基于ISSR標記的12份桃種質資源遺傳多樣性分析

李建輝,陳 駿,劉麗麗,鄭雪良,楊海英,劉春榮

(浙江省衢州市農業科學研究院,浙江324000)

桃(Prunus persica)系薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)果樹,原產于中國,為我國主要水果種類之一。桃種質資源豐富,世界上約有3 000個不同品種和類型,我國大約有2 000多個品種[1]。作為浙江省的農業大市,衢州地區近年來先后從國內外引進和收集了一批優良桃品種,其中大多已成為當地主栽品種,取得了顯著的經濟社會效益。然而,在這些桃種質資源中,大多數品種的植株和葉片性狀差異不明顯,因此在外觀上很難區別,從而給準確進行資源的保存及利用帶來諸多不便。同時,衢州地區還有‘烏桃’和‘毛桃’等野生資源,其中‘烏桃’為高山野生水果,目前僅分布于常山縣的新橋、芙蓉、金源等鄉鎮,但‘烏桃’和‘毛桃’與當地主栽品種的親緣關系仍不明確,而相關研究迄今未見報道。

目前,用于遺傳多樣性研究的分子標記主要有限制性片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態DNA(RAPD)、簡單重復序列區間(ISSR)以及簡單序列重復(SSR)等技術[2-3]。其中ISSR作為簡便、快速、易行的分子標記技術,能夠比RAPD檢測到更多的遺傳變異[4]。近年來,ISSR標記已廣泛應用于果樹遺傳多樣性分析[5-7],并在桃種質資源研究中充分體現了該標記的重要性與高效性[1,8]。為此,本研究基于ISSR分子標記技術,對收集的12份桃種質資源進行遺傳多樣性分析,旨在進一步明確各材料之間的親緣關系,為后續開展種質資源創新與利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來源于衢州市農科院設立在柘川基地的桃種質資源圃,共12份(表1)。每份材料取著生有較多健康幼嫩葉片的枝條置于保鮮袋中,封口,于樣品貯藏箱(由超低溫冰袋保持冷藏條件)中迅速帶回實驗室,洗凈,晾干,置于-70℃超低溫冰箱中保存備用。

表1 12份桃種質資源Table 1 12 P.persica germplasm resources

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用改良的CTAB法進行桃基因組DNA的提取[9]。經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析,用Gel Doc XR凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)拍照定量,-20℃保存備用。

1.2.2 PCR擴增與產物鑒定

ISSR引物采用加拿大哥倫比亞大學(University of British Columbia,Set No.9,No.801—900)提供的序列(http:∕∕www.biotech.ubc.ca∕services∕naps∕primers∕Primers.pdf),由上海生工生物工程公司合成。 經優化的PCR擴增的最佳反應體系為:25 μL PCR反應體積,1×Taq酶配套緩沖液(10 mmol∕L Tris-HCl,pH 9.0,50 mmol∕L KCl,0.1%Triton X-100),0.25 μmol∕L 4 × dNTP,1.25 U Taq DNA 聚合酶,50 ng 模板DNA,0.3 μmol∕L引物,1.5 mmol∕L MgCl2。陰性對照加入除模板DNA外的以上各成分,用雙蒸水代替總DNA。經優化的PCR擴增程序為:94℃預變性5 min;94℃變性45 s,55—62℃復性45 s(不同引物退火溫度的詳細信息見表2),72℃延伸1.5 min,共35個循環;72℃延伸10 min,產物于4℃保存。

所有反應在Mastercycler ep gradient PCR儀(德國Eppendorf公司)中進行。PCR擴增反應中所用的試劑購自上海生工生物工程公司。擴增產物在含有0.2%GoldViewTM核酸染料(北京賽百盛基因技術有限公司)的2.0%的瓊脂糖凝膠中電泳,電泳緩沖液為0.5×TBE,用Gel Doc XR凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)拍照保存。

1.2.3 數據統計與分析

用DL2000標準分子量參照物(大連寶生物工程有限公司)做分子量標記,對照反應產物在凝膠上的相應位置,按擴增有無記錄電泳帶譜,有帶記為“1”,無帶記為“0”,得到ISSR表型數據矩陣。將矩陣輸入POPGENE 32軟件進行分析[10],計算多態位點百分率(P)、Shannon信息指數(I)、Nei基因多樣性(h)、遺傳相似度以及遺傳距離。再根據遺傳距離,采用算術平均數的非加權成組配對法(Unweighted pair group method arithmetic average,UPGMA)進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 12份桃種質資源的遺傳多樣性

