金線蓮乙醇提取物對金黃色葡萄球菌抑菌性能研究

黃聰亮 鄒蘭 胡月英 黎智明 陳文學

摘 要 用乙醇作為溶劑，提取出金線蓮中的有效抑菌物質，采用二倍稀釋法確定金線蓮乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（Minimal inhibition concentration， MIC）為5.000 mg/mL；并經介質pH、熱處理和紫外線處理提取物，發現其抑菌圈直徑在pH9.0和30 ℃下最大；分析金線蓮乙醇提取物對供試菌蛋白質和還原糖的利用能力，表明金線蓮乙醇提取物通過減弱蛋白質和還原糖的代謝來抑制細菌的生長繁殖。

關鍵詞 金線蓮；抑菌機理；最小抑菌濃度；穩定性

中圖分類號 R284.2 文獻標識碼 A

Antibacterial Activity of the Ethanol Extract of Anoectochilus

roxburghii on Staphylococcus aureus

HUANG Congliang1， ZOU Lan2， HU Yueying3， LI Zhiming2，CHEN Wenxue2*

1 Department of Food and Biological Engineering， Zhangzhou Institute of Technology， Zhangzhou， Fujian 363000， China

2 College of Food Science and Technology， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

3 College of Material and Chemical Engineering， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract Anoectochilus roxburghii was extracted by ethanol. The minimal inhibition concertation（MIC）was detected by the broth two-fold agar dilution method and Staphylococcus aureus MIC was 5 mg/mL. Besides， the inhibitory zone diameters of the ethanol extract on A. roxburghii was up to the maximum at pH9 and 30 ℃， respectively. The protein and sugar concentrations in the bacterium were determined， and the results showed that the ethanol extract of A. roxburghii could inhibit the metabolism of the two substances， which affected the growing of the bacterium.

Key words Anoectochilus roxburghii； antibacterial activity； MIC（minimal inhibition concentration）； antibacterial stability

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.026

中藥材金線蓮為蘭科（Orchidaceae）開唇蘭屬（Anoectochilus BL）多年生地生草本植物，一般認為包括2種原植物，一種是金線蘭[Anoectochilus roxburghii（Wall.） Lindl.]，又名花葉開唇蘭，另一種是臺灣銀線蘭（Anoectochilus formosanus Hayata），又名金線蓮。金線蓮在中國主要分布于亞熱帶地區，即福建、廣東、廣西、浙江、江西、海南、云南、四川、貴州以及西藏南部等省區[1-2]，其中以閩、浙、贛為主產地，臺灣省亦產，但植物種不同，為臺灣開唇金線蓮是中國傳統的珍貴藥材，全草均可入藥，在民間治療范圍較廣，素有“藥王”、“神藥”的美稱[3]。其味甘微苦，性平微寒，具有非常強的藥用價值，其不僅能降血壓、解毒、止痛、鎮咳，且在民間還被用于治療支氣管炎、腎炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、風濕性關節炎等疾病，均有很好療效[4-5]。研究發現，金線蓮中主要活性成分是生物堿、糖類、有機酸、黃酮類化合物、苷類化合物、甾體類和揮發油類化合物[6-9]。其中，黃酮類化合物中含有的槲皮素以及有機酸中的阿魏酸、綠原酸等成分被證明與抗菌活性有關[10-11]。然而，目前大多研究僅針對金線蓮的栽培及組織培養，或是針對其中的成分進行分析、提純和分離，而對其在微生物方面的抑制作用及抑菌機理方面的研究較少。筆者以金黃色葡萄球菌作為目標菌，研究金線蓮乙醇提取物對供試菌的抑菌作用，并對其抑菌機理進行初步研究，為其在食品防腐保鮮中的應用提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

金線蓮，試驗所用細菌為金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，（ATCC6538）]均由海南大學食品學院微生物實驗室提供。乙醇試劑均購自天津市富宇精細化工有限公司，均為分析純；牛肉膏、瓊脂均購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨購自廣東環凱微生物科技有限公司；葡萄糖購自廣州化學試劑廠；牛血清蛋白和考馬斯亮藍G-250購于sigma公司；蒽酮購于國藥集團化學試劑公司。

FW177型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；WF-300EH型超聲清洗機（寧波海曙五方超聲設備有限公司）；RE52CS型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；ZHWY-211B型恒溫培養振蕩箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）；SW-CJ-1FD型潔凈工作臺（蘇州佳寶凈化工程有限公司）；722型可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）；冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 金線蓮的提取 將金線蓮干燥并粉碎后，按料液比1 ∶ 10（g ∶ mL），用80%（V/V）乙醇浸泡120 min，抽濾后，用旋轉蒸發儀蒸出溶劑，而后用50 ℃水浴鍋蒸干，置4 ℃冰箱備用。

