溫度對豬糞漿N2O轉化的影響

陸 揚,王 通,,成艷芬,夏 東?

(1上海市農業科學院畜牧獸醫研究所,上海201106;2南京農業大學消化道微生物實驗室,南京210095)

氧化亞氮(N2O)是農業溫室氣體的重要來源,其溫室效應是二氧化碳(CO2)的310倍,甲烷(CH4)的15倍[1]。畜牧源N2O排放量占農業源N2O排放量的21.54%[2],主要來自畜禽糞便管理[3],其產生與消解涉及微生物的硝化和反硝化代謝反應[4]。硝化反應的第一限速酶氨單加氧酶(Ammonia monooxygenaes,AMO)的編碼基因amoA常被用于氨氧化菌(Ammonia oxidizing bacteria,AOB)的分子標記;分別編碼不同類群反硝化菌的亞硝酸還原酶(Nitrite reductase,NIR)的nirK和nirS,以及編碼反硝化菌的氧化亞氮還原酶(Nitrous oxide reductase,NOS)的nosZ則常被用于反硝化菌的分子標記。

溫度是影響N2O轉化的重要因素之一,但對此報道不一。有研究認為,溫度升高會增加N2O排放[5-6]。但也有研究報道,N2O的排放與氣溫和糞污溫度均沒有關系[7]。其不一致的原因一方面可能是N2O濃度遠低于其他兩種溫室氣體,檢測相對誤差高,且在現場測定時易受風等自然因素的干擾;另一方面N2O是反硝化反應的中間代謝產物,參與N2O轉化的各階段反應相對速度的改變可能會直接影響N2O的排放。本試驗通過研究不同溫度條件下N2O的產生與消解規律及代謝底物和可能參與代謝的功能基因豐度變化,旨在探究溫度影響N2O產生與消解機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、方法與分組

新鮮豬糞用去離子水以1∕2稀釋混勻制成糞漿,分裝于45個150 mL容積血清瓶。用橡膠塞和螺口蓋密封后,抽真空2 min,通高純空氣(78.09%N2,20.94%O2,0.93%Ar和0.033%CO2),重復抽、充氣3次后平衡氣壓。試驗按照培養溫度不同分為3組,每組15瓶,分別放入15℃、25℃和35℃的培養箱中培養。每組設5個采樣時間點(1 d、3 d、5 d、10 d和15 d),每個時間點取3個血清瓶進行采樣,作為3個重復。取樣方法如下,首先用經三通閥連接的氣密性注射器與壓力傳感器測定血清瓶中的氣體壓力和產氣量,然后將氣密式注射器取出的氣體保存在提前用高純氮氣反復抽洗3次以上的氣袋中保存,待測N2O濃度。取部分糞樣-20℃保存,用于測定三氮(氨態氮、亞硝態氮和硝態氮)濃度。

1.2 N2O濃度測定

氣相色譜法[俊齊儀器設備(上海)有限公司,GC-9890A]檢測N2O濃度[8]。檢測條件為Porapak Q填充柱(內徑4 m×3 mm),電子捕獲檢測器(ECD),進樣室100℃,柱溫50℃,檢測室320℃,載氣為99.999%氮氣,柱壓0.17 MPa,進樣量5 mL。標準氣體購自上海偉創標準氣體有限公司。

1.3 三氮的提取與測定

用1 mol∕L KCl溶液浸提,固液比為1∶10,浸提糞漿中的銨態氮、亞硝態氮和硝態氮,加1%硫酸鋅溶液,0.5%氫氧化鈉溶液和10%氫氧化鋁懸浮液,混勻后,12 000 r∕min離心5 min,上清液用于3種不同形態氮的測定。納氏試劑法用于測定銨態氮;格利斯試劑用于亞硝態氮測定;雙波長分光光度法用于硝態氮測定。

1.4 DNA提取與qPCR

取0.3 g糞漿,經PBS(120 mmol∕L,pH 8.0)洗3次后,加800 μL CTAB溶液(十六烷基三甲基溴化銨),用珠磨法機械破碎樣品(上海凈信科技有限公司),而后用酚和氯仿∕異戊醇提取其總DNA[9]。糞漿中氨氧化菌代謝酶(amoA)、反硝化菌代謝酶(nirK、nirS和nosZ)及總菌(tot)用qPCR方法定量(引物及反應條件見表 1)。 反應體系 20 μL:10 μL SYBR Green PCR Master Mix(Qiagen),1 μmol∕L 上、下游引物和80 ng DNA模板。所有qPCR反應在ABI 7500 Real-time PCR儀上進行。相應目的片段PCR產物經克隆測序驗證后,其質粒經梯度稀釋后用作標準曲線模板,無菌水做陰性對照模板。

