LAS對草金魚毒性效應研究

張云飛　王茗　劉華倩　劉亞琦　王莉

摘 要：本試驗的試驗魚為草金魚，通過采用靜水式試驗，研究了十二烷基苯磺酸鈉（LAS）對草金魚的急性毒性影響；并在急性毒性試驗的基礎上，研究了亞急性條件下LAS對草金魚肝臟組織超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響，初步探討了LAS對草金魚的毒性效應。LAS對草金魚的急性毒性試驗結果表明，在水溫（15.0±1.0）℃條件下，LAS對草金魚的毒性較強，24h，48h，72h，96h的半致死濃度（LC50）分別是12.2mg/L，9.8mg/L，8.8mg/L，8.6mg/L。在LAS濃度為2.2，2.9，3.6，5.7，7.9mg/L的亞急性條件下暴露96h，試驗結果表明，LAS質量濃度低于3.6mg/L時，LAS對肝臟中SOD酶活性表現出激活作用；LAS濃度高于3.6mg/L時，LAS對肝臟中的SOD酶活性表現出抑制作用。

關鍵詞：草金魚；十二烷基苯磺酸鈉；半致死濃度；超氧化物歧化酶（SOD）

隨著經濟發展，人們生活水平的提高，各種洗滌劑被廣泛應用于工業、農業、醫藥等領域，每年消耗量巨大。洗滌劑的重要組成成分是表面活性劑，十二烷基苯磺酸鈉（LAS）是目前使用最普遍的陰離子表面活性劑。陰離子表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉（LAS）隨著生活污水和工業廢料等大量排入自然水體，造成水生生物不能正常生長，破壞了水體環境的生態平衡。十二烷基苯磺酸鈉（LAS）作為水體中的常見污染物，已被列為《城鎮污水處理廠污染物排放標準》（GB18918-2002）的基本控制項目。盡管十二烷基苯磺酸鈉（LAS）在水體中易生物降解，但是LAS在環境中的吸附、沉淀和生物降解等遷移行為十分復雜。已有研究表明，LAS在環境和生物體內有累積，在低濃度條件下對魚類產生慢性毒性。河流和湖泊中的表面活性劑污染十分嚴重，對漁業和人們的生活健康具有潛在危害。因此研究陰離子表面活性劑（LAS）對魚類的毒性效應十分必要。

水生生物毒性試驗在研究水體中化學污染物的環境效應方面有著重要作用。魚類作為對水中發生的各種物理、化學和生物性的變化反應十分靈敏的一種水生生物，是水生生物毒性試驗經常選取的受試對象之一。表面活性劑對魚的急性毒性研究和對魚的各項生理指標的影響不斷被報道，研究結果表明表面活性劑對魚類有較大毒性，會對魚的生理指標產生影響[1-2]。目前，從分子水平研究水中污染物對魚體內酶、蛋白質等生化反應的影響，用于判斷污染物對魚的毒性作用和探究污染物對魚的致毒機理成為毒性試驗研究的新方向[2-5]。超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內重要的抗氧化酶，其主要作用是清除生物體內的自由基。它通過催化反應2O2-+2H+→H2O2+O2可以把有害的超氧自由基轉化為過氧化氫，隨后過氧化氫被體內的過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）立即分解為無害的水。超氧歧化酶（SOD）其活性隨污染物的脅迫作用而發生改變，可以間接反映環境中有毒有害物質對魚的毒性效應[5]。目前，陰離子表面活性劑（LAS）對魚的毒性研究選取的魚有草魚、彭澤鯽等，但是陰離子表面活性劑（LAS）對具有一定觀賞價值，經濟效益高的草金魚的毒性研究還鮮見報道。

因此，本研究以草金魚為試驗對象，通過急性毒性試驗研究LAS對魚類產生毒害作用的表現，找出產生不良影響的閾濃度。為進一步研究陰離子表面活性劑對草金魚的毒性機制，本試驗以SOD活性變化為評價指標，通過采用暴露實驗法，研究在亞急性條件下陰離子表面活性劑對草金魚肝臟組織中SOD活性的影響，目的是為了利用魚體內的酶活性變化來評價陰離子表面活性劑對水生生物的毒性效應，為水環境中該類化合物污染的早期預報和防治提供參考依據。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗受試魚為草金魚，從鄭州市滎陽市王村鎮北黃河灘養殖場購買，平均體長為3.4cm，平均體重為1.2g。試驗用的草金魚是從養殖場運到實驗室的魚苗，首先用自來水將魚苗馴養7天，自來水需經曝氣脫氯24h才能使用。馴養水溫為（15±1.0）℃（預試驗與正式試驗水溫與馴養時相同），pH為7.0～8.0，溶解氧為9.0mg/L，馴養水水質符合魚的生活水質要求。馴養期間需喂食和換水。喂食頻率為兩天一次，定時喂取，換水頻率為一天一次。期間及時清理魚屎并撈出死魚。試驗前1d和試驗期間不再喂食和換水。

