5株萬古霉素敏感性減低耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的graS基因及細胞超微結構分析

李 靜，劉曉雷，強翠欣，石 磊，趙建宏

(1.秦皇島市海港醫院 檢驗科，河北 秦皇島 066000；2.河北醫科大學第二醫院 檢驗科 河北省臨床檢驗中心，河北 石家莊 050000；3.華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 51064)

·論著·

5株萬古霉素敏感性減低耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的graS基因及細胞超微結構分析

李 靜1，劉曉雷2，強翠欣2，石 磊3，趙建宏2

(1.秦皇島市海港醫院 檢驗科，河北 秦皇島 066000；2.河北醫科大學第二醫院 檢驗科 河北省臨床檢驗中心，河北 石家莊 050000；3.華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 51064)

目的 分析在防耐藥變異濃度(mutant prevention concentration， MPC)測定過程中篩選出的對萬古霉素敏感性減低的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA)在graS基因及細胞超微結構上的變化。 方法 利用Sau-PCR、脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)對篩選菌株進行分析。擴增graS基因，并利用變性梯度凝膠電泳 (denaturing gradient gel electrophoresis， DGGE)技術檢測在該基因上是否存在突變。通過電子顯微鏡技術觀察細胞壁結構改變。結果 萬古霉素敏感性減低菌株經Sau-PCR和PFGE分型檢測，證實部分篩選菌株電泳條帶與原始菌株存在有差異，且電鏡結果也顯示篩選菌株細胞壁有所增厚。DGGE檢測未發現在graS基因上存在突變點。結論 試驗中的菌株萬古霉素敏感性的減低可能不是由graS基因突變造成的，可能存在其他基因位點的突變，或可能存在另外的耐藥機制。

抗菌藥；葡萄球菌， 金黃色；耐藥性，細菌

金黃色葡萄球菌是下呼吸道醫院感染最常見的革蘭陽性菌[1]。近年來萬古霉素以及新型抗耐藥金黃色葡萄球菌藥物的合理應用問題越來越重要，尤其是如何減緩細菌對其耐藥性的形成，防止耐藥克隆的形成更加關鍵。

一直以來臨床治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA)引起的嚴重感染主要依靠萬古霉素[2]。但近年來，萬古霉素中介(vancomycin-intermediate S.aureus，VISA)和耐藥金黃色葡萄球菌(vancomycin-resistant S.aureus，VRSA)的報道逐漸增多[3-4]。近來有研究表明經過體外誘導，β-內酰胺類抗菌藥能將MRSA誘導成為異質性萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌(Heterogeneous vancomycin resistant Stapylococcus aureus， hetero-VRSA， hVISA)，使其對萬古霉素的最低抑菌濃度(MIC)有明顯升高[5]。

世界衛生組織發表的首份抗生素耐藥重點病原體清單，其中就包括對新型抗生素迫切需求程度二級的MRSA、VISA和VRSA[6]。在我國對萬古霉素敏感性降低的菌株廣泛存在，尤其是hVISA，萬古霉素的選擇性壓力可使萬古霉素敏感性降低，最終可形成均質性的VISA株，導致萬古霉素治療失敗[7]。防耐藥變異濃度(mutant prevention concentration， MPC)和突變選擇窗(mutant selection window， MSW)理論在臨床實踐中有重要的應用價值。MSW是指藥物濃度從能抑制敏感菌株生長的MIC到抑制最不敏感一步耐藥突變體生長的MPC這一濃度范圍[8-9]。臨床治療時抗生素濃度選擇落進了突變選擇窗則有可能篩選出耐藥突變株。

