膀胱移行細(xì)胞癌組組織Bcl-2的表達(dá)及與臨床生物學(xué)行為的關(guān)系

楊立軍 鄭文武 周安傳 蘇曉哲 吳亞東 李珅

·論著·

膀胱移行細(xì)胞癌組組織Bcl-2的表達(dá)及與臨床生物學(xué)行為的關(guān)系

楊立軍 鄭文武 周安傳 蘇曉哲 吳亞東 李珅

目的 探討B(tài)cl-2在膀胱移行細(xì)胞癌及癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平，分析其與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系及意義，為膀胱移行細(xì)胞癌的診斷及臨床治療提供理論依據(jù)。方法 用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測45例膀胱移行細(xì)胞癌及對應(yīng)的45例癌旁組織及10例正常膀胱黏膜移行上皮組織中的Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果 癌旁組織組Bcl-2陽性率高于正常膀胱組和膀胱移行細(xì)胞癌組，膀胱移行細(xì)胞癌組表達(dá)陽性率高于正常膀胱組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Bcl-2表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌的組織學(xué)分級關(guān)系密切(P<0.05)，而與患者性別、年齡、淋巴轉(zhuǎn)移情況及腫瘤臨床分期等均無相關(guān)性(P>0.05)。膀胱移行細(xì)胞癌組織Bcl-2蛋白表達(dá)陽性的凋亡率明顯低于陰性表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論Bcl-2在正常膀胱組織中低表達(dá)。Bcl-2隨著膀胱癌病理分級的增加陽性率逐漸增加，在膀胱移行細(xì)胞癌中，Bcl-2發(fā)揮重要作用，與膀胱移行細(xì)胞癌的生物學(xué)行為密切相關(guān)。

Bcl-2:膀胱移行細(xì)胞癌：癌旁：蛋白表達(dá)：流式細(xì)胞分析技術(shù)

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖和凋亡因子失衡是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素，其受到內(nèi)源性(遺傳、免疫、種族、內(nèi)分泌等)和外源性因素(化學(xué)、物理、生物等)的影響[1]。凋亡抑制蛋白(IAP)是一類內(nèi)源性抑制因子，其主要通過Caspases蛋白酶激活級聯(lián)反應(yīng)途徑和腫瘤壞死因子受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制細(xì)胞凋亡，其高表達(dá)引起凋亡不足，與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切。Bcl-2蛋白是一種具有抑制細(xì)胞凋亡的作用蛋白，其通過細(xì)胞抗氧化作用、抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì)、抑制促凋亡的Bax/Bak細(xì)胞毒作用等通路發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡。本文用流式細(xì)胞分析技術(shù)研究Bcl-2在膀胱移行細(xì)胞癌、癌旁組織中的蛋白表達(dá)水平，分析其與臨床生物學(xué)行為的關(guān)系及意義，為膀胱移行細(xì)胞癌的診斷及臨床治療提供理論方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標(biāo)本取自2012至2013年在石家莊市第一醫(yī)院泌尿外科進行外科治療的住院患者，其中膀胱移行細(xì)胞癌45例(膀胱移行細(xì)胞癌組)、對應(yīng)的癌旁組織45例(癌旁組織組)，正常膀胱黏膜組織10例(正常膀胱組)。膀胱移行細(xì)胞癌組均經(jīng)術(shù)后病理證實，其中男33例，女12例；年齡26～68歲，平均年齡(50±10)歲；按照WHO病理分級：G1 12例，G2 20例，G3 13例；TNM臨床分期診斷標(biāo)準(zhǔn)：非浸潤性癌(Ta-1期)19例，浸潤性癌(T2～4期)26例;單發(fā)24例，多發(fā)21例；初發(fā)29例，復(fù)發(fā)16例；正常膀胱組患者10例均為前列腺增生癥、膀胱結(jié)石的膀胱黏膜組織且經(jīng)病理證實，其中男7例，女3例；年齡27～69歲，平均年齡(51±9)歲。上述標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：兔抗人Bcl-2多克隆抗體：SantaCruz公司；hanks(緩沖液)：百浩生物科技有限公司；AlexaFiuor488(異硫氰酸熒光素)：Proteintech公司：胃蛋白酶工作液：上海易欣生物科技有限公司