試驗所用表面活性劑為十二烷基苯磺酸鈉，純度為分析純，分子式C18H29NaO3，相對分子質量348.48，天津市凱通化學試劑有限公司。SOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所，LAS測定方法采用混合指示劑程序加入法（MIST法）。

1.2 試驗方法

1.2.1 急性毒性試驗

正式試驗前應首先進行預備試驗[6]，根據預備試驗方法確定魚的全存活和全致死LAS濃度，從而確定試驗濃度的大致范圍。由預試驗確定的濃度范圍，設置6個質量濃度5.2，5.9，7.0，8.4，9.8，13.2mg/L及1個空白對照（CK）0.0mg/L，設置7個魚缸，每個魚缸隨機放置10條草金魚，時間為96h，魚缸為玻璃缸。

試驗期間，每天兩次定時測定試驗數據，詳細觀察草金魚中毒時的癥狀和活動情況并記錄。在試驗開始的24，48，72，96h分別記錄試驗草金魚的死亡數（是用撈魚的網觸碰魚，無反應即可判定為死亡），根據草金魚的死亡率，用直線內插法求出半致死濃度。

1.2.2 LAS對SOD活性影響試驗

采用靜水式試驗，根據96h半致死濃度（LC50），將LAS質量濃度設置為0.0，2.2，2.9，3.6，5.7，7.9mg/L共6個梯度，每個濃度梯度設3組平行樣，共18個魚缸，每個魚缸放魚數量和方式與急性毒性試驗相同，試驗時間為96h。

1.2.3 SOD活性的測定

在試驗開始96h后，撈出魚缸內活魚殺死，迅速將魚的肝臟組織取出，放入冰冷的生理鹽水中洗凈血液，再用濾紙吸干水分。準確稱取組織重量，按照重量（g）：體積（ml）=1：9的比例加入9倍體積的生理鹽水，剪碎組織，在研缽中充分研磨制備勻漿。以3000r/min的轉速用離心機離心10min，取上清液即10%勻漿上清液測定SOD。SOD活性的測定采用SOD試劑盒及酶標儀介紹的方法。在本反應體系中，SOD以每毫克組織中SOD抑制率達50%時所對應的酶量為一個SOD活力單位（U），即U/mg組織。

2 結果分析

2.1 急性毒性試驗結果

對草金魚的急性毒性試驗表明，水中的LAS質量濃度越高，草金魚的中毒現象越明顯，死亡的速度越快數量越多。試驗開始時，魚缸內的魚表現出不同的活動情況，一部分魚活動遲緩，另一部分魚易受驚嚇在魚缸內亂竄。隨著中毒時間的延長，一部分魚游動出現傾斜的情況，逐步喪失活動能力，活動進一步遲緩，即使用網去觸碰也不躲避；另一部分魚則出現發顫的情況，游動過程中身體搖動不止。高濃度區的草金魚慢慢停止活動，直至死亡。

表1記錄了LAS對草金魚急性毒性試驗的致死數據和LAS對草金魚的半致死濃度。以LAS的質量濃度為橫坐標，草金魚的死亡率為縱坐標繪制死亡百分率對試驗物質濃度的曲線，該曲線為一條S形的關系曲線，從引起50%死亡率的內插濃度值得到值。由表1可知，LAS對草金魚24h，48h，72h，96h的半致死質量濃度分別為12.2mg/L，9.8mg/L，8.8mg/L，8.6mg/L，LAS對魚表現出較強的毒性。表面活性劑是一種可溶特殊的脂類化合物。其分子結構一端為親水基團，一端為疏水基團，因此具有親水性和親脂性。程呂柏[7]等認為，LAS分子引起動物細胞死亡的原因主要是破壞了細胞膜。細胞膜的破壞作用包括以下兩個方面，一是LAS分子中的疏水基團長碳氫鏈部分容易插入細胞膜的磷脂雙分子層引起膜結構的損傷，二是十二烷基苯磺酸鈉（LAS）中的苯磺酸根離子易與細胞膜上的蛋白質結合，改變膜蛋白質的構象或導致蛋白質變性，使膜的通透性改變。