我們前期研究測定萬古霉素對臨床分離MRSA的MPC，受試菌經萬古霉素MPC測定后篩選出的菌株，重新進行了MIC測定，結果由原來的MIC501μg/ml、 MIC902μg/ml，分別增至2μg/ml和4μg/ml。可見篩選出的耐藥突變株的萬古霉素敏感性減低。研究表明，金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥的機制不是單一的。據文獻報道，主要有以下幾種觀點[10-12]：細胞壁增厚、青霉素結合蛋白的改變、自溶能力下降、基因突變與轉錄水平變化如雙組分信號系統突變等。但目前為止，其確切的機制尚不清楚。本研究試圖通過比對篩選前后菌株在基因指紋譜上和細胞超微結構上的差異，在分子水平上初步探討通過抗生素選擇壓力篩選出的萬古霉素敏感性減低菌株藥物敏感性下降的可能機制。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 菌株來源于國家科技基礎條件平臺工作臨床微生物項目河北省菌種庫中儲存的2012年12月至2015年3月河北省石家莊地區臨床分離MRSA。前期研究對56株MRSA進行了萬古霉素的MPC測定。對接近MPC的藥物濃度篩選出的菌株接種于無藥平板上，傳代兩次后，再接種于原篩選濃度的萬古霉素平板上，確保篩選出的菌株為萬古霉素敏感性減低菌株。共篩選出5株藥物敏感性減低菌株。

1.2 試劑及儀器 Sau3AI限制性內切酶，Taq DNA 聚合酶，10×PCR緩沖液、低熔點瓊脂糖、瓊脂糖(PFGE級)等，為大連寶生物公司產品；引物SAUT(CCGCCGCGATCT)由Invitrogen公司合成。限制性內切酶SmaI(10 U/μl， HIMERx)。十二烷基肌氨酸鈉和溶葡萄球菌酶(Lysostaphin，L9043-5MG)為Sigma公司產品；DNA分子量參照物DL2000(東盛生物科技有限公司產品)；蛋白酶K購自TaKaRa公司，溶菌酶購自北京普博欣生物科技公司。MIT-P多點接種儀(日本佐久間制作所)， DCode Universal Mutation Detection System(美國BIO-RAD公司)。PCR擴增儀：icycler PCR system (美國BIO-RAD公司)。凝膠成像儀：Gel Doc EQ 凝膠成像分析系統(美國BIO-RAD公司)。脈沖場電泳儀：美國Bio-Rad公司CHEF Mapper Pulsed Field型。

1.3 Sau-PCR 對萬古霉素作用后篩選出的5株藥物敏感性減低菌株及其原始菌株進行Sau-PCR分型檢測。反應程序參考文獻[13]。

PCR擴增體系包括SAUT引物5μl，dNTPs (10 mmol/L)0.5μl，10×緩沖液2.5μl，Taq DNA聚合酶0.1μl， Sau3AI酶切后的DNA(10 ng/μl)2μl，總反應體積25μl。取PCR產物2.5μl點樣于 2%瓊脂糖凝膠，電泳條件為100 V電壓，電泳35分鐘后溴乙錠(EB)染色。將膠塊置于凝膠成像系統下照相并鑒定，觀察萬古霉素篩選出的菌株與原始菌株基因分型有無差異。

1.4 PFGE[14]取單個菌落到2 ml腦心浸液培養基中37 ℃振蕩培養24小時。將菌液轉移于離心管中，調菌液濃度600 nm處吸光度值為1.2～1.4。吸取上述菌液100μl于另一管中， 離心棄上清，沉淀重懸于150μl1×Tris-乙二胺四乙酸(EDTA)，37 ℃水浴平衡10分鐘。加入4μl溶葡球菌酶儲存液[1 mg/ml加入20 mmol/L醋酸鈉(pH4.5)中]，將150μl2%低熔點瓊脂糖膠加入到上述菌液中充分混勻，灌入膠條中。將上述混合液150μl每孔加入模具，4 ℃放置30分鐘，使膠凝固。將栓切成2 mm大小的膠塊，將膠栓轉入含有2 ml EC裂解液[6 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，100 mmol/L EDTA，0.2%脫氧膽酸鈉0.5% Brij-58，0.2%氯化鈉，0.5%十二烷肌氨酸鈉(pH7.6)]的離心管中37 ℃反應24小時。每株菌均取出膠塊1條，加入300μl1×限制性緩沖液含3μlSmaI(10 U/μl)，25 ℃酶切24小時。脈沖條件：14 ℃，30～500 kb，5～40秒，6 V/cm總時間為21小時。