1.5 數據分析

產氣量用氣壓進行校正。所有試驗數據經Excel進行初步計算后,用SPSS 13.0軟件中的單多因子方差分析法(One Way Anova)和一般線性模型(GLM Multivariate)進行方差統計,用最小顯著差異法(LSD)進行多重比較,P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。所得數據均以“平均值±標準差(Mean±SD)”表示。用Pearson法進行相關性分析,P＜0.05相關性顯著,P＜0.01為相關性極顯著。

表1 定量PCR各引物序列及溫度Table 1 Primer sequences and thermal cycling conditions used for qPCR

2 結果與分析

2.1 溫度對糞漿的產氣量及N2O轉化的影響

如圖1所示,35℃、25℃和15℃三個溫度處理組,分別在第1天、第3天和第10天開始檢測到有氣體產生,其后產氣量隨時間呈線性增加;同一時間點,以35℃組的產氣量最高,25℃次之,15℃最低,差異極顯著(P＜0.01)。

圖1 儲存糞漿的產氣量以及N2O濃度、含量和速率的變化Fig.1 Variation of emission of N2O from pig maure slurry with time

試驗開始時,糞漿上方為高純空氣,其中N2O濃度均在檢測下限,N2O含量可忽略不計。試驗開始后,3個組的N2O的濃度和含量都經歷了先升高后降低的過程(圖1)。3組的N2O累積量都在第3天達到峰值,按照溫度由低到高,N2O累積量依次為1.70 mg∕kg、2.57 mg∕kg和4.65 mg∕kg,3組之間差異極顯著(P＜0.01);從10 d開始,15℃處理組的N2O濃度就維持在0.6 mg∕L左右,該值接近大氣中N2O的背景值,而25℃和35℃處理組N2O濃度則低于大氣N2O濃度,并能繼續下降。

在試驗前3 d速率為正值(圖1),說明N2O的產生速度快于還原速度,N2O的累積主要發生在第1天,以35℃組最快,25℃次之,15℃最慢,3組之間差異極顯著(P＜0.01);在試驗后期速率為負值,說明N2O的還原速度快于產生速度,N2O的消解主要發生在5—10 d,仍以35℃組最快,25℃次之,15℃最慢,3組之間差異極顯著(P＜0.01)。

2.2 糞漿的三氮變化

糞漿中的銨態氮和硝態氮濃度在試驗期內持續增加,35℃處理組的銨態氮濃度極顯著高于其他兩組(P＜0.01),15℃處理組的硝態氮濃度在5 d以后顯著低于其他兩組(P＜0.05,圖2)。糞漿中亞硝態氮濃度僅為1.5—4.5 mg∕kg,各組亞硝態氮在5 d達到峰值,隨后逐漸降低,不同溫度處理組亞硝態氮沒有顯著差異(P＞0.05,圖2)。

圖2 糞漿的三氮變化情況Fig.2 Variation of concentrations of NH4+-N,N2O and NO3--N of pig manure slurry with time

2.3 糞漿中總菌及硝化、反硝化反應功能基因的變化

糞漿中總菌及硝化、反硝化反應功能基因的變化見表2。試驗前3 d的總菌、amoA、nirK和nirS豐度均顯著高于5 d及以后的相應基因豐度(P＜0.01),僅nosZ豐度差異不顯著(P＞0.05)。35℃組的總菌和nirK豐度顯著低于15℃和25℃組(P＜0.05),后兩組之間差異不顯著(P＞0.05)。溫度對nosZ豐度的影響有顯著的時間效應(P＜0.05),表現為3 d時,25℃組nosZ豐度顯著低于其他兩組(P＜0.05),15℃和35℃組之間差異不顯著(P＞0.05);15 d時15℃組nosZ豐度顯著高于其他兩組(P＜0.01),25℃和35℃組之間差異不顯著(P＞0.05),其他時間3組之間無顯著差異(P＞0.05)。溫度對amoA和nirS豐度的影響則不顯著(P＞0.05)。相關性分析結果表明,N2O的排放速率與總菌、amoA、nirK、nirS和nosZ豐度都顯著相關,相關系數分別為0.64、0.62、0.66、0.58和0.49(P＜0.01,表2)。由于nosZ是唯一的N2O還原酶,用其他各基因豐度與nosZ豐度的差值進行相關性分析,結果表明僅nirK∕nosZ與N2O的排放速率顯著相關,相關系數為0.57(P＜0.01,未列出)。

表2 每克糞漿中總菌及硝化、反硝化反應功能基因拷貝數的變化Table 2 Variations of total bacteria and amoA,nirK,nirS and nosZ gene copy numbers per gram manure slurry