從100個引物中篩選出在所有樣品中均可擴增出清晰條帶,且重復性好,同時陰性對照中無帶的12個引物(表2)作為正式擴增的ISSR引物,對12份桃種質資源的DNA樣品進行ISSR分析,共檢測到57條清晰可辨條帶,其中多態性條帶22條,總多態性條帶百分率P為38.60%,平均為31.87%(表3)。每條引物擴增條帶數量介于3—8條,平均4.75條。引物UBC856的擴增結果如圖1所示,12個樣品擴增的 DNA片段集中在200—2 000 bp。12份桃種質資源總 Shannon信息指數I為0.2006,平均0.1669;總Nei基因多樣性h為0.1349,平均0.1125。

圖1 12份桃種質資源的ISSR擴增結果(引物UBC856)Fig.1 ISSR amplification of 12 P.persica germplasm resources(by primer UBC856)

表2 用于ISSR分析的12個引物序列Table 2 Sequences of 12 primers used for ISSR analysis

表3 12份桃種質資源的遺傳多樣性指數Table 3 Genetic diversity indices of 12 P.persica germplasm resources

2.2 12份桃種質資源的遺傳相似度與遺傳距離

采用POPGENE 32軟件計算12份桃種質資源的遺傳相似度與遺傳距離,得到其矩陣。如表4所示,12份桃種質資源的遺傳距離介于0.0357—0.2589,變幅為0.2232,平均為0.1455;遺傳相似度介于0.7719—0.9649,變幅為0.1930,平均為0.8658。其中材料3和5之間的遺傳距離最小,為0.0357;遺傳相似度最大,為0.9649,表明材料3和5之間的親緣關系較近,遺傳差異較小。材料9和10、11以及2和10之間的遺傳距離最大,為0.2589;遺傳相似度最小,為0.7719,表明這些材料之間的親緣關系較遠,遺傳差異較大。

2.3 12份桃種質資源的聚類分析

根據12份桃種質資源的遺傳距離,采用UPGMA法進行聚類分析。根據聚類結果大致可將12份桃種質資源分為4個類群(圖2):第一類群包括材料1、2、3、5、12;第二個類群包括材料4、6、7、8、11;材料 9和10各歸為一類。

表4 12份桃種質資源的遺傳相似度與遺傳距離Table 4 Genetic similarities and genetic distances of 12 P.persica germplasm resources

圖2 12份桃種質資源的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 12 P.persica germplasm resources by UPGMA method

3 討論

本研究從100條ISSR引物中篩選得到12條引物對12份桃種質資源進行遺傳多樣性分析,從研究結果來看,這12條引物對供試樣品擴增穩定,條帶清晰明亮,多態性好,且幾乎每條引物都能擴出一個或若干個供試材料的特殊條帶,表明ISSR標記是一種經濟高效的分子標記技術,可有效應用于桃種質資源遺傳多樣性分析,從而為進一步研究和利用這些種質資源提供了分子生物學依據。

作為農作物育種研究的重要內容,種質資源遺傳多樣性的高低決定了其在育種實踐中的應用方向。對于果樹而言,由于其育種周期較長,因而開展種質資源遺傳多樣性評價就顯得尤為重要[11]。桃種質資源豐富,具有廣泛的品種多樣性。從本研究結果來看,12份桃種質資源總多態位點百分率P為38.60%,總Shannon信息指數I為0.2006,總Nei基因多樣性h為0.1349,P、I、h均表明12份桃種質資源總體水平的遺傳多樣性較高,這與前人研究得到的結論類似[12-14],表明桃種質資源確實存在豐富的遺傳多樣性。

從本研究中UPGMA聚類分析結果來看,12份桃種質資源可分為4個類群,其中‘烏桃’、‘毛桃’與其他桃品種間的親緣關系較遠,單獨歸為一類,這可能與‘烏桃’和‘毛桃’屬于較為原始的野生種質資源有關;其余10份桃品種相互之間遺傳距離較小,遺傳相似度較高,親緣關系較為接近,這可能是由于桃種質資源交流頻繁,同時經常在類群間進行人為雜交用于新品種或新品系的選擇,從而使得育成品種的基因存在廣泛的種質滲透,這與前人的研究結果基本一致[15-19]。同時,結合所用材料的生物學特征來看,早、中、晚熟桃品種的聚類結果存在相互交叉的現象,這在史紅麗等[12]的研究中也有類似的報道,究其原因,一者可能是控制早、中、晚熟性狀的基因只存在幾個堿基的變化,而ISSR標記無法對堿基的變異進行檢測;二者可能與桃遺傳多樣性相對復雜有關[12]。此外,白色和黃色果肉的桃品種在聚類結果中也出現了交叉現象,這可能與自然或人為因素導致的種質遷移或基因交換有關,也可能與所采用的ISSR標記產生的擴增條帶不足以將它們的遺傳信息加以區分有關[13]。

