河北壩上草原紫花苜蓿—根瘤菌高效共生體的篩選

陳俊杰 劉曉云 肖猛 鮑雪銀 劉忠寬 劉慶輝 郭曉葉

摘要[目的]篩選適合河北壩上寒冷、干旱和半干旱特殊環境下的紫花苜蓿-根瘤菌菌株高效共生體。[方法]采用5株分離自河北壩上地區紫花苜蓿的根瘤菌菌株對敖漢和阿爾岡金紫花苜蓿品種分別進行田間接種試驗，測定2種紫花苜蓿品種的平均株高、地上部分干重和結瘤數等性狀。[結果]菌株HBU75002和HBU03701在各方面表現較為優良，菌株HBU75002與其他菌株相比，具有顯著的增產效果，比對照增產26.6%。接種根瘤菌對2種苜蓿品種生物量也產生了不同影響，敖漢苜蓿產量較阿爾岡金增產幅度略大，最高達36.8%，而阿爾岡金則為35.6%；2株根瘤菌菌株對苜蓿品種也表現出不同的增產效果，菌株HBU03701對阿爾岡金苜蓿的增產效果最佳；菌株HBU75002對敖漢苜蓿的增產效果最佳。 [結論]該研究為苜蓿牧草生產提供高效優良的根瘤菌菌株。

關鍵詞紫花苜蓿；根瘤菌；共生體；田間篩選；干重

中圖分類號S541+.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）10-0110-03

Screening the RhizobiaAlfalfa Symbiont in Bashang Region of Hebei

CHEN Junjie， LIU Xiaoyun*，XIAO Meng et al

（College of Life Sciences，Hebei University，Key Laboratory of Microbial Diversity Research and Application of Hebei Province， Baoding， Hebei 071002）

Abstract[Objective] To screen the highlyeffective symbiotic strains for alfalfa cultivars in a cold， arid and semiarid environment. [Method] Five rhizobia strains were inoculated two alfalfa cultivars （Aohan and Algonquin） respectively in the field experiments，which located in Bashang region， Hebei Province. [Method] Two nitrogen fixing effective strains （HBU75002 and HBU03701） were found better than others by analyzing total nodule number， plant height and plant dry weight. Comparing with other rhizobia strains， HBU75002 could significantly increased the plant yield， raising 26.6%. Two alfalfa cultivars showed differences in biomass after inoculated with rhizobia strains， the yield of Aohan was better than Algonquin， raising 36.8% for best， and 35.6% for Algonquin. Moreover， the two strains showed different results in improving yield， HBU03701 could significantly improved the yield of Algonquin while HBU75002 for Aohan. [Conclusion] The study provides efficiant and fine strains for producing rhizobial inoculants.

Key wordsAlfalfa；Rhizobia；Symbiont；Field screening；Dry weight

生物固氮是指固氮微生物在常溫常壓下將空氣中的氮氣轉化為氨的過程。生物固氮與化學合成氮肥相比具有能耗低、生產過程安全等優勢，其中根瘤菌與豆科植物的共生固氮是最強的固氮體系，每年固氮量占全球生物固氮總量的65%以上。高效根瘤菌菌株進行人工接種是增強豆科植物結瘤固氮能力的有效措施。接種根瘤菌不僅能促進苜蓿根系發達，提高產量和品質，而且還能改善土壤結構，提高土壤肥力[1]，促進其他植物生長，并減少化學氮肥使用量，減少對環境的污染，改變中西部地區草地退化的現狀[2-4]。

河北張家口壩上草原屬溫帶大陸性季風氣候，高寒、干旱、多風、無霜期短、光照充足、晝夜溫差大。土壤母質以風沙土為主，表土層薄，極易遭風力、流水的侵蝕，自然植被稀疏。近年來由于過渡放牧和干旱等因素的影響，該地區草地退化嚴重、草地生產力下降和物種多樣性降低[5]。紫花苜蓿（Medicago sativa）是兼具生產和生態功能的飼草之王，素有“牧草之王”之稱，不僅含有豐富的蛋白質、維生素和礦物質，同時也是干旱、半干旱地區重要的植物資源。