1.2.2 儀器：BDFACSEALIBUR流式細(xì)胞儀BDBioscience公司(U.S.A)

1.3 試驗方法 應(yīng)用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測。

1.4 試驗步驟 在檢測蛋白免疫熒光標(biāo)記物時，設(shè)hanks(緩沖液)為陰性對照，二抗AlexaFiuor488(異硫氰酸熒光素)為陽性對照。具體操作步驟如下：

1.4.1 標(biāo)本蠟塊的處理：在切片機上將蠟塊包埋的組織切取3～5片40～50μm厚的組織片。

1.4.2 脫蠟：將切取的組織片放入試管中，用二甲苯5～8ml(室溫)浸泡2～3d，其間更換1次或2次二甲苯，脫凈石蠟。

1.4.3 水化：依次用100%、95%、70%、50%濃度的乙醇6～8ml對組織進行水化，每次水化10～15min，棄掉乙醇。加入0.9%氯化鈉溶液5～8ml浸泡30min，棄掉0.9%氯化鈉溶液。

1.4.4 消化：經(jīng)水化的組織加入0.5%胃蛋白酶(pH值1.5～2.0)2ml，置37℃恒溫水浴中，每10分鐘振蕩1次。30min后，立即加入0.9%氯化鈉溶液終止消化。

1.4.5 過濾：將消化好的組織放在120目不銹鋼網(wǎng)上，下置一平皿，用眼科剪刀將組織剪碎，用眼科鑷子輕輕搓組織，邊搓邊用0.9%氯化鈉溶液沖洗，直至將組織搓完。將平皿中的混懸液用300目銅網(wǎng)過濾去掉細(xì)胞團塊。

1.4.6 離心：將收集的細(xì)胞懸液離心沉淀1 500r/min，4min，去掉多余懸清液，以0.9%氯化鈉溶液漂洗1次，離心沉淀1 000r/min，4min，去掉多余懸清液，再以0.9%氯化鈉溶液漂洗1次，再離心沉淀800r/min，4min，去掉多余懸清液，剩約0.5ml。

1.4.7 標(biāo)抗：將Bcl-2一抗按1∶50進行稀釋。離心后的組織加入Bcl-2抗體工作液0.1ml，靜置1h，加入hanks(0.01mol/L)5～8ml，離心沉淀800r/min，4min，棄懸清液，再加入二抗(AlexaFiuor488)100μl，2h后，加入hanks5～8ml，離心同上，除去未結(jié)合的熒光二抗，上機檢測。

1.5 結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)Bcl-2蛋白表達(dá)含量以細(xì)胞的平均熒光強度表示，為了使免疫熒光定量分析更加完備，將平均熒光強度換算成熒光指數(shù)(FI)，用FI來表示Bcl-2在組織中的相對表達(dá)含量，按照組織細(xì)胞表達(dá)熒光指數(shù)大小對其進行統(tǒng)計分類，F(xiàn)I≤1判定表達(dá)量為陰性，F(xiàn)I>1判定為陽性。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測Bcl-2陽性和陰性表達(dá)細(xì)胞的凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 3組Bcl-2蛋白在膀胱組織中的表達(dá)比較Bcl-2在正常膀胱組、膀胱移行細(xì)胞癌組、癌旁組織組的陽性表達(dá)率為10.00%、51.11%、73.33%，癌旁組織組Bcl-2陽性率高于正常膀胱組和膀胱移行細(xì)胞癌組，膀胱移行細(xì)胞癌組表達(dá)陽性率高于正常膀胱組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組Bcl-2表達(dá)陽性率比較 例

注：與正常膀胱組比較，*P<0.05；與膀胱移行細(xì)胞癌組比較，#P<0.05

2.2 膀胱移行細(xì)胞癌組Bcl-2表達(dá)陽性率與臨床病理特征的關(guān)系Bcl-2表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌的組織學(xué)分級初發(fā)、復(fù)發(fā)情況關(guān)系密切(P<0.05)，而與患者性別、年齡、淋巴轉(zhuǎn)移情況及腫瘤臨床分期等均無相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 膀胱移行細(xì)胞癌組Bcl-2表達(dá)陽性率與臨床病理特征的關(guān)系 n=45，例(%)