1.5 變性梯度凝膠電泳技術(DGGE)和分子雜交 將上述Sau-PCR分型和PFGE分型有差異的兩對菌株進行graS基因擴增。根據GenBank中已發布的基因序列并結合DGGE檢測原理設計引物，設計3對引物擴增graS基因包括部分該基因上下游序列共1 151 bp。將一段長度為30～50堿基，富含 GC 的 DNA 附加到雙鏈的一端以形成一個人工高溫解鏈區。將graS基因分成3部分進行擴增。將野生菌株和其對應篩選菌株graS基因產物進行雜交反應。反應過程參照文獻[15]。雜交后的DNA分子加入含有變性劑梯度的凝膠進行電泳。電泳條件：130 V電壓，在60 ℃，1×Tris-乙酸-EDTA緩沖液環境中電泳9小時左右。電泳完畢后銀染15分鐘，再放入顯影液中10分鐘待膠變至茶色。凝膠成像分析系統白光照像。

1.6 電子顯微鏡檢測 對上述兩對菌株同時進行掃描電鏡和透射電鏡觀察，受試菌培養物3 000 g離心15分鐘，取沉淀加2.5%戊二醛前固定，切成小塊，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗3次，1%四氧化鋨后固定，梯度酒精脫水后包埋固化，超薄切片機切片，鈾鉛染色，電鏡檢查。

2 結 果

2.1 萬古霉素作用前后MRSA菌株的分子指紋特征分析 選取5對萬古霉素作用前后的原始菌株及耐藥突變株進行Sau-PCR和PFGE分型檢測?？梢钥吹綏l帶的類型相差不大，但顯示5號和16號菌株有個別細小條帶的差別，有待進一步分析，見圖1～2。

2.2 graS基因擴增及DGGE檢測 將上述Sau-PCR分型和PFGE分型有差異的兩對菌株5號和16號進行graS基因擴增，DGGE檢測在graS基因上是否存在突變。按照DGGE原理如有突變點存在雜交后的DNA分子在電泳圖上會出現4個條帶。否則將會在電泳圖上顯示一個條帶。我們實驗中雜交分子在電泳圖上顯示出一個條帶。試驗結果未發現在該基因上存在突變點，見圖3。

1:原始菌株5; 2:篩選菌株5′; 3、10:標準帶; 4:原始菌株2; 5:篩選菌株2′; 6:原始菌株4; 7:篩選菌株4′; 8:原始菌株28; 9:篩選菌株28′; 11:原始菌株16; 12:篩選菌株 16′

圖1 5對MRSA菌株的Sau-PCR分型結果

1:原始菌株4; 2:篩選菌株4′; 3:原始菌株5; 4:篩選菌株5′; 5:原始菌株16; 6:篩選菌株16′

圖2 MRSA菌株的PFGE

1：14為標準帶; 2～4：原始菌株5; 5～7：篩選菌株5′; 8～10：原始菌株16; 11～13：篩選菌株16′。Gene graS-1: 467 bp; gene graS-2: 308 bp; gene graS-3: 538 bp

圖3 MRSA菌株graS基因電泳

2.3 電鏡下超微結構變化 將上述試驗中Sau-PCR分型和PFGE分型有差異的兩對菌株進行電鏡觀察(圖4)。發現原始菌株細胞大小較均勻一致，細胞壁較薄，邊緣整齊，細胞表面光滑。而在較高濃度萬古霉素瓊脂平板上篩選出的菌落，電鏡觀察其細胞形態多樣，大小不一，且邊緣不整，細胞表面粗糙，似覆有一層膜狀物，更為明顯的是細胞壁有所增厚。

3 討 論

試驗中，我們將前期MPC測定過程中在較高萬古霉素濃度仍存活的MRSA菌落收集起來，與原始菌株同時進行Sau-PCR和PFGE分型檢測。仔細觀察可在指紋圖上發現兩種分型方法均證實5和16號菌株在篩選前后有基因分型條帶上差異。在VISA形成過程中可出現 SCCmec基因丟失，國內外曾有過類似的報道[16-17]，Bhateja等[18]同樣在實驗室誘導過程中發現mec A丟失的現象，所以推測在這兩株較高萬古霉素濃度仍存活的MRSA菌落可能存在類似基因片段丟失或突變現象。

