緩沖液4 ℃過夜透析除鹽后分成等量的兩份，一份用細菌過濾器除菌，即為發酵液粗蛋白液；另一份經真空冷凍干燥技術脫水為粗蛋白干粉，加入無菌水配制成20 mg/mL粗蛋白溶液，待用于濃度定量后進行不同粗蛋白濃度抑菌試驗。將粗蛋白溶液制備成62.5、125、250、500、1 000和2 000 μg/mL的稀釋液并過濾，備用。

發酵液乙醇萃取物提取：向發酵液原液中加入等體積的95%乙醇，浸泡3 d。于50 ℃旋蒸除去乙醇溶劑，再加入無菌水進行溶解，過濾器除菌，備用。

發酵液處理液的抑菌活性測定：以無菌水為對照，采用平板打孔抑菌試驗分別測定發酵液上清液、硫酸銨處理上清液、發酵液粗蛋白液、發酵液乙醇萃取物的抑菌活性。在PDA平板中心距邊緣25 mm處用孔徑7 mm的打孔器進行打孔，每孔加入100 μL發酵液處理液，每個處理重復3次，平板中心位置加入病原真菌。常溫下培養待對照平板長滿真菌后測定各發酵液處理液的抑菌率和測定不同濃度梯度的粗蛋白溶液的抑菌帶寬度。

1.3 數據處理

采用Excel 2007、SAS9.1統計軟件和單因素方差分析統計[14]進行數據分析比較。運用Duncan氏新復極差法進行各處理間的差異顯著性對比。

2 結果與分析

2.1 拮抗細菌的篩選與抑譜測定

本研究使用涂布劃線分離法從黃豆醬樣品中純化得到52株菌，經過篩選、拮抗評估等步驟得到4株活性較好的拮抗細菌，分別編號為Y-1、Y-2、Y-3、Y-4，挑取抑菌效果最為明顯的菌株Y-4為研究對象進行菌株形態觀察、生理生化鑒定、抑菌譜測定，結果表明菌株Y-4對12種供試病原真菌抑制效果在53.33%～86.67%之間（表3），具較為廣泛的抑菌譜（圖1），其中對香蕉枯萎病菌4號小種的抑菌率達63.33%，穩定性最佳，為現階段枯萎病防治難題及微生物領域的廣譜生防制劑研究提供基礎依據。

2.2 菌株Y-4鑒定

形態特征及培養特征：菌株Y-4在LB平板培養基上生長狀況良好，室溫下培養2 d，菌落直徑在2～6 mm之間，形狀不規則、縱剖面隆起，邊緣呈不齊整波狀，表面褶皺干燥，顏色為淺黃色不透明，革蘭氏陽性菌，好氧，芽胞呈短小卵圓形。

生理生化鑒定：菌株Y-4能水解淀粉，接觸酶、乙酰甲基甲醇、硝酸鹽還原試驗為陽性；甲基紅、丙二酸試驗為陰性；可利用的唯一碳源有乳糖、纖維二糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇、阿拉伯糖、麥芽糖、山梨糖、棉子糖、肌醇、松三糖、鼠李糖、核糖、蜜糖、蔗糖和木糖，不能利用果糖；可利用的唯一氮源有苯基丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、色氨酸，不能利用蛋氨酸、苯基丙氨酸、萘氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸（表4）。

最適合生長溫度為37 ℃，pH值為6.5～7.0。

2.3 菌株16S rDNA序列測定及系統發育樹構建

菌株Y-4經16S rDNA測序得到1 452 bp的基因片段，將其提交GenBank數據庫進行基因序列相似性比較，并選取14株同源性較高的標準菌株序列，與待測菌株Y-4的序列進行系統發育樹構建（圖2）。從16S rDNA序列相似性比對分析結果和系統發育樹可知，菌株MY-1與菌株Bacillus amyloliquefaciens（解淀粉芽胞桿菌）、Bacillus siamensis（暹羅芽胞桿菌）、Bacillus vanillea（香草芽胞桿菌）和Bacillus velezensis（貝萊斯芽胞桿菌）親緣關系最近，同源性最高，相似度均達98.8%。根據系統發育樹相似性和同源性分析，菌株Y-4和Bacillus amyloliquefaciens位于同一分支，兩者進化關系和距離最近，相似度達99.17%，結合形態特征、培養特征和生理生化特征，鑒定此菌株為解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens。

2.4 不同處理發酵液抑菌活性測定

菌株Y-4在不同狀態下有一定的廣譜抑菌活性，通過不同處理測定其抑菌率大小。發酵液上清液對不同病原菌的抑菌率為59.44%～90.56%（表5），對香蕉枯萎病菌4號小種的抑菌率達64.44%，菌株液態下抑制活性均優于固態，對炭疽病效果強弱依次為：辣椒炭疽病菌>芒果炭疽病菌>膠孢炭疽病菌（或草莓炭疽病菌）（圖3）。

硫酸銨處理后的發酵液上清液無活性（圖4），將處理后的發酵液沉淀用磷酸緩沖鹽溶液溶解獲取粗蛋白液，其抑菌率為57.22%～82.22%（表6），對病原菌抑制活性較為穩定（圖5），對香蕉枯萎病菌4號小種的抑菌率為67.22%，拮抗效果明顯高于菌株自身及發酵液上清液。采用倍數稀釋法對香蕉枯萎病菌4號小種進行不同濃度粗蛋白活性測定，結果顯示，粗蛋白濃度從62.5～2 000 μg/mL，對枯萎病靶標菌均有顯著的活性，且粗蛋白濃度和活性呈線性正相關，在粗蛋白溶液濃度為62.5 μg/mL時，抑菌帶寬度是0.49 cm，在2 000 μg/mL時對靶標菌的抑制效果最佳（圖6），抑菌帶寬度達1.39 cm（圖7）。