2.2 LAS對草金魚肝臟中SOD酶活性的影響

由表2可知，肝臟組織中SOD酶活性在LAS質量濃度為3.6mg/L時影響顯著。LAS質量濃度低于3.6mg/L時，肝臟組織中SOD酶活性高于空白組的SOD酶活性。LAS質量濃度高于3.6mg/L時，肝臟組織中的SOD酶活性迅速降低且低于空白組的SOD酶活性。雷鳴[2]等研究結果表明，LAS用量低于4.0mg/L時，LAS對彭澤鯽鰓、肝臟組織中SOD具有激活作用；LAS用量不低于4.0mg/L時，LAS對彭澤鯽鰓、肝臟組織中SOD活性的影響卻表現出抑制作用，這與本試驗結果相近。

LAS質量濃度低于3.6mg/L時，由試驗組和空白組的酶活力值對比結果可知，LAS肝臟中SOD酶活性得到提高。這是因為十二烷基苯磺酸鈉（LAS）對草金魚的細胞造成傷害，產生高于正常值的超氧自由基，為了維持細胞的正常生理功能SOD酶提高活性以清除多余的超氧自由基。但是SOD酶消除能力是有限的，且其正常發揮功能必須滿足酶蛋白結構不被破壞。LAS質量高于3.6mg/L時，草金魚肝臟中產生的超氧自由基過多，超出了SOD酶的消除能力，同時酶蛋白結構被破壞，SOD酶功能受損，SOD活力降低甚至為零。隨著LAS濃度的增加，SOD酶活性這種抑制作用也加強。LAS對草金魚肝臟有較大傷害作用，且能夠在肝臟中累積。

李偉民、丁詩華[8]等研究結果表明，生物受到輕度逆境脅迫時，抗氧化酶活性往往升高，但受到重度逆境脅迫時，抗氧化酶活性通常降低，這與本試驗中草金魚受到LAS單一污染時SOD變化規律基本一致。已有研究表明，采用陰離子表面活性劑（LAS）作為單一污染物對水生動物進行毒性試驗時，可使有機體產生活性氧，進而導致水生動物體內的抗氧化酶活性或含量發生改變，因此污染物作用下水生動物體內產生活性氧造成氧化損傷可能是污染物致毒的重要途徑。超氧化物歧化酶（SOD）參與生物體內活性氧的清除，對生物機體起著重要的保護作用。超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化與污染物濃度呈現相關性，并且其活性變化在一定程度上能夠反映污染物對生物體的毒性效應[9]。

3 結論

通過急性毒性試驗，得出陰離子表面活性劑LAS對草金魚的24h，48h，72h，96h的半致死濃度（LC50）分別是12.2mg/L，9.8mg/L，8.8mg/L，8.6mg/L。陰離子表面活性劑LAS對草金魚表現出較強的毒性。在LAS濃度為2.2，2.9，3.6，5.7，7.9mg/L的亞急性條件下暴露96h，試驗結果表明，LAS質量濃度低于3.6mg/L時，LAS對肝臟中SOD酶活性表現出激活作用；LAS濃度高于3.6mg/L時，LAS對肝臟中的SOD酶活性表現出抑制作用。從LAS對草金魚肝臟SOD活性影響來看，SOD的活性先增高后降低說明陰離子表面活性劑（LAS）污染會使草金魚體內的多種生化過程受到影響。將超氧歧化酶（SOD）作為水生生物在受到表面活性劑污染脅迫的毒理學指標具有一定的可行性。

參考文獻

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[9]Hai D Q，Varga S I，Matkovics B.Organophosphate effects on antioxidant system of carp（Cyprinus carpio）and catfish （lctalurus nebulosus）[J].Comarative Biochemistry and Physiology，1997，117C：83-88.

作者簡介：張云飛（1995-），男，鄭州大學水利與環境學院學士，從事水環境治理方向研究。

*通訊作者：王莉（1973-），女，河南開封人，高級工程師，鄭州大學水利與環境學院，主要從事水環境治理與水生態修復研究。