豬圓環病毒2a和2b雙亞型Cap蛋白在桿狀病毒表達系統中的表達及對小鼠的免疫效果試驗

吳桃芬，李寶臣，方維煥

(1.浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058；2.浙江諾倍威生物技術有限公司)

試驗研究

豬圓環病毒2a和2b雙亞型Cap蛋白在桿狀病毒表達系統中的表達及對小鼠的免疫效果試驗

吳桃芬1,2，李寶臣2，方維煥1

(1.浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058；2.浙江諾倍威生物技術有限公司)

試驗通過PCR分別獲得PCV2a和PCV2b的Cap基因，順次克隆入pFastBac-Dual載體質粒，獲得攜帶2a和2b型Cap基因的重組質粒Cap-pFastBacDual，轉化E.coliDH10Bac感受態細胞，通過藍白斑篩選獲得重組桿粒Cap-Bacmid，以脂質體法將重組桿粒轉染Sf9細胞，獲得表達Cap蛋白的重組桿狀病毒。PCR能從重組桿狀病毒中擴增出相應大小的Cap基因片段，蛋白電泳和ELISA法鑒定表明，Cap蛋白成功表達。采用重組桿狀病毒肌內注射免疫小鼠(每只相當于8 μg Cap蛋白)，免疫后14 d血清中產生PCV2抗體，免疫后28 d用PCV2a和PCV2b強毒株攻擊，熒光定量PCR法檢測結果顯示，免疫組小鼠脾臟中PCV2基因組拷貝數極顯著低于未免疫對照組。結果表明，PCV2a和PCV2b雙亞型重組Cap蛋白能開發成豬圓環病毒防控的新型疫苗。

PCV;Cap基因；重組質粒；免疫效果

豬圓環病毒(PCV)屬圓環病毒科圓環病毒屬，是最小的動物病毒之一，可分為PCV1和PCV2，其中PCV2對豬有致病性。PCV2基因組含有1767-1768個核苷酸，主要編碼3個蛋白：ORF1編碼非結構復制酶蛋白Rep(314個AAs)；ORF2編碼核衣殼蛋白Cap，是唯一的結構蛋白(233-234個AAs)，是主要免疫原性蛋白，可以自我組裝成病毒樣粒子；ORF3與ORF1基因完全重疊，編碼非結構蛋白(105個AAs)[1,2]。

PCV2毒株可分為PCV2a、PCV2b和PCV2c。2003年前，PCV2a在臨床感染的豬群中是最為流行的基因型，之后則以PCV2b為主要的基因型，而PCV2c只有2008年左右曾在丹麥豬群中發現過，未在其他地方流行。PCV2除了感染豬，還可以在小鼠體內復制，因此小鼠可能成為中間宿主和傳播媒介。市面上已有針對PCV的疫苗，主要是針對單一基因型的疫苗。近年來，桿狀病毒表達系統應用廣泛，具有安全、高效等特點，且可同時插入多個外源基因。

本試驗構建了表達PCV2a和2b雙亞型Cap蛋白的重組桿狀病毒，并探索了其免疫小鼠后對強毒攻擊的免疫保護性。研究結果為PCV新型亞單位疫苗研制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質粒、菌種、細胞、病毒和實驗動物 商品化重組桿狀病毒載體pFastBac-Dual購自Invitrogen公司，菌種E.coliDH10Bac購自上海某生物科技有限公司，Sf9細胞、PCV2a和PCV2b病毒為本實驗室保存；實驗動物BALB/c小鼠購自浙江省某實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 限制性內切酶(BamHI、NotI、XhoI和KpnI)、T4 DNA連接酶和rTaq聚合酶均購自TAKARA公司；Cellfectin II轉染試劑購自Invitrogen公司；SF-900II培養基購自Gibco公司；核酸提取試劑盒、質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自AXYGEN公司；羊抗鼠酶標二抗購自Abcam公司；PNPP購自Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的基因Cap的克隆 根據PCV2a和PCV2b的基因序列分別設計兩對引物(表1)，擴增PCV2a和PCV2b的Cap基因，根據桿狀病毒載體pFastBac-Dual啟動子的酶切位點特征，在上、下游引物加入合適的酶切位點。