注:與G1比較，*P<0.05；與G2比較，#P<0.05；與初發(fā)比較，△P<0.05

2.2Bcl-2蛋白表達(dá)與凋亡率的關(guān)系 膀胱移行細(xì)胞癌組織Bcl-2蛋白表達(dá)陽性的凋亡率明顯低于陰性表達(dá)(P<0.05)。見表3。

組別凋亡率t值P值陽性(n=23)4．29±0．6716．3410．000陰性(n=22)8．85±1．15

3 討論

研究表明，細(xì)胞凋亡過程中線粒體是具有重要作用的超微結(jié)構(gòu)，凋亡過程中線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔、跨膜電位變化、細(xì)胞色素C等均依賴于線粒體[2]。線粒體膜上Bcl-2家族蛋白可以調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)外膜的滲透性改變線粒體形態(tài)，細(xì)胞色素C釋放，進一步與其他物質(zhì)組裝成凋亡小體，激活caspase9、caspase3，引起caspases級聯(lián)激活反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,或直接作用于細(xì)胞核引起細(xì)胞凋亡。由此可見,線粒體除了具有經(jīng)典的生物學(xué)效應(yīng)外,還具有調(diào)控細(xì)胞存亡的重要作用[1]。

Bcl-2基因是一種原癌基因，研究發(fā)現(xiàn)許多基因結(jié)構(gòu)與Bcl-2相似，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)解，因此將這些基因統(tǒng)稱為Bcl-2基因家族。Bcl-2基因是t(14∶18)染色體異位斷點處發(fā)現(xiàn)的一種癌基因。Bcl-2家族迄今為止發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族同源蛋白不少于15種,均含有一種以上Bcl-2家族共有同源序列(BH1-BH4)。Bcl-2蛋白家族是一組和Bcl-2蛋白在氨基酸序列和(或)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)上具有有同源性的蛋白質(zhì)，根據(jù)功能可以分為兩類：抗凋亡和促凋亡蛋白。Bcl-2家族中抑制凋亡因子與促進凋亡因子的比例決定細(xì)胞的命運。Bcl-2蛋白家族按結(jié)構(gòu)可以分為三類：(1)前凋亡蛋白：BH3-only蛋白，具有共同的基序，稱為BH3結(jié)構(gòu)域，它感應(yīng)不同的信號啟動細(xì)胞凋亡。BH3-only蛋白已被進一步分為“增敏劑/誘導(dǎo)劑”，如Noxa,Bfm或Bik，可抗凋亡Bcl-2蛋白作用并中和它的抗凋亡功能，和“直接激活劑”，如Bid和Bim，它們有能力直接激活促凋亡Bcl-2蛋白BaxandBak,多數(shù)抗凋亡蛋白含BH1和BH2區(qū),與Bcl-2高度同源的含1～4四個區(qū)[2]。(2)促凋亡蛋白Bax和Bak，含結(jié)構(gòu)域BH1、BH2、BH3；它們直接參與MOM穿孔反應(yīng)。(3)抗凋亡Bcl-2蛋白，含結(jié)構(gòu)域BH1、BH2、BH3、BH4如Bcl-2，bclxl，中，Mcl-1和A1，通過直接與促凋亡成員作用抑制細(xì)胞死亡。前凋亡蛋白之間、抗凋亡蛋白之間及這兩類蛋白之間可相互作用形成同源或異二聚體,形成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),前凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的相對比值在決定細(xì)胞生存抑或死亡中可能起關(guān)鍵作用。

Bcl-2蛋白是抗凋亡蛋白之一，位于線粒體內(nèi)膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，分子量為26 000，它是人類濾泡狀淋巴瘤的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志。目前，關(guān)于Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的研究很多，Bcl-2的高表達(dá)可保護各種凋亡刺激，因此Bcl-2低表達(dá)或缺失的細(xì)胞死亡率明顯增加。

