苦豆草生物堿的酶法提取工藝優選

李 軍 郝彩琴 冷曉紅1.寧夏職業技術學院，寧夏 銀川 750021;2.寧夏中藥材開發與利用工程技術研究中心，寧夏 銀川 750021

苦豆草生物堿的酶法提取工藝優選

李 軍1,2郝彩琴1,2冷曉紅1,2
1.寧夏職業技術學院，寧夏 銀川 750021;2.寧夏中藥材開發與利用工程技術研究中心，寧夏 銀川 750021

目的：優選苦豆草的酶法提取工藝，提高苦豆草生物堿的提取率。方法：以苦豆草生物堿為指標，通過單因素實驗及正交試驗優化酶質量濃度、pH、酶解溫度、酶解時間等工藝參數。結果：最佳提取工藝條件為：酶解時間4h，緩沖液pH=6，酶用量為1mg/g，酶解溫度50℃，酶法提取的提取率比傳統提取法提高了37%。結論：該工藝簡單、合理，適用于工業化生產。

苦豆草；生物堿；酶法提取

苦豆草系豆科槐屬苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)的干燥地上部分[1]?？喽共萑晡稑O苦、性寒、有毒，具有清熱解毒、抗菌消炎的作用，民間用其根治療喉痛、咳嗽、痢疾及濕疹等[2]。其主要化學成分為生物堿和黃酮，且生物堿已制成苦參素、婦炎栓、克瀉靈等藥物[3]。目前，苦豆草中總生物堿的提取多為超聲、微波和回流提取方法[4]，其不易放大到工業生產、提取率偏低、提取時間長，而近年來生物酶被用于輔助提取中藥材有效成分。選用恰當的酶，可以溫和地將中藥材的細胞壁破壞，達到最高提取收率[5]。酶法提取具有節約能源和時間、降低生產成本，產物穩定、純度和活性高的優點。實驗擬在酸提工藝前加一步酶解過程，使纖維素酶破壞細胞壁并將纖維素軟化，促進有效成分溶出，從而提高苦豆草總生物堿的收率。

1 儀器與材料

1.1 儀器 往復式切藥機(山東青州精誠制藥設備有限公司)；TU-1810紫外分光光度計(北京普析通用分析儀器有限公司)；DHG-9140A型電熱恒溫干燥箱(鄭州南北儀器設備有限公司)；AE-240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；DKB-8A 電熱恒溫水槽(上海精宏儀器設備有限公司)；130-A 型高速粉碎機(長沙市中南制藥機械廠)。

1.2 材料 苦豆草(采于鹽池縣花馬池鎮德勝墩自然村等地)經鑒定為豆科槐屬植物苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)地上部分，粉碎備用；纖維素酶(150000u/g)購于寧夏和氏璧生物有限公司，槐定堿對照品購于中國食品藥品檢定研究院；所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 苦豆草提取物含量測定 苦豆草總生物堿含20多種單體，其中以槐定堿的含量最高，參考相關文獻[4]采用溴麝香草酚藍比色法以槐定堿為指標成分測定苦豆草總生物堿含量(λ=410nm)。具體方法如下。

2.1.1 標準曲線的制作 精密稱定槐定堿對照品5mg，置5mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得槐定堿對照液。取上述溶液0、20、40、60、80、100、120、140μL，分別置于50mL的磨口錐形瓶中，揮盡乙醇，加溴麝香草酚藍pH=7.6緩沖液12mL、氯仿12mL，密塞劇烈振搖2min，靜置2h后分出氯仿層，以第一個為空白，于410nm處測定提取液的吸光度，以吸光度為縱坐標，氯仿層濃度為橫坐標得回歸方程(A=0.0133C-0.0134，R=0.9996，線性范圍為1.667 ～ 11.667μg/mL)。

2.1.2 樣品含量測定 分別吸取傳統酸提法或者酶提取法的濾液1mL，稀釋至100mL，吸取0.2mL至錐形瓶中，加入溴麝香草酚藍pH=7.6緩沖液12mL，氯仿12mL，密塞振搖2min，加入50mL錐形瓶中，靜置2h，分取氯仿層，以對應的提取溶劑1mL，溴麝香草酚藍pH=7.6緩沖液12mL和氯仿12mL同比操作為空白，于410nm處測定提取液的吸光度A，利用標準曲線計算苦豆草總生物堿的含量[4]。

2.2 苦豆草總生物堿的提取2.2.1 傳統酸提法 取苦豆草干燥藥材細粉約10g，精密稱定，加入0.4%鹽酸300mL，回流提取4h，濾過，收集濾液按2.1.2方法進行含量測定。

2.2.2 酶提取法 取苦豆草干燥藥材細粉約10g，精密稱定，加入磷酸-磷酸鈉緩沖溶液(pH=5)，再加入纖維素酶(1∶500)，恒溫水浴反應4h后，加入鹽酸至溶液成0.4%鹽酸，按“2.2.1”項下方法提取后過濾，收集濾液按“2.1.2”項下方法進行含量測定。

2.3 纖維素酶輔助提取工藝條件優化

2.3.1 酶質量濃度的影響 在50℃、pH值為5.0、酶解4h，酶用量分別為2、1、0.4、0.2、0.1 mg/g條件下按“2.2.2”項下酶提法進行提取苦豆草，過濾后收集濾液測含量考察酶用量對苦豆草總生物堿提取率的影響。結果顯示，隨著酶用量的增加生物堿提取率逐漸增加，酶用量為2mg/g時提取率最高。由于酶用量1mg/g和2mg/g對生物堿提取率的影響不大，考慮成本問題，故選擇1mg/g。見圖1。

