本溪市100例糖尿病患者血清1， 5脫水葡萄糖醇全酶的測定

吳潔平

【摘要】 目的 建立一種測定血清中1， 5-脫水葡萄糖醇（1， 5-AG）的方法， 輔助診斷糖尿病。方法 糖尿病患者（糖尿病組）與健康體檢人員（健康對照組）各100例， 采用葡萄糖激酶去除血清樣品內源葡萄糖干擾， 過氧化氫（H2O2）在4-氨基替比林（4-AAP）、過氧化物酶（POD）的存在下， 可生成紅色醌亞胺化合物， 發生顯色反應進行比色測定。結果 該方法最低檢測限為1.98 μmol/L， 1， 5-脫水葡萄糖醇在663 μmol/L以內線性良好。測定100例糖尿病組患者血清1， 5-脫水葡萄糖醇含量為（30.7±16.4）μmol/L， 顯著低于健康對照組的（170.6±48.2）μmol/L， 差異有統計學意義（P<0.05）。結論 該法簡便快速、靈敏、準確和穩定、特異， 可用于糖尿病的及時診斷與監控， 適合于各類實驗室常規應用。

【關鍵詞】 葡糖激酶；糖尿病；1， 5-脫水葡萄糖醇

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.33.045

Determination of serum 1， 5-anhydroglucitol holoenzyme in 100 diabetes mellitus patients in Benxi city WU Jie-ping. Benxi City Sixth Peoples Hospital， Benxi 117002， China

【Abstract】 Objective To establish determination method for serum 1， 5-anhydroglucitol holoenzyme （1， 5-AG） to assist diagnosis of diabetes mellitus. Methods There were diabetes mellitus patients （diabetes mellitus group） and healthy people （healthy control group）， with 100 cases in each group. Glucokinase was applied to eliminate interference by glucose in serum samples. Chromogenic reaction of by hydrogen peroxide （H2O2） generating red quinone-imine compound in 4-amino-antipyrine （4-AAP） and peroxidase （POD） were used in colorimetric determination. Results The lowest detectable limit of this method was 1.98 μmol/L， and 1， 5-anhydroglucitol holoenzyme showed good linearity within 663 μmol/L. Serum 1， 5-anhydroglucitol holoenzyme content was （30.7±16.4） μmol/L in 100 diabetes mellitus patients， which were obviously lower than （170.6±48.2） μmol/L in the control group， and their difference had statistical significance （P<0.05）. Conclusion As an easy， convenient， sensible， accurate， stable and specific method， it can be applied in timely diagnosis and monitoring of diabetes mellitus. This method is suitable for laboratory conventional application.

【Key words】 Glucokinase； Diabetes mellitus； 1， 5-anhydroglucitol

糖尿病是影響人類健康的代謝性疾病， 血清1， 5-脫水葡萄糖醇是一種存在于血液中的多元醇， 其含量在多元醇糖類物質中僅次于葡萄糖。血清1， 5-脫水葡萄糖醇的實驗室檢查對糖尿病的診斷分型以及療效監測都有重要意義。本文旨在探討1， 5-脫水葡萄糖醇在糖尿病中的輔助診斷價值[1]。該檢測項目是繼糖化血紅蛋白之后又一頗具前景的糖尿病監測指標。目前國外研究較多， 有些發達國家列為常規檢測項目， 而國內研究甚少。現報告如下。

1 材料與方法

1. 1 試劑與標準液 檢測1， 5-脫水葡萄糖醇的試劑：辣根過氧化物酶（HRP）10 kU， 3-羥基-2、4、6-三碘苯甲酸4.5 mmol。N-2-羥乙基哌嗪N′-2-乙烷磺酸溶液80 kU ； 1， 5脫水葡萄糖醇標準液：4.5 μmol/L ， 1， 5-脫水葡萄糖醇標準液由山東三維公司生產。

1. 2 儀器 貝克曼奧林巴斯型全自動生化分析儀；UV-2600型分光光度計由島津公司生產。

1. 3 血清標本 糖尿病組100例患者（1型糖尿病患者21例， 2型糖尿病患者79例）， 均符合1985年WHO糖尿病分類及診斷標準， 其中男60例， 女40例， 年齡17～78歲。病程2個月～25年。健康對照組100例， 其中男53例， 女47例。年齡10～70歲， 其中10～29歲38例， 30～49歲32例， 50～70歲

30例。肝功能、腎功能均正常， 空腹血糖（FBG）、果糖胺（FA）， 無既往糖尿病史。

1. 4 方法

1. 4. 1 原理 首先去除葡萄糖的干擾作用：采用葡萄糖激酶處理血清， 經由葡萄糖激酶（GK）和丙酮酸激酶（PK）偶聯系統使血清中葡萄糖徹底轉化為不與吡喃糖氧化酶（PROD）反應的6-磷酸葡萄糖。然后加檢測試劑（見上文）， 其中的被測1， 5-AG氧化成1， 5-脫水果糖和H2O2， 在H2O2在4-AAP、POD的存在下， 可生成紅色醌亞胺化合物， 發生顯色反應進行比色測定[2]。