從PCV2a和PCV2b全病毒提取核酸，分別用以上引物擴增出目的基因片段。PCR體系：10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTPs(2.5 mmol/L) 1 μL、上下游引物(20 μmol/mL)各0.5 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL、DNA模板5 μL，補加ddH2O至25 μL。PCR反應程序：94℃預變性4 min，94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，共進行30個循環，最后72℃延伸10 min。經瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，并分別回收目的片段，于-20℃保存備用。

表1 試驗所用引物設計

1.2.2 重組Cap-pFast質粒構建 取回收的2a型PCV2目的基因片段和pFastBac-Dual空載體質粒，分別用XhoI和KpnI進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，分別回收酶切后的目的條帶，并用T4連接酶連接，連接產物轉化E.coliDH5α感受態細胞。挑取單個菌落培養并進行菌液PCR鑒定，采用陽性菌液測序。提取測序結果正確的重組質粒PCV2a-Cap-pFast，于-20℃保存備用。再取回收的2a型PCV2目的基因片段和PCV2a-Cap-pFast質粒分別用BamHI和NotI進行雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳后分別回收酶切后的目的條帶，并用T4連接酶將其連接，連接產物轉化E.coliDH5α感受態細胞。挑取單個菌落培養，用P10和PH載體引物進行PCR鑒定，采用陽性菌液測序。提取重組質粒PCV2a-2b-Cap-pFast，于-20℃保存備用。

1.2.3 重組Cap-Bacmid質粒構建 取攜帶PCV2a和PCV2bCap基因的pFast重組質粒(PCV2a-2b-Cap-pFast)轉化至E.coliDH10Bac感受態細胞，經過兩次藍白斑篩選后，挑取白色單個菌落培養并進行菌液PCR鑒定，取陽性菌液分別用PCV2a和PCV2b的Cap基因引物及載體通用引物M13進行PCR鑒定。鑒定結果正確的質粒(攜帶PCV2a和PCV2b雙亞型Cap基因的Bacmid，Cap-Bacmid)提取后，于-20℃保存備用。

1.2.4 表達Cap蛋白的重組桿狀病毒制備 取生長狀態良好的Sf9細胞，稀釋至密度為0.5×106個/mL，加入6孔細胞培養板中，2 mL/孔，27℃靜置培養30 min。同時將Cap-Bacmid質粒和Cellfectin II轉染試劑混合，室溫靜置20 min后，轉染6孔細胞培養板中的Sf9細胞，27℃靜置培養，每天觀察細胞狀態，直至大部分細胞出現變大、漂浮和破碎等病變時收集細胞懸液，經3000 rpm 4℃離心10 min，收集上清液分裝保存至-80℃，即為第一代重組病毒。取病毒液分別用PCV2a和PCV2b的Cap基因引物擴增鑒定。繼續傳代獲第二代和第三代重組病毒，保存備用，短期保存4℃，長期保存-80℃。

采用MTT法檢測重組桿狀病毒滴度[3]：稀釋Sf9細胞為1.25×105個/mL，鋪制96孔細胞板，0.1 mL/孔；稀釋待檢測病毒液至10-2、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，每個稀釋度接種12孔，每孔10 μL；置27℃培養6～7 d，觀察病變情況；加MTT，10 μL/孔，放置室溫搖床上100 rpm反應2 h；3200 rpm離心10 min，吸棄上清液；加DMSO，50 μL/孔，室溫搖晃10 min；酶標儀492 nm讀數。使用PFU計算軟件計算病毒滴度。

1.2.5 重組PCV2a+PCV2b的Cap蛋白表達 取生長狀態良好的Sf9細胞，稀釋至密度為1×106個/mL，加入錐形瓶中27℃、120 rpm培養過夜，待其細胞密度至2×106個/mL左右，按照MOI=0.02接種第三代重組病毒，27℃、120 rpm培養，每天取樣觀察細胞病變情況，當有80%以上細胞病變時，收取細胞懸液，反復凍融3次后，3000 rpm、4℃離心10 min取上清，4℃保存備用。同時取空載桿狀病毒按同樣方法感染Sf9細胞，收集上清。分別取兩種上清20 μL，加入5×上樣緩沖液煮沸10 min，取15 μL進行SDS-PAGE電泳。