2.3.2 pH值的影響 纖維素酶的質量濃度為1mg/g，在50℃、pH值在4、4.5、5、5.5、6 條件下酶解4h，酶解后0.4%鹽酸提取考察pH值對提取率的影響。結果顯示，纖維素酶在pH=5.5時提取效果最好。見圖2。

2.3.3 酶解溫度的影響 在纖維素酶的質量濃度為1mg/g，pH 值5.5，35、40、45、50、55℃不同溫度下酶解4h，酶解后0.4%鹽酸回流提取。當酶解溫度為50℃時，苦豆草生物堿提取率最高。見圖3。

2.3.4 酶解時間的影響 使纖維素酶的質量濃度為1mg/g，在50℃，pH值為5.5時，酶解1、2、3、4、5h，然后0.4%鹽酸加熱回流提取。隨著酶解時間的延長，提取率不斷增加，酶解5h時提取率最高。見圖4。

2.4 正交設計及優化 以酶解時間(A)、pH值(B)、酶用量(C)和酶解溫度(D)為因素，通過預實驗確定每個因素的3個水平，按表L9(34)設計正交實驗，以2次平行操作所得苦豆草生物堿的平均得率為評價指標。因素水平見表1，正交實驗結果見表2。試驗結果表明，四個因素對提取率的影響主次順序為A > B > C >D。并得出最佳的提取工藝條件是：A2B3C2D3，即酶解時間4h，緩沖液pH=6，酶用量為1mg/g，酶解溫度50℃。

表1 正交試驗因素水平表L9(34)

表2 正交試驗結果

2.5 驗證實驗 按照正交實驗選擇的最佳工藝條件進行3次重復實驗，操作方法同“2.2.2”項，總生物堿的平均提取率為2.24%(RSD為1.87%)。同時，對未經酶解的苦豆草用0.4%鹽酸回流提取，苦豆草生物堿的提取率為1.63%。說明在最佳工藝條件下，提取方法穩定、可行。

3 討論

中藥中根莖皮類藥材的細胞壁中纖維素含量較高，植物的有效成分一般都包裹在細胞壁內，纖維素酶可破壞纖維素的結構，從而使有效成分從植物細胞壁中溶出，提高了有效成分的提取效率[6]。本工藝首先運用纖維素酶將藥材細胞壁中的纖維素降解，降低了生物堿從植物細胞中溶出的傳質阻力；其次，提取溶劑中加入鹽酸除滅活酶外還與生物堿成鹽，進一步促進了生物堿的溶出[7]。通過正交試驗找出了酶輔助提取工藝的最優條件，其苦豆草生物堿的提取率為2.24%，未經酶解的酸回流提取為1.63%，酶法提取率提高了37%，可見酶解處理有助于苦豆草生物堿的溶出。因此，纖維素酶可以降解并破壞植物顯微組織，促進生物堿的溶出，從而提高了收率[8]。同時酶法提取只是在原有工藝基礎上增加酶解過程，而不必對原有工藝進行大的改變，而且操作簡便易行，不需另外添加生產設備，適用于工業化生產。

[1]陳海燕, 郭鴻雁, 冷曉紅. HPLC法測定西北地區不同產地苦豆子藥材中生物堿的含量[J]. 北方藥學, 2013, 10(5): 10-11.

[2]廖春燕，梁健，楊燕，等. 苦豆子的藥理及應用概述[J]. 中國民族民間醫藥, 2009, 5: 6-8.

[3]邢世瑞. 寧夏中藥志[M]. 2版.銀川: 寧夏人民出版社, 2006：669-705.

[4]李軍, 郝彩琴, 陳海燕，等. 酶法提取苦豆草生物堿研究[J]. 西北藥學雜志, 2014, 29(4): 347-350.

[5]鄧志勇. 纖維素酶法提取葉下珠總生物堿的工藝研究[J]. 食品工業, 2013, 34 (3):159-161.

[6]陳曉琳, 張巖柏, 鄧振雪, 等. 酶法提取白英中總生物堿的工藝研究[J]. 西北藥學雜志, 2012, 27(4)：291-293.

[7]陸世惠，李秀霞. 超聲-酶法提取兩面針中氯化兩面針堿的研究[J]. 中成藥, 2013, 35(4): 841-844.

[8]周蓉，王洛臨，徐文杰，等. 菟絲子的酶法提取工藝優選[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2014, 20(22)：33-36.

Optimization of Enzymatic Extraction Technology of Alkaloids FromSophoraalopecuroidesL.

LI Jun1,2HAO Caiqin1,2LENG Xiaohong1,2

1.Ningxia Collage of Vocation and Technology,Yinchuan 750021,China;2. Ningxia Engineering Technology Research Center of Chinese Herbs Development and Utilization,Yinchuan 750021,China

Objective To optimize enzymatic extraction process ofSophoraalopecuroides L，in order to increase extracting rates of alkaloids.Methods With the content of alkaloids fromSophoraalopecuroidesL as index，effects of enzyme dosage，enzymolysis time，pH and temperature on enzymatic extraction process were investigated by single factor test and orthogonal test. Results Its optimum extraction technology was as follows: enzyme dosage 1mg/g，enzymolysis time of 4 hours，enzymatic hydrolysis of pH 6.0，enzymolysis temperature at 50℃; The extraction rate of enzymatic extraction technology was 1.34 times higher than the traditional technology. Conclusion This optimized extracting process is stable，reasonable and applicable to industrial production ofSophoraalopecuroidesL．

SophoraalopecuroidesL.；Alkaloids；Enzymatic Extraction

2016年寧夏自然科學基金項目(項目編號：NZ16199)。

李軍(1982-)，男，漢族，碩士，講師，研究方向為中藥制劑的教學與科研。E-mail:lijunamy@126.com

R284

A

1007-8517(2017)06-0020-03

2017-01-10 編輯：穆麗華)