染色質解旋酶DNA結合蛋白7表達與肝癌臨床病理特征及預后的關系

陳 穎,鄧周峰,江衛(wèi)華,周 嘉,蘇明琪,韓 駿,張 輝*

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院 腫瘤科，上海200336；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院 肝膽外科，上海200336；3.第二軍醫(yī)大學附屬東方肝膽醫(yī)院 肝外三科，上海200438)

染色質解旋酶DNA結合蛋白7表達與肝癌臨床病理特征及預后的關系

陳 穎1,鄧周峰1,江衛(wèi)華1,周 嘉2,蘇明琪2,韓 駿3,張 輝2*

(1.上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院 腫瘤科，上海200336；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院 肝膽外科，上海200336；3.第二軍醫(yī)大學附屬東方肝膽醫(yī)院 肝外三科，上海200438)

目的 通過研究肝癌組織內染色質解旋酶DNA結合蛋白7(CHD7)的表達及其與肝癌患者臨床病理特征及預后的關系，探討CHD7作為肝癌預后預測指標的可行性。方法 將286例肝切除術后病理確診為肝細胞肝癌的標本制作成組織芯片。采用免疫組化法檢測肝癌及癌旁肝組織中CHD7的表達水平，分析其與肝癌患者臨床病理特征及預后之間的關系。結果 免疫組化結果顯示CHD7在肝癌組織中表達明顯高于對應的癌旁肝組織。CHD7高表達與腫瘤數(shù)目、腫瘤包膜完整性、腫瘤血管侵犯、TNM分期及BCLC分期密切相關，與肝癌患者術后總體生存率呈負相關，而與肝癌患者術后復發(fā)率呈正相關。結論 CHD7在肝癌中明顯高表達，可作為肝癌患者預后的獨立預測指標之一。

肝細胞肝癌 (HCC)；染色質解旋酶DNA結合蛋白7(CHD7)；預后；組織芯片

(ChinJLabDiagn,2017,21:0761)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是致死率最高的惡性腫瘤之一[1]。隨著圍手術期處理方法、外科切除、肝移植以及部分輔助療法的成熟，肝癌五年生存率有了一定程度的提高[2]。但是，肝癌術后復發(fā)，肝內、肝外轉移的風險仍較大[3,4]。因此，全面了解肝癌復發(fā)與轉移的分子生物學機制，尋找對預后和治療有指導意義的分子標記非常重要。

染色質解旋酶DNA結合蛋白7(CHD7)是染色質解旋酶DNA結合蛋白家族中的一種，為ATP依賴型的染色質重塑體，其生物學功能多與人先天性畸形相關，并且在小細胞肺癌、胰腺癌等多種腫瘤中異常表達和活化，調控腫瘤細胞增殖、侵襲等功能[5-7]。本研究通過組織芯片行免疫組化明確286例行根治性切除術的肝細胞癌患者腫瘤相關組織中CHD7的表達情況，分析CDH7與肝癌患者臨床特征及預后之間的關系，探討CHD7在肝癌中的表達差異及作為肝癌預后預測指標的可行性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2006-2011年在上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院就診的行肝癌根治性切除患者286例，所有患者均經病理診斷確診為肝細胞肝癌，每位患者的組織標本取癌與癌旁各2個點。所有患者術后均復查甲胎蛋白(alpha -fetal protein，AFP)、B超(3年內每3個月一次，3年以后每半年一次)，磁共振(每年一次)，以監(jiān)測腫瘤有無復發(fā)轉移。如果出現(xiàn)復發(fā)轉移則根據(jù)患者一般情況、腫瘤的大小、位置及肝外轉移情況評估后行再次手術或介入、放射、射頻消融等治療。所有患者隨訪時間至2016年6月，標本收集經上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 免疫組織化學染色(IHC)

免疫組化試劑盒購自基因科技(上海)有限公司。組織芯片由上海芯超生物科技有限公司制作，常規(guī)烘烤切片，依次經二甲苯、酒精處理脫蠟后PBS清洗、經H2O2滅活內源性過氧化物酶及檸檬酸修復抗原處理，加CHD7抗體(美國Abcam 公司，1∶200稀釋)4℃度孵育過夜，二抗37℃孵育0.5 h，PBST清洗后DAB顯色液顯色，蘇木精復染、封片。