3 討論

畜牧源N2O排放主要來自糞污后期管理,包括糞污的儲存與處理。Wang等[5]報道,沼液的存儲溫度從5℃上升到25℃,其總氮排放從8.9%上升到41.9%,25℃是N2O排放顯著增加的臨界溫度。陸日東等[6]報道,5—35℃范圍內,溫度越高牛糞N2O排放越多。本試驗開始時,糞漿上方是高純空氣,因此,前期結果與上述在開放條件下測定的結果基本一致。由于是密閉的試驗體系,隨著氧的耗竭,血清瓶內形成嚴格厭氧環境,試驗前期累積的N2O被進一步還原成N2,N2O濃度和含量開始下降。溫度升高不但會加速N2O累積,還會加速N2O還原,3個處理組的N2O濃度和含量都同時在第3天達到峰值,并在10 d后,N2O濃度都下降到甚至低于大氣的本底值。以上結果說明,過短的厭氧處理時間會增加N2O的排放,當厭氧處理時間超過10 d時,N2O排放可忽略不計。提示,為了減少N2O排放,養殖場糞污厭氧處理時間不可少于10 d。

N2O產生與消解涉及微生物的硝化和反硝化代謝反應[4]。定量PCR結果表明,在N2O減少的階段(5—15 d)糞漿中的總菌、amoA、nirK和nirS豐度均顯著低于N2O增加的階段(1—3 d),但兩個階段的nosZ豐度差異不顯著,而后者是將N2O還原的關鍵代謝酶,因此,在試驗后期N2O的含量下降可能是由于N2O的生成速度降低,還原速度超過了生成速度造成的。Levy-Booth等[12]報道,土壤中的amoA、nirK、nirS和nosZ豐度與N2O排放顯著相關;Cui等[13]報道土壤中nirK和nirS與N2O排放都顯著相關,但nirS相關性更強。本研究中amoA、nirK、nirS和nosZ豐度都與N2O排放顯著相關,相關系數分別為0.62、0.66、0.58和0.49(P＜0.01),說明硝化和反硝化反應的各階段都可影響糞漿N2O的排放。

Poh等[14]認為,反硝化反應各環節的還原速度受溫度影響不一致,是溫度升高引起N2O排放增加的原因之一,如從25℃升高到35℃時,反硝化反應過程中的硝態氮、亞硝態氮和N2O還原速率分別上升了62%、61%和41%。本試驗并未發現各代謝酶基因隨溫度的升高而豐度增加,相反,35℃組的總菌和nirK豐度顯著低于15℃和25℃組(P＜0.05);35℃組的nosZ豐度也在3 d和15 d時顯著低于15℃組(P＜0.05),溫度對amoA和nirS豐度的影響則不顯著(P＞0.05)。出現以上結果的可能原因是在任何一個封閉的環境都存在群體效應,受營養物質或代謝產物的限制,會出現衰退期,溫度的升高可能會加快菌的新陳代謝,在提高代謝效率的同時加速了菌的死亡。事實上,N2O的排放同時受其生成和還原的共同影響,不是由單一的菌或單一的酶決定的,本試驗將與N2O生成可能有關的代謝酶豐度與其唯一還原酶nosZ的豐度相減后進行相關性分析,結果表明僅nirK∕nosZ與N2O的排放速率顯著相關(0.57,P＜0.01),說明N2O排放可能與反硝化菌中nirK與nosZ的相對數量關系更密切。

除溫度外,底物濃度也會影響N2O的排放。Huang等[15]報道,高氨氮會引起亞硝態氮的積累,增加N2O排放。Kim等[16]報道,硝酸鹽濃度為1 500 mg∕L時,污水中25%—40%的硝酸鹽轉化為N2O,當硝酸鹽濃度降為750 mg∕L時,反硝化終產物中則檢測不到N2O。以往研究認為,亞硝酸氮是引起N2O累積的重要原因,但近來研究表明,質子化的亞硝酸氮,即游離亞硝酸(Free nitrous acid,FNA)才是污水處理過程中抑制細菌生長和增加N2O產生的真正原因[17]。當FNA濃度達到0.42—1.72 mg N∕L時,AOB的活性降低50%;當 FNA濃度達到 0.011—0.070 mg N∕L時,硝化反應開始受到抑制,當達到 0.026—0.220 mg N∕L時,硝化反應完全受到抑制;當FNA濃度達到0.010—0.025 mg N∕L時,反硝化反應下降40%,當達到0.2 mg N∕L時,反硝化反應完全停止。本試驗中,隨著有機氮被分解成無機氮,糞漿內銨態氮和硝態氮都持續升高,在第15天時35℃的分別達到1 500 mg N∕L和100 mg N∕L,雖然亞硝酸氮在前5 d升高,隨后降低,似乎與N2O的累積的變化規律相似。FNA受硝酸氮濃度、溫度和pH的共同影響,通過公式[18]計算,本試驗的FNA濃度在0.08—0.69 μg N∕L,遠低于以上報道閾值,說明厭氧處理糞漿時,不會因亞硝酸的累積而導致N2O的大量生成。

4 結論

溫度升高會加快糞漿N2O生成和還原,提高其排放峰值,但不影響其轉化的時間節律。硝化和反硝化菌可能都參與了N2O的轉化,但反硝化代謝酶nirK與nosZ可能在N2O排放中起關鍵作用。

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