杉木花粉發育過程中形態結構的變化研究

馬開驃　唐亮　崔佳雯

摘要： 該研究以揚州地區成年杉木為材料，采用半薄切片法以及掃描電鏡和透射電鏡觀察法，對杉木花粉發育過程進行了觀察。結果表明：杉木的造孢細胞形成于10月，持續至翌年的1月底至2月初。造孢細胞位于小孢子囊最里面，呈多邊形，數量多且彼此排列緊密；細胞壁很薄，細胞核較大，內含豐富的細胞器和脂類物質。造孢細胞發育成熟后彼此分離形成小孢子母細胞。小孢子母細胞的減數分裂開始于2月下旬，經兩次減數分裂，先后形成二分染色體和四分染色體。小孢子從四分體釋放后，體積迅速增大，發育形成花粉，這個過程中，伴隨著明顯的營養物質變化。杉木成熟花粉壁由薄壁區和厚壁區兩部分組成，薄壁區中央有一個乳頭狀突起，突起上有一萌發孔。成熟花粉外壁著生了許多瘤狀顆粒。該研究結果為杉木生殖發育、有性繁殖以及系統演化研究提供了重要依據。

關鍵詞： 杉木， 花粉， 小孢子， 造孢細胞， 散粉

中圖分類號： Q944， S791.27

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）10134206

杉木（Cunninghamia lanceolata），在傳統分類上屬于裸子植物門（Gymnospermae）杉科（Taxodiaceae），由于近年來國際學術界已將杉科并入廣義柏科（Cupressaceae），所以杉木現屬于柏科的杉木亞科（Cunninghamhioideae）杉木屬（Cunninghamia） （Mao et al， 2012）。該屬僅有1種1變種（于永福， 1995）。杉木是我國長江以南地區最主要的造林用材樹種之一。目前，全國杉木人工林面積為911×104 hm2，占全國和世界人工林總面積的18%和5%（萬曉華， 2013）。因此，杉木在我國造林樹種中占有重要地位。

花粉又稱為小孢子，是種子植物特有的結構。由于裸子植物大都是風媒傳粉（王莉等， 2015），裸子植物花粉生長發育與形態結構，與傳粉、受精等有性生殖密切相關（Lu et al， 2016）。杉木花粉形態及花粉管生長形態已有相關報道，如席以珍（1986）和傅遠志（1994）發現杉木花粉粒的形狀屬球形或近球形，萌發孔形狀多樣，花粉壁較薄。張卓文（2003）測定了杉木各無性系花粉大小、花粉萌發、花粉生活力以及花粉培養基等。徐進等（2007）觀察了杉木花粉母細胞在減數分裂時期單價體和多價體、染色體橋、滯后染色體、不均等分離、微核等異常細胞學行為。還有研究報道了杉木的花粉管中存在循環微絲束、微管的分布方式（甘國峰等， 2011， 2012）。盡管前人已對杉木花粉粒的形態和結構進行了一些研究，但花粉在整個發育過程中的形態結構變化，以及適應傳粉特征目前尚不清楚，而這些是研究杉木授粉和有性生殖的重要基礎。因此，本研究從細胞學角度，研究觀察了杉木造孢細胞的超微結構、小孢子發生過程、花粉發育過程中營養物質變化以及成熟花粉的形態特征，為進一步研究杉木傳粉生殖生物學提供基礎資料。