1.3 免疫組化結果判讀

由兩位病理科醫(yī)師雙盲方式獨立評分，棕黃色顆粒狀沉積物為陽性。按陽性染色細胞數(shù)占總細胞數(shù)百分比分4級：無陽性染色細胞為0分，≤34%陽性細胞數(shù)為1分，陽性細胞數(shù)量在34%-66%之間為2分，≥66%以上陽性細胞數(shù)為3分。按照染色強度分為4個等級分別為：無染色為0分,弱陽性1分，中度陽性2分，強陽性3分。綜合陽性染色細胞數(shù)評分和染色強度評分(兩項相乘)，0-6分為CHD7低表達(CHD7 low)，>6分為CHD7高表達(CHD7 high)。

1.4 統(tǒng)計學處理

利用SPSS 17.0(SPSS，Chicago，IL)進行統(tǒng)計分析。CHD7表達情況與其他臨床病理特征之間關系用Pearson卡方檢驗驗證。繪制總生存和復發(fā)的Kaplan-Meier生存曲線，并對其進行Log-rank檢驗。用單因素和多因素分析研究各因素對預后的影響。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CHD7在肝癌組織及癌旁組織中的表達情況

為了解CHD7在肝癌組織中的表達情況，對286例根治性肝細胞癌切除術后患者癌及癌旁肝組織制成的組織芯片行免疫組織化學染色，結果顯示CHD7蛋白定位于腫瘤及正常肝組織的細胞核內，CHD7在肝癌組織中的表達明顯高于對應癌旁正常肝臟組織(63%vs12%，P<0.05)，見圖1。

圖1 CHD7在肝癌組織及癌旁組織中的免疫組化染色結果(×100)

2.2 CHD7在肝癌組織中表達與肝癌臨床病理特征的關系

在286例患者中，肝癌組織中CHD7表達與腫瘤數(shù)目(P=0.004)、腫瘤包膜完整性(P=0.012)、腫瘤血管侵犯(P=0.026)、TNM分期(P=0.03)及BCLC分期(P=0.04)密切相關，而與患者的性別(P=0.21)、年齡(P=0.797)、AFP(P=0.467)、肝硬化(P=0.399)及腫瘤大小(P=0.906)均無關。CHD7蛋白在肝癌的表達情況及與患者臨床病理參數(shù)之間的關系見表1。

2.3 CHD7在肝癌組織中表達與患者預后的相關性

應用Kaplan-Meier生存曲線研究CHD7表達與HCC患者預后的相關性，286例患者均獲得隨訪資料，Kaplan-Meier生存權限分析顯示CHD7 high(n=180)組的總生存率明顯低于CHD7 low組(n=106)(P=0.0347),而肝癌腫瘤的復發(fā)率CHD7 high組(n=180)則高于CHD7low組(n=106)(P=0.0291)，見圖2。

表1 CHD7的表達與肝癌臨床病理因素之間的關系

#χ2test

COX比例風險回歸模型進行單因素分析結果顯示：CHD7表達(P=0.038)、腫瘤血管侵犯(P<0.001)、AFP(P<0.001)、腫瘤大小(P<0.001)及腫瘤數(shù)目(P<0.001)是HCC患者總生存的不良因素，而CHD7表達(P=0.032)、腫瘤血管侵犯(P<0.001)、AFP(P=0.001)、腫瘤大小(P<0.001)及腫瘤數(shù)目(P<0.001)是HCC患者腫瘤復發(fā)的不良因素。COX逐步回歸的多因素分析結果表明CHD7高表達可以作為預測HCC患者不良預后的獨立因素，見表2,3。

3 討論

外科手術切除是肝細胞癌治療的首選及最主要的治療手段[8]。隨著外科手術技術的發(fā)展與成熟，肝癌的切除率逐漸提高。但由于長期受到環(huán)境與基因交互作用，肝細胞癌術后復發(fā)及轉移率仍然較高，多數(shù)患者預后較差[9-11]。篩查術后高危復發(fā)人群并及時干預，是降低復發(fā)、轉移率，提高肝癌手術切除療效的關鍵。雖然目前研究已揭示了部分肝細胞癌相關的原癌基因與抑癌基因，但對于其復發(fā)與轉移的分子生物學機制與通路仍了解有限[12,13]。因此，探究可以有效鑒定復發(fā)及轉移風險的分子標記來預測患者的生存風險并指導治療方案十分必要。