乙醇萃取物對峙病原真菌有明顯的抑菌帶，最高達1.65 cm（圖8）；抑菌活性在60.00%～82.22%之間（表7），其中，對香蕉枯萎病菌4號小種抑制率高達70.00%，拮抗效果為幾種處理液中最佳，表明該菌株抑菌活性穩定，其代謝產物具有良好抑制病菌效果，特別是液態下，這為開發便于大田施用的高效拮抗生防試劑提供理論支撐。

3 討論

為適應生產及有機農業發展趨勢，截至當前，已有很多使用生防試劑有效抑制農業病害的研究面世。以菌治菌[15]，是一項旨在利用微生物或其代謝產物防治危害農作物病菌的新型生物工程研究，對植物病菌具強選擇性、對自然生態環境具安全性，可促進現代農業逐步轉向可持續發展。邢祎博[16]從番茄根際土壤和發病組織中分離篩選出一株能有效抑制由茄鏈格孢菌所致的番茄早疫病的枯草芽胞桿菌7-19菌株，并通過優化菌株的液態發酵條件提高芽胞形成率，使其益生菌成活量達到最大培養度，為番茄早疫病的生物防治制劑研究提供可行性依據。在實際操作中，施用化學農藥等傳統肥料見效雖快，但也面臨著難操作、費勞力、多污染的難題，篩選高效優質的拮抗菌進行液態發酵制成生防制劑，可充分利用其代謝產物的抑菌活性，也更易于田間快捷精確噴施，從而達到防害優產的目的。黃俊等[17]在水稻田中施用油菜菜籽餅代替部分肥料，實現了減肥增產增效；胡偉等[18]從大豆根系分離出一株抗利福平且對香蕉枯萎病病原菌有強拮抗效果的解淀粉芽胞桿菌；戴君勇等[19]從棉花根際土壤中分離篩選出一株對多種植物枯萎病菌具有抑菌活性，且對棉花和小鼠安全無毒的解淀粉芽胞桿菌KL-1。

為拓展生防制劑有效成分來源，本研究從來源安全、方便收集的角度考慮，以食物調味品黃豆醬為研究對象，分離篩選出4株拮抗性能良好的拮抗細菌，選定12種常見的植物病原真菌為供試病菌，以國際植物檢疫對象“香蕉枯萎病菌”為指示菌，挑取其中一株抑菌效果最為明顯的菌株Y-4進行對峙試驗，測定菌株的抑菌譜，發現其對12種供試病原菌的抑菌率均在53.33%以上，最高可達86.67%，對菌株進行形態觀察、生理生化鑒定，通過16S rDNA 序列分析比對，快速鑒定出該菌株為解淀粉芽胞桿菌。菌株芽胞存活量大小直接影響著生防菌劑的最終防效[20]，菌株Y-4具內生芽胞，適應性、抗逆性極強，營養要求簡單易于培養，是開發生物防治菌劑發展優勢種群的潛在益生菌。

早在1938年，Florey就對微生物代謝抗菌物質展開了深入研究，而芽胞桿菌屬又是微生物中代謝天然抗菌素的佼佼者。研究中常用硫酸銨沉淀分離蛋白，郝建安等[21]研究表明解淀粉芽胞桿菌NK10.BAhjaWT發酵上清液經硫酸銨鹽析處理獲得的粗提蛋白具有抑菌活性。孟利強等[22]從大豆根際分離的生防菌株TF28（解淀粉芽胞桿菌）經硫酸銨鹽析后得到粗蛋白可抑制大豆根腐病菌等。為充分發掘拮抗菌的抑菌殺菌效果，本研究對菌株Y-4進行不同的發酵處理測定其抑菌譜，利用硫酸銨鹽析法檢測出菌株Y-4硫酸銨上清液未具抑制活性，沉淀處理所得發酵粗蛋白液對12種供試病原菌具較高抑菌活性，其中對香蕉枯萎病菌4號小種的抑菌率為67.22%，對粗蛋白進行不同濃度活性測定，結果表明，粗蛋白濃度為62.5～2 000 μg/mL時對枯萎病靶標菌的抑菌活性呈線性正相關，在2 000 μg/mL時抑菌帶寬度達1.39 cm。對菌株發酵液進行乙醇萃取測活，結果表明，乙醇萃取物對12種靶標菌均具有明顯的抑菌活性，對枯萎病抑菌率達70.00%。目前，國內外常見的解淀粉芽胞桿菌來源大多從土壤和作物根系等分離篩選，很少有從食物中分離篩選解淀粉芽胞桿菌以防控香蕉枯萎病的研究報道，陳燕紅等[23]從發病蕉園香蕉根系土壤中分離的R21g9菌株（解淀粉芽胞桿菌）對香蕉枯萎病菌菌群拮抗效果極佳，Lu Juan等[24]從海南鹽堿土中分離出一株對香蕉枯萎病菌有強烈抑制作用的Bacillus amyloliquefaciens。本研究從黃豆醬中分離并測定出該解淀粉芽胞桿菌Y-4菌株對多種常見病原真菌具有較廣的抑菌譜，發酵液化下對香蕉枯萎病的抑菌效果更加穩定，這為生防菌劑有效成分提供原料來源，為微生物防病抑菌機制、生防菌株開發利用、改良土壤狀態和促進生態環境平衡提供可行性依據。

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