1材料與方法

1.1 材料

試驗所用杉木取自江蘇省揚州市瘦西湖風景區（32°24′ N， 119°25′ E）內，杉木生長發育良好。于10月小孢子葉球出現至第2年4月散粉期間，對同一株杉木連續取樣，采集的小孢子葉球用戊二醛和FAA固定液固定后置于4 ℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 半薄切片觀察法將定期取樣的杉木小孢子葉球浸入戊二醛固定液中固定后置于4 ℃冰箱中保存。樣品取出后，用磷酸緩沖液清洗3次各15 min，之后進行梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、100%）脫水處理各15 min，乙醇與丙酮2∶1、1∶1、1∶2混合液脫水處理各15 min，純丙酮脫水處理一次15 min，脫水處理后用spurr樹脂浸透包埋。包埋后的樣品修樣后，用ULTRACUT E型超薄切片機切片，切片后用甲苯胺藍染色后置于LEICA DMLS2型光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 掃描電鏡觀察法定期取樣的小孢子葉球用FAA固定液固定，置于4 ℃冰箱中保存。冰箱中保存。樣品取出后，用磷酸緩沖液清洗3次各15 min，梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脫水處理各15 min，乙醇與丙酮1∶1混合液脫水處理一次15 min，純丙酮脫水處理兩次各15 min，丙酮與乙酸異戊酯1∶1、1∶2混合液脫水處理各15 min，純乙酸異戊酯脫水處理一次30 min。脫水后在HCP2型臨界點干燥儀上干燥，然后在SCD500型離子濺射噴鍍儀上噴金，最后將樣品置于S4800型場發射掃描電子顯微鏡下掃描并拍照。

1.2.3 透射電鏡觀察法將樣品用戊二醛固定，經過PBS沖洗、鋨酸后固定、PBS沖洗、乙醇脫水、樹脂包埋等步驟后，用Leica EM UC6型超薄切片機切成100 nm的薄片，銅網撈片、烤片，醋酸鈾和佐滕氏鉛混合液雙重染色，在CM100型投射電子顯微鏡下觀察并拍照。

2結果與分析

2.1 小孢子形成的解剖結構觀察

10月中旬， 造孢細胞已經形成，此時造孢細胞排列緊密，細胞壁薄（圖版I： A）。11月中旬，造孢細胞細胞核明顯，少部分造孢細胞開始瓦解，為其他造孢細胞的發育提供空間和營養成分（圖版I： B）。隨后，造孢細胞彼此分離，形成游離狀的小孢子母細胞，小孢子母細胞具有較大的細胞核（圖版I： C）。小孢子母細胞形成之后，2月下旬，細胞的減數分裂開始，經過兩次減數分裂，形成二分染色體（圖版I： D）和四分染色體，新形成的四分體小孢子呈四角型，此時小孢子還未從四分體中釋放，每個小孢子呈三角狀，細胞內細胞器豐富（圖版I： E）。從四分體釋放后，小孢子體積迅速增大，細胞壁增厚，細胞質有明顯的液泡化現象（圖版I： F）。

2.2 小孢子形成的超微結構觀察

杉木的造孢細胞形成于10月，結束于第二年的1月底至2月初，持續近4個月。造孢細胞形成后，位于小孢子囊的中部，細胞數量多，呈多邊形，彼此排列緊密（圖版I： GH）。造孢細胞的細胞核較大，是細胞內的主要部分，核仁中染色質濃縮（圖版I： I）。同時，造孢細胞的細胞壁較薄（圖版I： J），內含有豐富的細胞器和脂類物質（圖版I： K）。此外，造孢細胞處于活躍分裂中，可觀察到一些細胞具有兩個核仁（圖版I： L）。造孢細胞發育成熟形成小孢子母細胞，小孢子母細胞減數分裂形成小孢子。小孢子內含有高爾基體、線粒體等細胞器（圖版I： M）。小孢子液泡化時期，中央形成大液泡，細胞核被擠至細胞邊緣（圖版I： N）。小孢子發育后期，細胞壁增厚，壁外形成許多烏氏體（圖版I： O）。

2.3 花粉發育過程中營養物質的積累

杉木花粉發育過程中，有明顯的營養物質變化規律。1月底，在花粉細胞中可觀察到僅有少量的淀粉粒，細胞核較大（圖版Ⅱ： A， G）。2月上旬，小孢子不斷發育，細胞內的淀粉粒數量逐漸增多，細胞排列相對集中（圖版Ⅱ： B， H）。2月中旬，淀粉粒逐漸趨于成熟，體積進一步增大，周圍出現液泡化現象，細胞數量顯著增加（圖版Ⅱ： C， I）。2月下旬，花粉細胞內的淀粉粒最明顯，細胞壁增厚（圖版Ⅱ： D， J）。3月上旬，花粉細胞內部分淀粉粒解體，數目開始變少（圖版Ⅱ： E）。3月中下旬，花粉發育成熟，細胞內的淀粉粒數目明顯減少（圖版Ⅱ： F）。