利用捕獲ELISA法檢測PCV2-Cap蛋白表達量[4]：用包被液對兔抗-PCV2 IgG進行1∶10000倍稀釋后，包被于微量滴定板中，100 μL/孔，4℃密封培育過夜；用含有1%吐溫20的磷酸緩沖液PBS洗板3次；用1%BSA封閉液進行封閉，37℃密封作用60 min；用含有1%吐溫20的磷酸緩沖液PBS洗板3次；將預先稀釋200倍或500倍的待測抗原樣品和Cap蛋白標準品(60 μg/mL，本實驗室制備)加入至平板第一列各孔中，依次倍比稀釋，37℃密封作用60 min，用洗液洗滌3次；抗PCV2-Cap蛋白的單抗(購自VMRD,Inc.)用稀釋液進行1∶500倍稀釋后加入各孔中，100 μL/孔，37℃密封作用60 min，3次洗滌后用含有1%BSA的稀釋液1∶10000稀釋堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG二抗，每孔100 μL，37℃密封作用60 min，洗滌3次；加入100 μL底物顯色，37℃密封作用30 min；每孔100 μL 3M的NaOH終止反應；通過酶標儀(OD405)進行檢測讀數，確定蛋白抗原稀釋終點，以此為基準，計算蛋白抗原含量。

1.2.6 重組PCV2a+PCV2b-Cap蛋白對小鼠的免疫保護 8周齡BALB/c小鼠24只，隨機分成3組，每組8只。第一組按8 μg/只肌內注射0.1 mL重組桿狀病毒，第二組為對照組攻毒未免疫，第三組為空白對照組未免疫未攻毒。免疫后第14 d、21 d和28 d采血，檢測小鼠血清中PCV2抗體水平。免疫后第28 d第一和第二組每只口服加腹腔注射0.1 mL強毒株(103.5TCID50/mL，PCV2a和PCV2b以1∶1比例混合)進行攻毒。攻毒后28 d剖殺，采集每只小鼠脾臟，用熒光定量PCR方法檢測組織樣品中PCV2病毒拷貝數[5]。

2 結果與分析

2.1 PCV2 Cap基因的擴增 詳見圖1。

M：DNA Marker DL2000；1：PCV2a-Cap；2：PCV2b-Cap 圖1 PCV2 Cap基因的PCR擴增

由圖1可見，以本實驗室保存的PCV2a和PCV2b病毒DNA為模板，分別以各自的引物擴增Cap基因，大小約720 bp。

2.2 重組Cap-pFast質粒的鑒定 挑取單個菌落若干，分別加于含氨芐青霉素的3 mL LB培養基中，37℃、220 rpm培養過夜，菌液用P10和PH載體引物進行PCR鑒定正確。用鑒定結果陽性的菌液4#和5#測序(PCV2a用P10引物測序，PCV2b用PH引物測序)，核對測序結果序列完全正確，無堿基突變或缺失。

2.3 重組Cap-Bacmid質粒的鑒定 詳見圖2。

1和3：PCV2a和PCV2b陽性樣品；2和4：陰性對照；M：DNA Marker DL2000 圖2 重組Cap-Bacmid質粒的PCR鑒定

由圖2可見，提取攜帶PCV2a+PCV2b Cap基因的重組Cap-Bacmid質粒為模板，以PCV2a和PCV2b的Cap基因引物進行PCR鑒定，獲得與預期大小相符的條帶，即表明PCV2a和PCV2b的Cap基因已成功轉入到Bacmid載體中。

2.4 重組PCV2a+PCV2b的Cap桿狀病毒的病毒滴度測定 通過MTT法測定重組病毒滴度，結果第1代病毒滴度為7.2×106pfu/mL，第2代病毒滴度為1.5×107pfu/mL，第3代病毒滴度為2.2×108pfu/mL。

2.5 重組Cap蛋白的SDS-PAGE鑒定 詳見圖3。

M：蛋白分子Marker；1：空載桿狀病毒感染Sf9細胞；2：重組Cap桿狀病毒感染Sf9細胞 圖3 重組Cap蛋白的SDS-PAGE鑒定

由圖3可見，重組Cap蛋白經SDS-PAGE鑒定結果表明，重組桿狀病毒感染Sf9細胞后能表達出與Cap蛋白大小相近的目的產物(約28 kd)，而對照空載桿狀病毒感染Sf9細胞后則未見此條帶。

2.6 重組Cap蛋白表達量的測定 經ELISA法檢測得到重組桿狀病毒中PCV2的Cap蛋白表達量約為110 μL/mL，說明構建的重組Cap蛋白能在Sf9細胞中成功表達。