1.2.2 菌種的活化及培養 （1）菌種活化：將金黃色葡萄球菌在牛肉膏蛋白胨培養基中活化后保存備用。采用麥氏比濁法[12]，用NaCl（0.9%）將培養后的細菌從斜面上洗脫下來，并將菌懸液的濃度稀釋至含菌量約為106～107 cfu/mL，用于金線蓮乙醇提取物最小抑菌濃度的測定和其抗菌穩定性的測定。

（2）菌種培養：取1 mL的上述菌懸液，置49 mL的液體培養基中。將得到的金線蓮乙醇提取物用80%的酒精溶解后加入三角瓶中一起培養作為試驗組，最終液體中提取物的濃度為MIC值；對照組中加入與金線蓮乙醇提取物相同體積的乙醇。各組均在搖床培養箱中進行培養，溫度為37 ℃，轉速為130 r/min，培養時間為24 h。

1.2.3 金線蓮乙醇提取物MIC的測定 準確稱取2.0 g金線蓮的乙醇提取物，用10 mL的80%乙醇將其溶解，配制成200 mg/mL的原液。用試管二倍遞減稀釋法[13]，將提取物原液稀釋成100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL樣品液。以金黃色葡萄球菌為供試菌，進行各提取物MIC的測定[14]。

每個平板分別加入上述配制好的7個濃度樣品液1 mL，與9 mL降溫至45 ℃左右的無菌固體培養基混合均勻，配制成濃度為20.00、10.00、5.000、2.500、1.250、0.625 0、0.312 5 mg/mL的含藥平板，待培養基凝固后吸取100 μL濃度為107～108 cfu/mL的菌懸液加于培養基上，均勻涂布。每個濃度做3次重復，同時做乙醇和無菌水的空白對照。將各平板于37 ℃培養箱中培養24 h，取出觀察結果，以完全不長菌的最小稀釋濃度為該金線蓮提取物的MIC。若含藥平板的培養基上有肉眼不易識別的菌體生長，可從該板中取一環接種于新的固體平板上，培養24 h后進行觀察。

1.2.4 金線蓮乙醇提取物抑菌穩定性的研究 考察提取物對熱和紫外線處理的穩定性，以便為金線蓮乙醇提取物的應用提供理論依據。采用濾紙片法[15]，取吸水力較強且質地均勻的濾紙，用打孔器打成直徑6 mm的圓形濾紙片，置潔凈干燥的培養皿中，干熱滅菌后備用。于超凈工作臺中，待固體培養基溫度為40 ℃時，在每個無菌平板中加入100 μL濃度106～107 cfu/mL的菌懸液，并使菌液均勻的分散在培養基上，制成含菌平板，分別測定pH、溫度和紫外照射時間對金線蓮乙醇提取物抑菌效果的影響，抑菌效果的強弱用抑菌圈直徑來表示[16]。抑菌圈直徑=抑菌直徑-濾紙片紙直徑。

（1）介質pH值對金線蓮乙醇提取物抑菌活性的影響：分別用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH溶液調節培養液的pH值，將各菌種最小抑菌濃度下的金線蓮乙醇提取物制成pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的培養液，用滅菌后的濾紙片分別浸沒于不同pH的提取物中，浸泡24 h后放在含菌平板上，于培養箱中培養24 h后，測定金線蓮乙醇提取物的抑菌圈直徑。

（2）加熱處理對金線蓮乙醇提取物抑菌活性的影響：將各試驗菌對應最小抑菌濃度下的80%金線蓮乙醇提取物分別在不同溫度（在30～100 ℃中，選取5個溫度）條件下，熱處理30 min后，將滅菌濾紙片分別浸沒于提取物中，浸泡24 h后放在含菌平板上，每個處理條件做 3次重復，并測定金線蓮乙醇提取物的抑菌圈直徑。

（3）紫外線對金線蓮乙醇提取物抑菌活性的影響：將各試驗菌對應最小抑菌濃度下的80%金線蓮乙醇提取物在紫外燈下進行不同時長的照射，將濾紙片分別在不同時長紫外照射處理過的提取物中浸泡24 h。然后放在含菌平板上，每個處理3次重復，分別測定金線蓮乙醇提取物的抑菌圈直徑。

1.2.5 蛋白質含量的測定 采用考馬斯亮藍法測定供試菌蛋白質含量的變化[17-18]。取1 mL的上述菌懸液，置于49 mL的液體培養基中。將得到的金線蓮乙醇提取物用80%的酒精溶解后加入三角瓶中一起培養作為試驗組，最終液體中提取物的濃度為MIC值；對照組中加入與金線蓮乙醇提取物相同體積的乙醇。各組均在搖床培養箱中進行培養，溫度為37 ℃，轉速為130 r/min，培養時間為24 h。分別于0、4、8、12、24 h取樣后，于6 000 r/min，4 ℃下離心15 min。取上清液于595 nm下檢測蛋白質含量。