a:篩選前MRSA菌株5透射電鏡圖; b:篩選后MRSA菌株5′透射電鏡圖; c:篩選前MRSA菌株5掃描電鏡圖; d:篩選后MRSA菌株5′掃描電鏡圖

圖4 MRSA菌株的掃描電鏡和透射電鏡觀察

DGGE是一種能檢測小分子片段或點突變的分子技術，具有靈敏度高，成本低的特點。當野生菌和突變菌的分子片段同時在同一凝膠上電泳時，按照DGGE原理如有突變點存在，雜交后的DNA分子在電泳圖上會出現4個條帶。否則將會在電泳圖上顯示1個條帶。因此，我們試圖利用DGGE技術檢測在graS基因上是否存在突變。

根據澳大利亞學者Howden等[19-20]通過對萬古霉素中介的菌株研究，發現了雙組分調節感受基因graS基因的突變，并證明該基因的突變與萬古霉素耐藥表型變化直接相關。我們參考Howden等[19]的研究設計了graS基因的擴增引物，試圖通過DGGE檢測在graS基因上是否存在突變。試驗結果未發現在該基因上存在突變點。提示試驗中篩選出的耐藥突變株，萬古霉素敏感性的減低可能不是由graS基因突變造成的，可能存在有其他基因位點的突變，或另外的耐藥機制仍待進一步研究。隨著基因測序技術的不斷進步，成本逐漸降低，我們將通過基因測序技術重復graS基因檢測，并進一步探討其他基因位點的突變。

同時通過掃描電鏡和透射電鏡比較它們細胞超微結構上的差異。發現在較高濃度萬古霉素瓊脂平板上篩選出的菌落，其細胞形態多樣，大小不一，且邊緣不整，細胞表面粗糙，似覆有一層膜狀物。而更為明顯的是細胞壁有所增厚，這可能與細菌對萬古霉素敏感性減低有關。

[1] 王悅，史利克，張魯濤，等. 醫院獲得性下呼吸道感染病原菌分布及耐藥性分析[J].臨床薈萃，2015，30(11):1269-1272.

[2] 趙建宏，秦小霞，李靜.金黃色葡萄球菌臨床分離株對萬古霉素敏感性的監測[J]. 臨床薈萃，2009，24(1):33-36.

[3] Howden BP，Davies JK，Johnson PDR，et al．Reduced Vancom ycin susceptibility in Staphylococcus aureus，including vancomycin-intermediate and heterogeneous vancomycin-intermediate strains：resistance mechanisms，laboratory detection and clinical implications[J]．Clin Microbiol Rev，2010，23(1)：99-139．

[4] Friaes A，Resina C，Manuel V，et al．Epidemiological survey of the first case of vancomycin--resistant Staphylococcu saureus infection in Europe[J]．EpidemiolInfect，2015，143(4)：745-748．

[5] 劉明濤，董春花，郭洪萍，等.β-內酰胺類抗菌藥物誘導異質性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌及其藥敏試驗研究[J].中華醫院感染學雜志，2017，27(3)：481-483.

[6] Global priority list of antibiotic-resistant bacteria to guide research， discovery， and development of new antibiotics. [EB/OL]. [2017-2-25].http://www.who.int/medicines/publications/global-priority-list-antibiotic-resistant-bacteria/en/.

[7] 蔡淑梅，朱海平，喬秀梅，等. 萬古霉素瓊脂平板對異質性萬古霉素 中介金黃色葡萄球菌篩查價值Meta分析[J]. 中國抗生素雜志，2015，40(3):213-216.

[8] 李靜， 時東彥， 趙建宏.抗菌藥物耐藥突變選擇窗的研究進展[J].臨床薈萃，2010，25(2):164-166.

[9] Zhao X， Drlica K. Restricting the selection of antibiotic resistant mutant bacteria: measurement and potential use of the mutant selection window[J]. J Infect Dis， 2002，185(4):561-565.

[10] 程欣，李曉鷗，劉曉峰，等. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌及其對萬古霉素耐藥的研究進展[J]. 中國實驗診斷學，2016，20(10):1785-1787.