根瘤菌與豆科植物共生關系的建立是根瘤菌、植物及環境三方面相互作用的結果。無論在植物原產地還是引種地，豆科植物都需要與適應當地環境的根瘤菌種建立共生關系[6]。近幾十年來，我國人工接種根瘤菌的效果并不十分理想，其主要原因是未篩選到適合當地氣候、土壤環境并與紫花苜蓿有效共生的高效根瘤菌菌株。筆者從河北張家口和山西北部干旱、半干旱地區采集根瘤，并分離、純化根瘤菌菌株，在河北壩上沽源牧場進行田間接種根瘤菌試驗，旨在篩選適合當地土壤環境，并能進行實際生產和應用的高效共生根瘤菌菌株，為苜蓿牧草生產提供高效優良的根瘤菌菌株。

1材料與方法

1.1試驗材料

對采自河北張家口和山西大同等地區的苜蓿根瘤進行根瘤菌分離、保存，并進行生理生化、抗逆性以及結瘤能力測試，最終選取5株根瘤菌菌株進行紫花苜蓿田間接種試驗，菌株編號及采集地見表1。田間接種試驗的供試苜蓿為紫花苜蓿，A品種為阿爾岡金（Algonquin），B品種為敖漢苜蓿（Aohan）。

1.2試驗地概況

田間接種試驗地為河北張家口市北部壩上沽源牧場，地理坐標為115.8°E，41.8°N。其屬于溫帶干旱、半干旱草原農牧交錯地帶，土壤pH 7.8～8.2；氣候特點是冬季寒冷，最低氣溫-38 ℃；夏季雨熱同季，年降水量300～400 mm，全年蒸發量1 870 mm，70%降水集中在7—9月；全年日照時數達2 200 h，年均日照率66%。

1.3試驗方法

1.3.1根瘤菌菌株的培養。

將供試菌株分別接種至克氏瓶YMA培養基上，28 ℃培養2 d；用100 mL無菌水洗滌菌體，裝入無菌三角瓶中搖床振蕩15 min，分光光度計測定其OD600 nm，計算其含菌量。

1.3.2根瘤菌田間接種試驗。

試驗設3組處理，分別為紫花苜蓿品種、根瘤菌菌株、不接種。小區面積為4 m2，每個處理重復5次，隨機排列，共36個小區，各小區間隔離帶寬1 m。2010年7月7日播種，播種前對草地土壤進行輕度翻耙（5～8 cm）并鎮壓；采用條播方式播種，播種量11.25 kg/hm2，行間距30 cm，播種后覆土2～3 cm，然后進行鎮壓。

植物生長至70 d左右，可觀察到植物開花，當開花植物接近總種植量的50%時，進行第1次刈割，測定植物結瘤數和根長；2011年5月18日對試驗小區添加相應根瘤菌菌劑；2011年7月18日對紫花苜蓿進行第2次刈割，對植物株高和地上部分干重（植物樣品先在烘箱中105 ℃殺青15 min，后于65 ℃烘干至恒重）進行測定。

1.4數據分析

采用SPSS 16.0軟件對試驗數據進行單因素和雙因素方差分析（Oneway or Twoway ANOVA）；在滿足方差齊性的情況下，再利用Duncans檢驗進行多重比較，確定各因子內部不同水平平均值之間的差異顯著性。

2結果與分析

2.1根瘤菌菌株對紫花苜蓿生長性狀的影響

方差分析結果表明，菌株之間的結瘤率、株高和干重具有顯著差異（P<0.05），而根長在各個菌株之間無顯著差異。由表2可知，從結瘤率看，接種5株根瘤菌菌株的植物結瘤率均高于對照組，菌株HBU75002結瘤率為100%，與對照具有顯著差異；菌株HBU03701、HBU75035和HBU03725結瘤率也顯著高于對照，說明接種根瘤菌對植物結瘤具有顯著的促進作用。除菌株HBU75076根長與對照差異顯著外，接種其他菌株的苜蓿根長均與對照無顯著差異；除菌株HBU03701和HBU75002株高與對照差異顯著外，其他菌株與對照均無顯著差異。除菌株HBU75002地上部分干重顯著高于對照外，其他菌株與對照均無顯著差異，菌株HBU75002地上部分干重比對照增加26.6%，菌株HBU03701和HBU75035干重僅次于該菌株。