1.2.6 還原糖含量的測定 按照1.2.5方法培養后，取培養后的菌液，于6 000 r/min，4 ℃下離心15 min。采用蒽酮比色法[19]，取上清液于620 nm下測定各管的吸光度值，并以標準曲線為對照，計算經金線蓮乙醇提取物處理后供試菌還原糖含量的變化。

1.3 數據分析

采用SAS8.2統計軟件對數據進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 不同供試菌金線蓮乙醇提取物的MIC

采用2倍稀釋法，測定提取物對不同供試菌的MIC，結果見表1。

由表1可見，金線蓮乙醇提取物對金黃色葡萄球菌有較強的抑菌作用。金線蓮乙醇提取物金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為5.000 mg/mL，可見金線蓮乙醇提取物在較低濃度下對金黃色葡萄球菌有較明顯的抑制作用。

2.2 金線蓮乙醇提取物穩定性的測定

2.2.1 介質pH值對金線蓮乙醇提取物抑菌活性的影響 圖1為不同pH條件下，金線蓮乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用。由圖1可看出，提取物在不同pH下對金黃色葡萄球菌的抑菌效果不同，且隨著pH的增大，抑菌圈直徑逐漸增大，其中pH9.0時抑菌效果最好，抑菌圈直徑達到12.50 mm。通過顯著性分析可知，在5%的顯著水平下隨著pH的變化，金線蓮乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用存在顯著性差異，金線蓮提取物在堿性條件下抑菌效果要優于酸性條件。

2.2.2 熱處理對金線蓮乙醇提取物抑菌活性的影響

由圖2可以看出，隨著處理溫度的升高，提取物抑菌圈直徑逐漸減小，其中，30 ℃時，抑菌圈直徑最大。通過分析可知，在5%顯著水平下，隨著處理溫度的變化，金線蓮乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用差異顯著，金線蓮提取物在低溫下抑菌效果更明顯。

2.2.3 紫外線對金線蓮乙醇提物抑菌活性的影響

由圖3可以看出，隨著照射時長的增加，抑菌圈直徑有微弱的減小。通過顯著性分析（p<0.05），不同紫外線照射時間并不會對提取物抑菌活性造成較大影響，差異不顯著。

綜上分析，金線蓮乙醇提取物受到pH值和溫度的影響較為顯著，紫外照射時間對其影響效果不明顯，且其在堿性條件和低溫下，抑菌效果最好。

2.3 蛋白質含量

圖4為蛋白質標準曲線，圖5為金線蓮乙醇提取物對金黃色葡萄球菌利用蛋白質的影響。由圖5可知，盡管供試菌的對照組和試驗組中蛋白質含量均呈現先上升后下降，但對照組菌液蛋白質濃度顯著低于實驗組。

2.4 還原糖含量

圖6為還原糖標準曲線，圖7為金線蓮乙醇提取物對金黃色葡萄球菌還原糖吸收利用能力的影響。由圖7可知，金黃色葡萄球菌2個處理組的還原糖含量均出現下降趨勢。

3 討論

本文分析了金線蓮乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的MIC和抑菌穩定性等抑菌性能，同時還測定了供試菌內蛋白質和還原糖的變化情況，揭示了其機理。結果表明：金線蓮乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的MIC值為5.000 mg/mL；而楊敏等[20]研究了胡椒乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的MIC為40.00 mg/mL。這說明金線蓮乙醇提取物在較小的濃度下就能抑制細菌的生長。金線蓮乙醇提取物的抑菌穩定性試驗表明：分別在pH9和30 ℃時，抑菌圈直徑最大，提抑菌能力最強；金線蓮提取物抑菌效果受pH和溫度的影響，對紫外照射時間不敏感[21]，這可能是不同物質的提取物，這3個因素對其的作用機理不同。蛋白質和還原糖是生物體內基礎的能量物質，它們通過代謝可為生物體提供物質和能量來源。本研究發現金線蓮乙醇提取物降低了金黃色葡萄球菌還原糖和蛋白質的利用率，說明金線蓮乙醇提取物抑制通過降低還原糖和蛋白質的利用率來抑制金黃色葡萄球菌的生長繁殖。彭美芳等[22]也研究了草果提取物對金黃色葡萄球菌的蛋白質的含量的影響，發現其能顯著降低蛋白質的消耗量，與本試驗的研究結果一致。這可能是金線蓮乙醇提取物影響了細胞膜的通透性所致。細胞膜通透性增加，既影響菌體對蛋白質和還原糖的吸收，同時還會使蛋白質和還原糖大量外泄[22]；同時，由于存活的金黃色葡萄球菌仍進行呼吸作用消耗了部分還原糖和蛋白質，致使其含量降低[23]。此外，還有可能是金線蓮乙醇提取物影響了供試菌內蛋白質的表達，從而抑制了菌體的生長[24]。因此，酸堿度及溫度能影響金線蓮乙醇提取物的抑菌強弱；且經初步分析，其主要是通過抑制菌體內蛋白質和還原糖的代謝來抑制細胞的生長。

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