2.4成熟花粉的形態特征

3月中旬，杉木的花粉發育成熟，扁圓球形的花粉較均勻的散布在小孢子囊中，每個成熟花粉的直徑約為20 μm （圖版Ⅱ： K）。花粉壁由兩部分組成，分別為處于上部的薄壁區和處于下部的厚壁區（圖版Ⅱ： L， M）。薄壁區中央常有一突起，突起物頂端有一個小孔，即為萌發孔，為以后花粉管長出的區域（圖版Ⅱ： N， O）。此外，花粉外壁著生了許多小顆粒瘤狀突起，數目及密集程度不等，為顆粒狀紋飾（圖版Ⅱ： P）。

3討論

造孢細胞是由孢原細胞有絲分裂后形成的一類具有分生能力的細胞。前人研究表明，杉木的造孢組織具有一般分生組織的特征，但核仁呈不規則分枝狀，細胞呈多角形；小孢子母細胞之間具胞間隙，細胞質膜和細胞壁之間有胼胝質，核仁呈不規則塊狀，細胞呈圓形（蔣恕和黃金生， 1988）。在本研究中，揚州地區杉木花粉的發育過程可分為四個階段，第一階段為10月中旬或者更早，持續至翌年的2月，此時是造孢細胞的形成階段。通過對造孢細胞的超微結構觀察發現：其數量多，細胞呈多邊形，彼此排列緊密，細胞壁很薄。第二階段為2月上中旬，此時是造孢細胞減數分裂間期，我們觀察到造孢細胞的細胞核明顯變大，表明染色體正在核內復制準備減數分裂，其中含有豐富的細胞器。第三階段為2月下旬至3月上旬，造孢細胞經過冬季休眠發育成熟，春季解除休眠后進入減數分裂期，形成小孢子。通過對造孢細胞減數分裂過程的半薄切片觀察，也發現杉木的四分體排列方式大多為四角型的排列方式，這一結果與徐進等（2007）的研究結果相似。杉木造孢細胞的減數分裂過程與如歐洲赤松（Pinus sylvestris）、歐洲云杉（Picea abies）、白云杉（P. glauca）和油杉（Keteleeria fortunei）的造孢細胞經減數分裂形成四分體的過程相似（李國平和黃群策， 2006），都是經過冬季休眠而后在春季解除休眠后進行減數分裂。第四階段為3月中下旬，此階段是杉木花粉發育成熟的過程。整個花粉發育過程中，營養物質特別是淀粉的積累呈現先增加后減少的趨勢。淀粉的積累是為花粉母細胞的減數分裂提供物質基礎，所積累的淀粉在減數分裂過程中大部分被花粉粒迅速轉化、吸收和利用。

A. 10月中旬，造孢細胞排列緊密，細胞核不明顯； B. 11月中旬，造孢細胞有明顯的細胞核； C. 1月下旬至2月上旬，呈游離狀的小孢子母細胞； D. 減數分裂形成的二分體小孢子； E. 減數分裂形成未分開的四分體小孢子； F. 從四分體釋放后的小孢子呈松散結構，細胞核大，質濃； GH. 造孢細胞； I. 造孢細胞的分枝狀核仁； J. 造孢細胞間的細胞壁； K. 造孢細胞內的細胞器和脂類物質； L. 造孢細胞正處于活躍的細胞分裂； M. 小孢子內的細胞器； N. 小孢子液泡化時期； O. 小孢子發育后期。 SC. 造孢細胞； N. 細胞核； MMC. 小孢子母細胞； DY. 二分染色體； Te. 四分染色體； Va. 液泡； Ms. 小孢子； Nu. 核仁； W. 細胞壁； Ve. 小泡； L. 脂類； M. 線粒體； Di. 高爾基體； U. 烏氏體。 比例尺： AF=30 μm； G=50 μm； H=5 μm； IL=2 μm； M=100 nm； N=5 μm； O=0.5 μm。