圖2 CHD7在癌組織中高低表達的總體生存率和復發(fā)率

表2 患者總生存期的單因素分析和多因素分析

*HR:hazard ratio

表3 患者腫瘤復發(fā)的單因素分析和多因素分析

*HR:hazard ratio

染色質解旋酶DNA結合蛋白家族屬于ATP依賴的染色質重組SNF2超家族，由9個蛋白組成(CHD1-CHD9)。該家族蛋白以N端相同的染色質串聯(lián)域以及ATP依賴的解螺旋酶區(qū)域為特點。N端染色質域可識別并結合核小體，介導染色質相互作用。而ATP依賴的解螺旋酶區(qū)域參與轉錄、復制、重結合、DNA修復等細胞核生物學功能。因此CHD家族蛋白廣泛參與正常的細胞、組織發(fā)展過程，其突變與多種疾病密切相關[14-17]。CHD7具體的功能目前仍處于研究狀態(tài)，多與染色質重塑相關。在目前的研究中，突變的CHD7可引起嚴重的多系統(tǒng)器官異常的CHARGE綜合征，致死率較高[7,15]。CHD7在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也起到重要作用。Pleasance等[5]研究發(fā)現(xiàn)，CHD7在非小細胞型肺癌中重排列，與細胞損傷修復異常相關，對肺癌的進展有一定促進作用。在Lauren E.Colbert等[6]的研究中，降低CHD7的表達可提高胰腺癌病人術后無復發(fā)生存率與總體生存率，并可作為胰腺導管腺癌預后評價的分子標記。綜上說明，CHD7對腫瘤的進展和轉移起到重要的促進作用。目前我們的研究發(fā)現(xiàn)CHD7在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁非癌組織，肝癌組織中CHD7表達與腫瘤數(shù)目、腫瘤包膜完整性、腫瘤血管侵犯、TNM分期及BCLC分期密切相關。與此同時，通過Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)CHD7高表達的HCC患者預后明顯較差，而低表達的HCC患者預后相對較好，提示CHD7與HCC患者預后緊密相關，進一步的COX逐步回歸的多因素分析證明了CHD7是預測HCC患者預后的獨立因素之一，因此我們推測CHD7可以作為預測HCC患者獨立預后的分子標記。

總之，CHD7在肝癌組織中呈高表達，其表達水平與腫瘤的不良臨床病理特征密切相關；CHD7的高表達是肝癌根治性切除術后的總體生存率和無瘤生存率的獨立預后因素之一，可以作為肝癌患者預后的預測指標。通過對肝癌組織中CHD7的檢測，及時發(fā)現(xiàn)高危復發(fā)患者，有助于實現(xiàn)肝癌的個體化治療，可有效降低復發(fā)率，提高長期生存時間。

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Correlation of chromodomain helicase DNA binding protein 7 expression with clinical and pathological characteristics and prognosis of hepatocellular carcinoma

CHENYing,DENGZhou-feng,JIANGWei-hua,etal.

(DepartmentofOncology,TongrenHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200336,China)

Objective To explore the clinical significance of chromodomain helicase DNA binding protein 7(CHD7) expression in hepatocellular carcinoma(HCC)and association between CHD7 expression and survival in HCC patients．Methods With the use of immunoreactivity,CHD7 expression and its correlation with other clinicopathological characteristics were examined in a tissue microarray that contains samples from 286 HCC patients．Results HCC tissues expressed markedly higher levels of CHD7 than did adjacent non-tumor tissues,overexpression of CHD7 significantly correlates with tumor number，capsular formation，microvascular invasion,TNM Stage,BCLC Stage and shorter overall survival with higher recurrence rates in HCC patients after curative resection．Conclusion The expression levels of CHD7 in HCC are significantly higher，may be an independent prognostic factor for HCC patients．

hepatocellular carcinoma;chromodomain helicase DNA binding protein 7;prognostic;Tissue chip

上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會面上項目(201640275)

*通訊作者

1007-4287(2017)05-0761-05

R735.7

A

陳穎，36歲，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：消化道腫瘤的基礎和臨床研究。

2017-01-17)