1. 4. 2 參數設置 定標液O濃度（蒸餾水）和304.5 μmol/L 1， 5-脫水葡萄糖醇。主波長545 nm， 次波長710 nm， 兩點終點法， 溫度37℃， 樣品量10 μl， （試劑1）200 μl， 反應5 min、（試劑2） 110 μl， 反應6 min， 讀取18和30點吸光度（A）。

1. 4. 3 分光光度計手工測試 空白管調零， 波長546 nm。樣品和試劑量按比例增減。讀取各管A。計算1， 5-AG（μmol/L）濃度=（測定管A/標準管A）×304.5。

1. 4. 4 干擾試驗對照方法 ①血糖（BG）測定采用葡萄糖氧化酶法。②糖化血紅蛋白（HbA1c）測定采用微柱親和層析法。③FA測定采用化學比色法。

1. 5 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示，采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2. 1 反應動力曲線 對蒸餾水、標準液及樣品的測定結果表明：呈一條靠近橫軸的基本平坦曲線， 蒸餾水空白加試劑1和吸光度A無大變化。標準液和樣品加入后反應過程相同， 只是加入試劑2后顯色急劇增加， 監測至25點時顯色達頂點。對標準曲線的零濃度標準（蒸餾水）重復測定20次， 求出平均數， 再加上3 s， 對應于標準曲線的1， 5-AG濃度為最低檢測限， 即1.98 μmol/L。與文獻報道[3]接近。

2. 2 線性與最低檢測限 G10膠聯葡聚糖凝膠電泳1份健康人混合血清， （反復測得1， 5脫水葡萄糖醇為1.4 μmol/L）一分為二， 1份內加入1， 5脫水葡萄糖醇標準物， 混勻后反復測定1， 5脫水葡萄糖醇為663 μmol/L。再用另一份混合血清作基樣將其稀釋成不同濃度（39、77、254、443、663 μmol/L）， 用本法連續作1， 5-AG定標5次， 生化分析儀自動擬合標準曲線， 回歸方程（X為濃度， Y為平均吸光度）為Y=（4.72×10-4）X+0.01555， r=0.9996。結果顯示在663 μmol/L以內線性符合要求。

2. 3 精密度實驗 連續測定20 d。取各種濃度混合血清各1份， 做批內和批間精密度實驗。變異系數（CV）≤5%， 實驗精密度相關性要求。

2. 4 準確度實驗 按回收試驗的方法進行操作， 得到平均回收率為99.8%。符合實驗準確度相關性要求[4]。

2. 5 特異性 ①糖類干擾試驗：取健康人混合血清1份， 再分別加入生理鹽水、10 g/L葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇及2.5 g/L麥芽糖溶液0.1 ml， 按本法測得基礎管1， 5-AG為223 μmol/L， 其余各管結果依次為237、233、223、228、224、231及240 μmol/L。干擾率≤±5%為允許誤差， 上述干擾物濃度不影響本法。②脂類及血紅蛋白（Hb）干擾物試驗：受檢人群血清中甘油三酯（TG）≤5.9 mmol/L， Hb≤3.4 g/L時都不會影響1， 5-AG測定結果。③膽紅素（Bil）干擾試驗：干擾率為-2.8%， 提示受檢人群上述膽紅素濃度存不影響1， 5-AG測定。④飲食物的干擾試驗： 健康人空腹與餐后2 h1， 5-AG、BG、FA及HbA1c結果比較差異無統計學意義（P>0.05）。提示1， 5-AG測定不受即時進食。

2. 6 正常參考值 用本法對100例健康對照組測得1， 5-AG為（170.6±48.2）μmol/L， 呈正態分布。男女比較差異無統計學意義意義（t=0.41， P>0.05）；各年齡段比較差異均無統計學意義（P>0.05）。

2. 7 糖尿病患者的檢測結果 100例糖尿病組患者血清1， 5-AG濃度為（30.7±16.4）μmol/L， 顯著低于健康對照組的（170.6±48.2）μmol/L（P<0.05）。若以健康組結果的95%界限

（ x-±1.96 s）為參考范圍， 取1， 5-AG下限（76.1 μmol/L）， HbA1c （7.24%）和FA（2.3 mmol/L）的上限及FBG（>6.66 mmol/L）作為診斷糖尿病的臨界值， 則對糖尿病診斷的敏感性分別為95.8%（46/48）。與文獻報道[5-12]接近。

3 小結

該法簡便快速、靈敏、準確和穩定、特異， 可用于糖尿病的及時診斷與監控， 適合于各類實驗室常規應用。

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[收稿日期：2016-11-14]