2.2紫花苜蓿品種對紫花苜蓿干重及與根瘤菌菌株互作的影響

方差分析結果表明，苜蓿品種之間的植物干重具有顯著差異（P<0.05），其他性狀均無顯著差異（P>0.05）。

紫花苜蓿品種與根瘤菌菌株交互影響不顯著。由表3可知，阿爾岡金苜蓿接種根瘤菌后，其干重明顯高于敖漢苜蓿（除HBU75002外）。在苜蓿品種與根瘤菌菌株之間有一個最優

3討論

3.1不同根瘤菌菌株對接種植物性狀的影響

河北壩上草原屬于我國北方重點牧區，土地資源雖然比較豐富，但耕作生產力和生產率低，過度墾殖、破壞自然植被以及土地侵蝕越來越嚴重[5]。田間試驗選擇河北壩上沽源牧場作為試驗地，是為了獲得適宜該地區高效固氮的根瘤菌菌劑，旨在篩選抗寒、抗旱的紫花苜蓿品種和相應的高效固氮根瘤菌菌株。該研究從河北壩上和山西右玉的苜蓿根瘤中分離、純化根瘤菌菌株，通過抗逆性及結瘤能力測試選擇了5株供試菌株進行研究，結果獲得了HBU75002和HBU03701 2株較為優良的根瘤菌菌株，明顯增加紫花苜蓿的結瘤率和地上部分干重。其他根瘤菌菌株也能與紫花苜蓿形成有效根瘤，促進植物生長，但與菌株HBU75002和HBU03701相比，產量較低，有些菌株產量甚至低于對照，可能與土壤不均一化以及菌株自身的遺傳因素有關。

3.2接種根瘤菌對不同苜蓿品種生長的影響

苜蓿作為一種荒漠、干旱、貧瘠地的先鋒植物，能很好地適應我國西北地區寒冷、干旱和半干旱的惡劣環境。我國西北部地區荒漠化嚴重，生態環境又極其脆弱。在退耕還林還草工程中，大面積種植豆科灌木和牧草并接種根瘤菌，可以解決大面積人工林、草場“氮缺乏”等問題，改善生態環境，推動該地區畜牧業的發展。該研究結果表明，接種根瘤菌可以提高植物地上部分干重，與其他學者研究結果一致[7-8]。

苜蓿品種很多，不同品種適合在不同土壤環境下生長，而在土壤氮素相同的條件下，不同苜蓿品種對相同根瘤菌菌株獲得的接種效果差異也較大，對一個品種可以產生優異表現的菌株，對另一品種也許只能起誘導反應作用[9-17]。馬其東等[18]研究表明，這2種生物之間的交互作用使得根瘤菌與宿主之間需要相匹配，才能使苜蓿獲得最佳生長效果。張瑞富等[19]在內蒙古地區比較了多個紫花苜蓿品種，阿爾岡金在株高和產量等方面都優于其他品種。海濤等[20]、曹宏等[21]在哈爾濱進行苜蓿品種比較試驗，阿爾岡金產量高于敖漢苜蓿。該研究中，阿爾岡金品種在根瘤結瘤率、地上部分干重方面明顯優于敖漢苜蓿。研究表明，不同苜蓿品種適合在特定的土壤環境下生長；同一根瘤菌菌株對不同苜蓿品種產生的接種效果不同[18]。而該研究由于試驗樣地小區土壤的不均一化，可能導致2種苜蓿結瘤率的差異不顯著。

該研究表明，根瘤菌菌株對苜蓿品種具有一定的匹配性，菌株HBU03701較適合于阿爾岡金苜蓿，而菌株HBU75002對于2種苜蓿品種的貢獻較為均等。該研究前期通過對這2株根瘤菌菌株在山西補播紫花苜蓿的分子標記研究，發現其競爭結瘤能力較強[22]。該研究進一步說明了其具有較強的結瘤競爭能力。

參考文獻

[1] 林國林，馬曉明，遲玉成，等.接種根瘤菌對花生生長及其根際土壤微生物數量的影響[J].山東農業科學，2010（6）：63-65.