[11] Sun H， Yang Y， Xue T， et al. Modulation of cell wall synthesis and susceptibility to vancomycin by the two-component system AirSR in Staphylococcus aureus NCTC8325[J]. BMC Microbiol， 2013，13: 286.

[12] Cameron DR， Ward DV， Kostoulias X， et al. Serine/threonine phosphatase Stp1 contributes to reduced susceptibility to vancomycin and virulence in Staphylococcus aureus[J]. J Infect Dis， 2012，205(11): 1677-1687.

[13] Yan H， Shi L， Alam MJ， et al.Usefulness of Sau-PCR for molecular epidemiology of nosocomial outbreaks due to Burkholderia cepacia which occurred in a local hospital in Guangzhou，China[J].Microbiol Immol，2008，52(5):283-286.

[14] McDougal LK， Steward CD， Killgore GE， et al.Pulsed-field gel electrophoresis typing of oxacillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from the United States: establishing a National Database[J]. J Clin Microbiol，2003，41(11):5113-5120.

[15] McCammon MT， Gillette JS， Thomas DP，et al.Detection of rpoB mutations associated with rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis using denaturing gradient gel electrophoresis[J].Antimicrob Agents Chemother，2005，49(6):2200-2209.

[16] Poston SM，Glancey GR，Wyatt JE，et al. Co-elimination of mec and spa genes in Staphylococcus aureus and the effect of agr and protein A production on bacterial adherence to cell monolayers[J]. J Med Microbiol， 1993，39(6):422-428.

[17] 張琴.體外萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌演變過程及分子機制研究[D].重慶:重慶醫科大學，2014.

[18] Bhateja P，Purnapatre K，Dube S，et al.Characterisation of laboratory-generated vancomycin intermediate resistant Staphylococcus aureus strains[J]. Int J Antimicrob Agents，2006， 27(3):201-211.

[19] Howden BP， Stinear TP， Allen DL， et al. Genomic analysis reveals a point mutation in the two-component sensor gene graS that leads to intermediate vancomycin resistance in clinical Staphylococcus aureus[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2008，52(10):3755-3762.

[20] Howden BP， McEvoy CR， Allen DL， et al. Evolution of multidrug resistance during Staphylococcus aureus infection involves mutation of the essential two component regulator WalKR[J]. PLoS Pathog，2011，7(11): e1002359.

graS gene and cell ultrastructure analysis of five methicillin-resistant Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin

Li Jing1， Liu Xiaolei2，Qiang Cuixin2， Shi Lei3， Zhao Jianhong2

1.Department of Laboratory Medicine，Qinhuangdao Haigang Hospital， Qinhuangdao 066000， China；2.Department of Laboratory Medicine， the Second Hospital of Hebei Medical University，Hebei Provincial Center for Clinical Laboratory， Shijiazhuang 050000， China; 3.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology， Guangzhou 510640，China

Zhao Jianhong，Email：zhaojh_2002@yahoo.com

Objective The methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) with reduced susceptibility to vancomycin which were selected during mutant prevention concentration(MPC) determination were characterized to compare the changes in the graS gene and cell ultrastructure.Methods The strains selected were characterized by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and Sau-PCR assay. The graS gene was detected by polymerase chain reaction method; Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) was used to probe for mutations in the graS gene. The electron microscopy was used to compare the differences on cell wall.Results Compared with the parental strains， some strains with reduced susceptibility to vancomycin had different DNA profiles by Sau-PCR assay and PFGE. Electron microscopy showed that the mutant strains had slightly thicker cell walls than those of the wild-type strains. DDGE was used to probe for mutations in the graS gene， but no different banding patterns were observed on the electrophoretogram spectrum. Conclusion The strains with reduced susceptibility to vancomycin were not caused by genetic mutations of graS， there may be mutations in genes other than the graS gene or existence of other resistant mechanisms.

anti-bacterial agents; Staphylococcus aureus；drug resistance，bacterial

國家科技基礎條件平臺工作重點項目(2005DKA21202-6)；河北省衛生廳醫學重點課題(08075)；河北醫科大學第二醫院重點課題(2h0200805)

趙建宏，Email：zhaojh_2002@yahoo.com

R916.693

A

1004-583X(2017)05-0405-05

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.05.007

2016-12-06 編輯:武峪峰