桃原產于中國,最遠可以追溯到周朝,逐漸傳播到亞洲周邊地區,后傳入日本。在本研究中,來自日本的‘白麗’、‘白鳳’2個桃品種與我國的3個桃品種聚在一起,表明日本品種與所選國內品種親緣關系十分接近,這與羅慧等[1]的研究結果相符。另外,從兩個蟠桃品種來看,其遺傳距離為0.1310,遺傳相似度為0.8772,表明經過不斷的栽培和變異之后,兩者的親緣關系已經逐漸變遠了。葛志剛等[20]對38個蟠桃品種進行SSR標記分析,聚類結果支持蟠桃多起源假說。同時,這也可能與分子標記本身或者在自然過程中發生了外源基因片段的滲入有關[20]。

[1]羅慧,丁廣文,郭啟高,等.基于ISSR標記的44份桃種質資源遺傳多樣性分析[J].西南大學學報(自然科學版),2015,37(5):45-50.

[2]李建輝,金則新.浙江省桐廬縣長葉榧居群遺傳結構的ISSR分析[J].植物研究,2011,31(6):722-728.

[3]白瑞霞,彭建營.DNA分子標記在果樹遺傳育種研究中的應用[J].西北植物學報,2004,24(8):1547-1554.

[4]李建輝,金則新,李鈞敏.瀕危植物長葉榧群體不同年齡級遺傳多樣性的RAPD和ISSR分析[J].浙江大學學報(理學版),2010,37(1):104-111.

[5]余賢美,艾呈祥.杧果野生居群遺傳多樣性ISSR分析[J].果樹學報,2007,24(3):329-333.

[6]潘鴻,何新華,李一偉,等.廣西野生楊梅資源遺傳多樣性的ISSR分析[J].果樹學報,2008,25(3):353-357.

[7]代紅艷,郭修武,張葉,等.山楂(Crataegus pinnatifidaBge.)遺傳多樣性的RAPD和ISSR標記分析[J].園藝學報,2008,35(8):1117-1124.

[8]HU D,ZHANG Z,ZHANG Q,et al.Ornamental peach and its genetic relationships revealed by Inter-simple sequence repeat(ISSR)fingerprints[J].Acta Horticulturae,2006,713:113-120.

[9]ROCHE P,ALSTON F H,MALIEPAARD C,et al.RFLP and RAPD markers linked to the rosy leaf curling aphid resistance gene(Sd1)in apple[J].Theoretical&Applied Genetics,1997,94(3):528-533.

[10]YEH F C,BOYLE T J B.Population genetic analysis of codominant and dominant markers and quantitative traits[J].Belgian Journal of Botany,1997,129:157.

[11]陳巍,王力榮,朱更瑞,等.基于SSR標記和生物學性狀進行桃遺傳多樣性的比較分析[J].植物遺傳資源學報,2009,10(1):86-90.

[12]史紅麗,韓明玉,趙彩平.桃遺傳多樣性的SRAP和SSR標記分析[J].華北農學報,2009,24(6):187-192.

[13]廖安紅,楊鑫,陳紅.貴州桃種質資源ISSR標記體系建立及遺傳多樣性分析[J].分子植物育種,2015,13(12):2773-2781.

[14]陳紅,楊鑫,安華明.貴州桃種質資源遺傳多樣性的SCoT分析[J].西北植物學報,2014,34(8):1559-1564.

[15]程中平,黃宏文.桃不同類群的遺傳多樣性及其遺傳結構的RAPD分析[J].武漢植物學研究,2004,22(1):27-32.

[16]程中平,陳志偉,胡春根.利用RAPD標記對桃不同類群的遺傳差異比較[J].武漢大學學報(理學版),2003,49(2):266-270.

[17]王富榮,趙劍波,佟兆國,等.桃種質資源親緣關系的研究進展[J].植物遺傳資源學報,2006,7(1):118-122.

[18]方偉超,王力榮,朱更瑞.桃(Prunus persica)品種資源結果習性遺傳多樣性與評價指標探討[J].果樹學報,2008,25(6):801-805.

[19]陸蘇瑀,俞明亮,馬瑞娟,等.硬肉桃品種群SSR標記的遺傳多樣性分析[J].植物遺傳資源學報,2010,11(3):374-379.

[20]葛志剛,俞明亮,馬瑞娟,等.蟠桃種質SSR標記的遺傳多樣性分析[J].果樹學報,2009,26(3):300-305.