猴頭菌液體固體發酵產物多糖抗氧化活性研究

盛悅，何音華，沈月，李雪，王旭東，蔡丹

猴頭菌液體固體發酵產物多糖抗氧化活性研究

盛悅，何音華，沈月，李雪，王旭東，*蔡丹

（吉林農業大學吉林食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林長春130118）

通過還原能力的測定和DPPH·，O2-·，·OH清除率的測定，體外抗氧化試驗結果表明，猴頭菌多糖具有較強的抗氧化活性，在試驗的3種多糖中，抗氧化能力依次為固態發酵產物多糖HeP3＞液體發酵菌絲體多糖HeP1＞發酵液多糖HeP2。

猴頭菌；多糖；提取；抗氧化活性

0 引言

猴頭菌（Hericiumerinaceus），是一種著名的食藥兼用真菌[1-2]，其發酵產物中的有效成分多糖物質被廣泛應用于研究腫瘤、治療胃炎及消化道潰瘍等疾病，目前已經有臨床運用的實例[3-5]。相關研究證明，猴頭菌所含的多糖物質不僅有抗氧化抗衰老[6-7]、降血糖血脂[8-9]、抗腫瘤[10]的功能，還有免疫調節[11-14]等生物活性。相關學者對此做了大量的研究來幫助分析猴頭菌發酵產物中的某些化學成分和對應的功能活性之間的關聯[3-5，15-22]，其中有關于多糖物質在抗氧化性的研究報道較少。相關課題組多年來一直致力于大型真菌改性玉米醇溶蛋白的系統研究，前期研究成果表明，以玉米醇溶蛋白為主要成分進行發酵，其產物中多糖產量較高，并具有一定的生理活性。因此，試驗以前期研究成果為基礎，開展以猴頭菌發酵產物為原料進行多糖的提取及體外抗氧化試驗測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

猴頭菌菌種，吉林農業大學小麥和玉米深加工國家工程實驗室提供。

1.1.2 菌種保存斜面培養基

固體PDA培養基。

1.1.3 試劑

玉米蛋白粉，吉林中糧生化能源銷售有限公司提供；玉米粉、馬鈴薯，市售；無水乙醇、苯酚、濃硫酸、白砂糖、葡萄糖、瓊脂、酵母浸粉，以及MgSO4，KH2PO4均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司產品；HZQ-F160型全溫振蕩培養箱，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司產品；LD5-2B型離心機，北京雷勃爾離心機有限公司產品；RE-52A型旋轉蒸發器、SHZ-III型循環水真空泵，上海亞榮生化儀器廠產品。

1.3 方法

1.3.1 猴頭菌的活化

將4℃貯藏的猴頭菌菌種轉接至新鮮的PDA斜面培養基，置培養箱中于27℃下培養至第12天時采用。

1.3.2 種子培養基的制備

可溶性淀粉2%，葡萄糖3%，酵母浸粉1%，七水合硫酸鎂0.06%，磷酸二氫鉀0.3%，自然pH值，121℃下滅菌20min。

1.3.3 液體深層發酵培養基的制備

玉米蛋白粉12%，葡萄糖3.5%，磷酸二氫鉀0.35%，VB10.0015%，于121℃下滅菌20min。接種量10%，培養溫度25℃，初始pH值5.5，搖床轉速150r/min。

1.3.4 固體發酵培養基的制備

玉米蛋白粉30g，葡萄糖4%，碳酸鈣0.75%，料液比1∶1.25，于121℃下滅菌20min。接種量16%，pH值5.5，培養溫度25℃，培養時間15d。1.3.5粗多糖樣品的制備

猴頭菌液體發酵培養6d后，用布氏漏斗分離發酵產物，分別獲得菌絲體和發酵液。①將發酵液置于圓底燒瓶中，于60℃條件下減壓濃縮，加入預冷的95%乙醇溶液達到終質量分數80%，調節pH值為6，于4℃條件下醇沉12h，然后離心收集沉淀，用75%的乙醇清洗沉淀，直至無還原糖反應，再按照無水乙醇、丙酮、乙醚的順序進行清洗，水浴溶解，以轉速4500r/min離心10min后得上清液。②采用Sevag法[23]脫去蛋白，加入Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1），漩渦混勻器快速振蕩20min后靜置10min，以轉速4500r/min離心15min，除去含蛋白的部分，重復多次，直至用考馬斯亮藍法檢測無蛋白。③加入2%的活性炭，水浴溫度60℃，水浴時間30min，不斷攪拌進行脫色，然后過濾得到粗多糖，儲存備用。④用蒸餾水沖洗過濾得到的菌絲體，直至無發酵液殘留，然后于60℃烘干至恒質量，粉碎過60目篩，取5g樣品，超聲功率600W，超聲時間30min，超聲溫度80℃，料液比1∶35，提取3次，醇沉及其他操作同上。⑤猴頭菌固態發酵培養15d后，在60℃的條件下烘干至恒質量，粉碎過60目篩，取5g樣品，超聲功率600W，超聲時間30min，超聲溫度80℃，料液比1∶30，提取3次，醇沉及其他操作同上。

1.3.6 純化

將制備粗多糖樣品溶于蒸餾水中，置于透析袋（8000～10000Da）中，自來水流動透析48h，然后用蒸餾水透析48h（每隔6h換1次蒸餾水）；減壓濃縮，真空冷凍干燥得精制多糖，備用；精制多糖分別經DEAE-52型纖維素離子交換柱（1cm×20cm）層析和SephadexG-75型凝膠柱（2.5cm×50cm）層析后，進行體外抗氧化活性測定。