Bcl-2蛋白家族對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用：(1)Bcl-2家族對線粒體通路的凋控，該通路的線粒體滲透性改變形成的PT孔 (permeabilitytransitionpore)開放和線粒體內(nèi)致凋亡的多種蛋白釋放均受Bcl-2家族凋控。Bcl-2或其他抗凋亡蛋白過表達(dá)使許多本可致PT孔開放、細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子 (apoptosisinducingfactor,AIF)釋放的刺激失效，從而抑制細(xì)胞凋亡;而前凋亡蛋白Bax過表達(dá)導(dǎo)致線粒體跨膜電位丟失及細(xì)胞色素C釋放導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[3]。Shimizu等[4]發(fā)現(xiàn)重組前凋亡蛋白Bax和Bak能加速電壓依賴的陰離子通道(voltagedependentanionchannel,VDAC)開放,而Bcl-XL則通過直接與之結(jié)合關(guān)閉VDAC,提示Bcl家族蛋白可通過VDAC調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性,影響膜電位及細(xì)胞色素C釋放,從而促進或抑制凋亡[4]。(2)Bcl-2家族對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路的凋控，研究表明，胞質(zhì)中較高的鈣濃度，可導(dǎo)致線粒體PT孔道的形成和母體的膨脹。結(jié)果，線粒體外膜破裂，膜間隙中的促凋亡蛋白流入細(xì)胞質(zhì)，促進細(xì)胞凋亡[4]。鈣濃度變化在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路中是很關(guān)鍵的凋亡信號,Bcl-2家族除存在于線粒體膜表面外,也存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,能阻斷多種致使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放儲存鈣的凋亡刺激。Foyouzi等[5]發(fā)現(xiàn)Bcl-2的通過增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜對鈣離子通透性而減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)可釋放的游離鈣離子濃度。(3)Bcl-2家族對死亡受體通路的凋控，死亡受體通路通過Fas,TNFR激活Caspase8直接激活Caspase3引起凋亡,主要存在于線粒體表面的Bcl-2應(yīng)該對此通路無影響。但在另一些情況下Bcl-2可抑制死亡受體通路誘發(fā)的凋亡。

國內(nèi)王養(yǎng)民等[6]報道:取應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測57例經(jīng)病理證實的膀胱腫瘤的Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果顯示正常膀胱黏膜中無表達(dá)，膀胱移行細(xì)胞癌Ⅰ級15例,陽性率13.3%;Ⅱ級16例,陽性率6.2%;Ⅲ級18例,陽性率50.0%。膀胱橫紋肌肉瘤陽性1例,葡萄狀肉瘤陽性1例,內(nèi)胚竇瘤陽性1例。從而得出結(jié)論:凋亡抑制基因Bcl-2蛋白在移行細(xì)胞癌及其他細(xì)胞類型的膀胱癌中有表達(dá),如膀胱橫紋肌肉瘤、葡萄狀肉瘤及內(nèi)胚竇瘤；而在Ⅲ級移行細(xì)胞癌中表達(dá)陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ級腫瘤,說明Bcl-2蛋白的表達(dá)與膀胱腫瘤的分級有一定關(guān)聯(lián)；但Bcl-2蛋白的表達(dá)能否作為膀胱腫瘤標(biāo)志物及與膀胱腫瘤患者存活有否關(guān)系仍需進一步深入的研究。Shiina等[7]用免疫組化的方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bcl-2 在膀胱移行細(xì)胞癌中表達(dá)為24.7%,在癌旁移行上皮中為96.1%。國內(nèi)康元上等[8]在膀胱膀胱癌及癌旁組織p53、Bcl-2表達(dá)的初步研究的結(jié)果顯示：腫瘤上皮中表達(dá)為31.1%,而在癌旁組織中為53.3%～75.5%。說明Bcl-2在表淺性BTCC及癌旁組織的基底及基底下層高表達(dá)。癌組織與癌旁組織Bcl-2的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。國內(nèi)羅旭等[9]報道，Bcl-2在非浸潤性膀胱癌的陽性率低于浸潤性膀胱癌的陽性率，但相互間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明Bcl-2蛋白表達(dá)與膀胱癌的臨床分期無關(guān)。Bcl-2在復(fù)發(fā)性膀胱癌的陽性率高于初發(fā)性膀胱癌的陽性率，相互間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明Bcl-2蛋白表達(dá)與膀胱癌的復(fù)發(fā)有關(guān)，可作為膀胱癌術(shù)后預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測指標(biāo)之一。國內(nèi)習(xí)小慶等[10]報告的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級膀胱癌的陽性率分別為18.8%、52.0%和60.0%,表明其表達(dá)與癌組織的惡性程度有相關(guān)關(guān)系。有文獻(xiàn)報道,在子宮內(nèi)膜增生、胃腸上皮發(fā)育異常、皮膚組織病中Bcl-2表達(dá)明顯增高,在前列腺、胃腸道癌旁組織中Bcl-2的表達(dá)亦明顯增高[11-13]。癌旁組織Bcl-2表達(dá)的增高,說明Bcl-2基因可能是腫瘤發(fā)生與進展的早期。