[2] 劉杰，王赟文，李穎，等.利用土壤篩選紫花苜蓿高效共生根瘤菌的初步研究[J].草業科學，2005，22（2）：21-25.

[3] 曾昭海，隋新華，胡躍高，等.紫花苜蓿-根瘤菌高效共生體篩選及田間作用效果[J].草業學報，2004，13（5）：95-100.

[4] 陳丹明，曾昭海，隋新華，等.紫花苜蓿高效共生根瘤菌的篩選[J].草業科學，2002，19（6）：27-31.

[5] 丁勇，牛建明，楊持.北方草地退化沙化趨勢、成因與可持續發展研究：以內蒙古多倫縣為例[J].內蒙古大學學報（自然科學版），2006，37（5）：580-586.

[6] 陳文新，汪恩濤，陳文峰.根瘤菌-豆科植物共生多樣性與地理環境的關系[J].中國農業科學，2004，37（1）：81-86.

[7] 寧國贊，劉惠琴，馬曉彤.豆科根瘤菌及其應用技術[M].鄭州：中原農民出版社，1998.

[8] 喻文虎，楊鵬冀，賈德榮.紅豆草、紫花苜蓿根瘤菌接種研究[J].草業科學，1995，12（3）：22-25.

[9] PERRET X，STAEHELIN C，BROUGHTON W J.Molecular basis of symbiotic promiscuity[J].Microbiol Mol Biol Rev，2000，64（1）：180-201.

[10] 劉曉云，郭振國，李喬仙，等.南苜蓿高效共生根瘤菌土壤的篩選[J].生態學報，2011，31（14）：4034-4041.

[11] 李友國，周俊初.影響根瘤菌共生固氮效率的主要因素及遺傳改造[J].微生物學通報，2002，29（6）：86-89.

[12] BECKER M，DIEKMANN K H，LADHA J K，et al.Effect of NPK on growth and nitrogen fixation of Sesbania rostrala as a green manure for lowland rice（Oryza satiwa L.）[J].Plant and soil，1991，132（1）：149-158.

[13] 王立剛，劉克禮，高聚林，等.大豆對磷素吸收規律的研究[J].大豆科學，2007，26（1）：30-35.

[14] 于景麗，張小平，李登煜，等.celB 基因標記法研究酸性土花生接種及施鉬效果[J].植物營養與肥料學報，2006，12（2）：250-253.

[15] 劉莉，周俊初，陳華癸.不同化合態氮濃度對大豆根瘤菌結瘤和固氮作用的影響[J].中國農業科學，1998，31（4）：87-89.

[16] 左元梅，劉永秀，張福鎖.NO-3態氮對花生結瘤與固氮作用的影響[J].生態學報，2003，23（4）：758-764.

[17] 程鳳嫻，曹桂芹，王秀榮，等.華南酸性低磷土壤中大豆根瘤菌高效株系的發現及應用[J].科學通報，2008，53（23）：2903-2910.

[18] 馬其東，劉自學，洪紱曾，等.不同根系發育能力的苜蓿品種接種根瘤菌的效果[J].草業科學，1999，8（4）：36-45.

[19] 張瑞富，楊恒山，包寶君，等.8個紫花苜蓿品種多年草產量比較[J].作物雜志，2010（3）：78-81.

[20] 海濤，于輝.不同紫花苜蓿品種產量及品質的比較[J].黑龍江畜牧獸醫，2009（5）：65-66.

[21] 曹宏，章會玲，蓋瓊輝，等.22個紫花苜蓿品種的引種試驗和生產性能綜合評價[J].草業學報，2011，20（6）：219-229.

[22] 肖猛，劉曉云，劉桂霞，等.BOXPCR分子標記對補播紫花苜蓿共生根瘤菌田間競爭結瘤能力的研究[J].華北農學報，2011，26（1）：187-190.

安徽農業科學2017年