Plate ⅠAnatomic and ultrastructural observation of microsporogenesis and microspore development in Cunninghamia lanceolata

A. In midOctober， sporogenous cells were arranged closely； B. In midNovember， the sporogenous cell had an obvious nucleolus； C. In late January to early February， microspore mother cells were separated each other； D. Dyad formation after meiosis； E. Tetrad formation after meiosis； F. The microspore released from tetrad with a large nucleus and thick cytoplasm； GH. Sporogenous cell； I. Sporogenous cell with a branching nucleolus； J. Cell wall between sporogenous cells； K. The organelles and lipids in sporogenous cells； L. The active sporogenous cells； M. The organelles in microspore； N. Microspore vacuolization； O. Microspores in late development stage. SC. Sporogenous cell； N. Nucleus； MMC. Microspore mother cell； DY. Dyad； Te. Tetrad； Va. Vacuole； Ms. Microspore； Nu. nucleolus； W. Wall； Ve. Vesicle； L. Lipid； M. Mitochondria； Di. Dictyosome； U. Ubisch body. Scale bars： AF=30 μm； G=50 μm； H=5 μm； IL=2 μm； M=100 nm； N=5 μm； O=0.5 μm.

A. 1月底花粉細胞； B. 2月上旬花粉細胞； C. 2月中旬花粉細胞； D. 2月下旬花粉細胞； E. 3月上旬花粉細胞； F. 3月中下旬花粉細胞； G. 1月底花粉細胞超微結構； H. 2月上旬花粉細胞超微結構； I. 2月中旬花粉細胞超微結構； J. 2月下旬花粉細胞超微結構； K-M. 成熟的花粉細胞； N-O. 花粉細胞萌發孔； P. 花粉細胞外壁。 P. 花粉粒； S. 淀粉粒； N. 細胞核。比例尺： A-F=20 μm； G-J=2 μm； K=100 μm； L=20 μm； M-O=10 μm； P=5 μm。

Plate ⅡPollen development process and ultrastructure of mature pollen in Cunninghamia lanceolata

A. Microspore in late January； B. Microsporein early February； C. Microspore in midFebruary； D. Microspore in late February； E. Microspore in early March； F. Microspore in late March； G. Ultrastructure of microspore in late January； H. Ultrastructure microspore in early February； I. Ultrastructure of microspore in midFebruary； J. Ultrastructure of microspore in late February； KM. Mature microspore； NO. Germinal aperture in microspore； P. Surface of microspore. P. Pollen； S. Starch； N. Nucleus. Scale bars： A-F=20 μm； G-J=2 μm； K=100 μm； L=20 μm； M-O=10 μm； P=5 μm.

傳粉是杉木有性生殖過程中不可缺少的環節（張卓文， 2005），裸子植物通常是風媒傳粉植物，其花粉演化成了利于風媒傳播的形態和結構特征（Lu et al， 2011； 張敏等， 2014； 王莉等， 2015）。針葉樹的花粉直徑在20～100 μm之間，并且花粉的含水量很低，通常在5%～10% （Owens et al， 1998）。賈子瑞等（2014）對云杉屬20個種的花粉結構用掃描電鏡進行了觀察，發現花粉均屬于兩氣囊松科花粉，大小為84.33～118.79 μm。張敏等（2014）對5種裸子植物花粉外壁進行了掃描電鏡觀察，發現杉木的花粉粒近扁球形，花粉粒體積小，在花粉極面有1個稍微突出的乳頭狀突起，外壁有疏松的顆粒狀紋飾。本研究中，杉木花粉呈扁圓球形，直徑約20 μm，屬于較小的花粉，表面具顆粒狀紋飾，花粉的輪廓線呈現波浪形，使得花粉的逸散更加容易。雖然不具有氣囊，但其進入空氣中之后立即失水，從而減輕了自身重量，有利于空氣中漂浮。另外花粉薄壁區向下凹陷，使花粉形成空腔，從而增加了其在空氣中的浮力。這些結果表明，杉木花粉的這些特點體現了其適應風媒傳粉的特征。

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