1.3.7 還原能力的測定

試驗利用了普魯士藍法[24-25]，以抗壞血酸為陽性對照，對猴頭菌的發酵產物中多糖還原能力進行分析。

計算公式為：

式中：A——樣品OD值；

A0——空白OD值。

1.3.8 DPPH·清除率的測定

采用改良的DPPH分析法，以抗壞血酸為陽性對照，測定了猴頭菌發酵產物中多糖的抗氧化活性。

計算公式為：

式中：A0——空白組OD值；

A——樣品OD值；

A1——對照組OD值。

試驗過程中采用改良的鄰苯三酚法，進行猴頭菌發酵產物中多糖的抗氧化活性測定，以抗壞血酸為陽性對照。

計算公式為：

式中：A0——空白組OD值；

A——樣品OD值；

A1——對照組OD值。

1.3.10 ·OH清除率的測定

試驗以Fenton法為基礎加以改良，進行猴頭菌發酵產物中多糖的抗氧化活性測定，以抗壞血酸為陽性對照。

計算公式為：

式中：Ac——空白組OD值；

Ai——樣品OD值；

Aj——對照組OD值。

2 結果與分析

2.1 猴頭菌發酵產物多糖總還原能力測定

機體內部的Fe2+可催化脂質過氧化，從而引起多種疾病，并具有較高的反應活性，故對金屬離子Fe2+的鰲合能力被用于評價抗氧化劑清除自由基的重要指標之一。其中，HeP1是液體發酵菌絲體多糖，HeP2是發酵液多糖，HeP3是固態發酵產物多糖。

猴頭菌發酵產物多糖和VC的還原能力見圖1。

圖1 猴頭菌發酵產物多糖和VC的還原能力

由于吸光度越大，還原力越強，抗氧化能力越好。由圖1可知，各樣品的還原能力隨著質量濃度的增大而逐漸增強。其中，HeP1低質量濃度時增長速度很快，而HeP3前期增長速度較慢；當質量濃度達到5mg/mL時，還原能力高于HeP1，但仍低于VC的還原能力。

2.2 猴頭菌發酵產物多糖DPPH·清除能力

DPPH·是一種比較穩定的自由基，已廣泛用于評估抗氧化劑清除自由基活性中。

猴頭菌He-02發酵產物多糖和VC對DPPH·的清除能力見圖2。

圖2 猴頭菌He-02發酵產物多糖和VC對DPPH·的清除能力

由圖2可知，隨著試驗樣品質量濃度的增大，各樣品對DPPH·的清除能力隨之逐漸增強，當質量濃度為5mg/mL時，HeP3清除能力最強，HeP2的清除能力相對較弱；且當質量濃度逐漸增大，HeP3與VC的抗氧化性逐漸靠近。當樣品質量濃度為5mg/mL時，3種多糖樣品對DPPH·的清除能力按次序為59.33%，48.47%，66.14%。

圖3 猴頭菌He-02發酵產物多糖和VC對O2-·的清除能力

2.4 猴頭菌發酵產物多糖·OH清除能力

·OH在眾多自由基中反應活性最強，它可引起周圍生物大分子的嚴重損傷，進而引起機體衰老等。因此，·OH清除率是評價抗氧化作用的重要指標。

猴頭菌He-02發酵產物多糖和VC對·OH的清除能力見圖4。

圖4 猴頭菌He-02發酵產物多糖和VC對·OH的清除能力

·OH被公認為活性最強的自由基，也是評價抗氧化活性的重要指標之一。由圖4可知，HeP3對于·OH的清除能力最強，HeP2對·OH的清除能力最弱。

3 結論

體外抗氧化試驗結果表明，猴頭菌多糖具有較強的抗氧化活性，在試驗的3種多糖中，抗氧化能力依次為固態發酵產物多糖HeP3＞液體發酵菌絲體多糖HeP1＞發酵液多糖HeP2。試驗中，固體發酵產物多糖抗氧化活性略優于液體發酵，可能是由于不同發酵形式的培養基含水量不同，而含水量影響菌種的生理代謝過程，進而影響多糖組成，從而影響多糖的抗氧化活性。

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StudyonAntioxidantActivityofPolysaccharidefromHericiumerinaceusLiquid andSolidFermentationProducts

SHENGYue，HEYinhua，SHENYue，LIXue，WANGXudong，*CAIDan
（NationalEngineeringLaboratoryforDeepProcessingofWheatandCorn，CollegeofFoodScienceandEngineering，JilinAgriculturalUniversity，Changchun，Jilin130118，China）

Throughdeterminationsofreducingcapacity，DPPH·freeradicalscavengingrate，·scavengingrate，and·OH scavengingrate，thein-vitroantioxidanttestresultshaveshownthatthefermentationbrothpolysaccharideofHericium erinaceushasastrongabilityofscavengingthefreeradical.Amongthethreekindsofpolysaccharidesinthisexperiment，the antioxidantcapacityofHeP3＞HeP1＞HeP2.

Hericiumerinaceus；polysaccharide；exaction；antioxidantactivity

S646

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.04.031

1671-9646（2017）04b-0009-04

2017-03-01

吉林省科技發展計劃（20140204011NY）；國家現代農業產業技術體系（CARS02-29）。

盛悅（1992—），女，在讀碩士，研究方向為食品生物化學工程與功能性食品。

*通訊作者：蔡丹（1980—），女，博士，副教授，研究方向為乳品科學與發酵工程。