Bcl-2在正常膀胱黏膜中低表達(dá),在移行細(xì)胞癌及其他細(xì)胞類型的膀胱癌如膀胱橫紋肌肉瘤、葡萄狀肉瘤及內(nèi)胚竇瘤中有表達(dá)，在Ⅲ級移行細(xì)胞癌中表達(dá)陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ級腫瘤,說明Bcl-2蛋白的表達(dá)與膀胱腫瘤的分級有關(guān)聯(lián)。Bcl-2在非浸潤性膀胱癌的陽性率低于浸潤性膀胱癌的陽性率，但相互間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明Bcl-2蛋白表達(dá)與膀胱癌的臨床分期無關(guān)。Bcl-2在復(fù)發(fā)性膀胱癌的陽性率高于初發(fā)性膀胱癌的陽性率，相互間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明Bcl-2蛋白表達(dá)與膀胱癌的復(fù)發(fā)有關(guān)，可作為膀胱癌術(shù)后預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)的參考指標(biāo)之一。但Bcl-2蛋白的表達(dá)能否作為膀胱腫瘤標(biāo)志物及與膀胱腫瘤患者的存活率是否有關(guān)系仍需進一步深入的研究。

本試驗Bcl-2在正常膀胱黏膜中低表達(dá),在膀胱移行細(xì)胞癌及癌旁細(xì)胞中高表達(dá)，在Ⅲ級移行細(xì)胞癌中表達(dá)陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ級腫瘤,Ⅰ級與Ⅲ級，Ⅱ級與Ⅲ級相互間差異顯著(P<0.05)，說明Bcl-2蛋白的表達(dá)與膀胱腫瘤的分級有一定關(guān)聯(lián)，隨著膀胱癌惡性程度的增加Bcl-2蛋白的表達(dá)亦增加。Bcl-2在非浸潤性膀胱癌的陽性率低于浸潤性膀胱癌的陽性率，但相互間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明Bcl-2蛋白表達(dá)與膀胱癌的臨床分期無關(guān)。Bcl-2在復(fù)發(fā)性膀胱癌的陽性率高于初發(fā)性膀胱癌的陽性率，相互間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明Bcl-2蛋白表達(dá)與膀胱癌的復(fù)發(fā)有關(guān)，可作為膀胱癌術(shù)后預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)的參考指標(biāo)之一。但Bcl-2蛋白的表達(dá)能否作為膀胱腫瘤標(biāo)志物及與膀胱腫瘤患者的存活率是否有關(guān)系仍需進一步深入的研究。本研究結(jié)果也顯示Bcl-2表達(dá)陽性的凋亡率明顯低于陰性表達(dá)，即Bcl-2表達(dá)與凋亡率呈負(fù)相關(guān)，表明Bcl-2參與BTCC的凋亡機制。本實驗研究表明在膀胱移行細(xì)胞癌Bcl-2的表達(dá)隨著膀胱腫瘤的分化程度越差陽性表達(dá)就增加，呈現(xiàn)正相關(guān)(P<0.05)。

綜上所述，在膀胱移行細(xì)胞癌中，Bcl-2發(fā)揮重要作用，與膀胱移行細(xì)胞癌的生物學(xué)行為密切相關(guān)，深入研究Bcl-2在膀胱移行細(xì)胞癌中的蛋白表達(dá)及與其生物學(xué)行為的關(guān)系，對臨床指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。

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050051 河北省石家莊市第一醫(yī)院泌尿外科(楊立軍、蘇曉哲、吳亞東、李珅)；河北省石家莊市第二醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科(鄭文武)；河北省辛集市中西院中西醫(yī)結(jié)合外科(周安傳)

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A

1002-7386(2017)10-1486-04

2016-11-15)