2.7 重組Cap蛋白對小鼠的免疫保護性 詳見表2、表3。

表2 免疫重組Cap蛋白后小鼠血清中的抗體水平

由表2可見，經ELISA抗體檢測試劑盒檢測，與陰性對照組小鼠相比，免疫重組PCV2a+PCV2b的Cap蛋白小鼠體內產生了PCV2抗體，且抗體水平隨時間逐漸增高。

表3 攻毒后小鼠脾組織樣品中PCV2基因組拷貝數

由表3可見，小鼠脾組織樣品的熒光定量PCR檢測結果表明，免疫重組PCV2a+PCV2b的Cap蛋白小鼠攻毒后，其組織樣品中PCV2病毒拷貝數顯著低于攻毒對照組。

3 小結與討論

PCV2對豬具有致病性，且可與其他病原混合感染，可對養豬生產帶來重大經濟損失。在豬圓環病毒病(PCVAD)、斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)和豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)中是最常見的臨床表現形式[6]。PCV2 感染可引起淋巴細胞缺失，造成免疫抑制，且不能通過有效的免疫應答清除病毒。在患病最后階段，PMWS病豬表現為嚴重的淋巴組織損傷，同時影響外周血單核細胞和淋巴組織器官細胞因子的表達。由于PVC2容易誘發其他多種病毒和細菌的混合感染或繼發感染，可給疾病的診斷和治療帶來很大困難，已成為危害養豬生產的重要病毒之一。

Cap蛋白是PCV2 唯一的結構蛋白，也是PCV2主要的免疫原性蛋白。PCV2a 亞型毒株在2003年前是主要流行毒株，其后PCV2b亞型成為主要流行毒株，2004年加拿大魁北克州的養豬場中鑒定出PCV2b。韓國2000-2008年期間豬群中鑒定出的PCV2 毒株大部分為PCV2b。PCV2在傳播中的不斷突變演化，可適應并感染不同物種。如美國最近報道發現鵝體中檢測到ORF2序列，目前還在進一步診斷病毒是否為新毒株[7]。

目前，針對PCV2的疫苗研發多是針對某一亞型，如PCV2a，PCV2b 和PCV2c 3個病毒亞型。全球已成功注冊的PCV2疫苗可分為2 類：全病毒滅活疫苗和單亞型亞單位疫苗。其中進口注冊的商品化疫苗全部來源于PCV2a 基因型毒株。國內近幾年陸續有PCV2b 亞型的滅活疫苗與亞單位疫苗上市，如浙江諾倍威公司的豬圓環病毒2 型滅活疫苗(ZJ/C株)，武漢中博生物股份有限公司的豬圓環病毒2 型桿狀病毒載體滅活疫苗(CP08株)等。自2006年PCV2疫苗逐步投入使用以來，雖為PCV2流行的防控取得了良好效果，但仍然是困擾養殖業的一種重大疫病，防控效果并不理想。如PCV2a疫苗株、PCV2b疫苗株雖然能相互提供一定的交叉保護，但由于PCV2a與PCV2b毒株之間的抗原性存在差異，無法達到100%保護，可能是造成疫病防控效果不佳的主要原因之一，如臨床PMWS發生率與PCV2a向PCV2b基因型的改變有著密切相關。此外，病毒不斷突變也是疫苗防控不力的原因之一，如近期烏拉圭研究人員發現PCV2b的一個新突變。為了提高PCV2疫苗的防控能力，一方面可以通過佐劑，如干擾素6和Cap蛋白共同表達可增強PCV2疫苗的免疫效果。另一方面PCV2雙亞型的Cap蛋白作為一種新型疫苗方式，可能提供更好的免疫保護效果[8-9]。

本研究采用桿狀病毒表達系統成功表達了PCV2a和PCV2b兩個亞型Cap蛋白的表達，免疫后第14 d小鼠血清中可檢測到PCV2抗體，且抗體水平在第21 d和28 d持續上升。免疫組脾臟中PCV2基因組拷貝數極低于未免疫組，表明重組Cap蛋白免疫能有效清除攻毒小鼠體內的病毒。表明PCV2a和PCV2b雙亞型重組Cap蛋白有望能開發為PCV防控的新型疫苗。

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