MiR-29a和PTEN在腎缺血再灌注損傷中的臨床意義

李德輝,毛 毅

(重慶市開縣人民醫院 輸血科,重慶 開縣405400)

*通訊作者

MiR-29a和PTEN在腎缺血再灌注損傷中的臨床意義

李德輝,毛 毅*

(重慶市開縣人民醫院 輸血科,重慶 開縣405400)

目的 探討miR-29a和PTEN在腎缺血再灌注損傷中的表達以及臨床意義。方法 飼養SD大鼠50只，構建腎缺血再灌注損傷模型，全自動生化分析儀檢測大鼠血清血肌酐、尿素氮水平，qRT-PCR檢測miR-29a的表達，western blot檢測PTEN的表達，分析miR-29a、PTEN和腎功能的相關性。結果 腎缺血再灌注損傷模型中大鼠血清血肌酐、尿素氮水平以及PTEN表達水平顯著升高，miR-29a的表達水平顯著降低。相關性分析表明miR-29a和PTEN、Scr和BUN均有顯著負相關性；而PTEN和Scr、BUN水平均有顯著正相關性。結論 在RIRI中，miR-29a和PTEN的表達和腎缺血再灌注損傷導致的腎功能損傷有顯著的聯系，為針對miR-29a及PTEN基因靶向治療RIRI提供一定的實驗基礎。

腎缺血再灌注損傷；miR-29a；PTEN；血清血肌酐；尿素氮

(ChinJLabDiagn,2017,21:0806)

腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是指腎組織在缺血的基礎上恢復供血以后導致組織器官的損傷程度反而加重的現象，是臨床上是急性腎損傷的常見原因之一。RIRI能夠對腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)造成不可逆性的損傷，明顯損害腎功能，影響移植腎早期功能的恢復和長期存活，嚴重影響治療效果和患者的健康[1,2]。RIRI是一個復雜的多因素調控的過程，近年來關于RIRI發生機制的研究頗多，但是確切的病理生理機制并沒有明確，還未找到理想的調控靶點。因此，探索RIRI的機制對臨床上RIRI的預防、診斷和治療顯得十分重要。

MicroRNA(miRNA)是在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼的單鏈小RNA，其和組織缺血再灌注損傷中有著密切的聯系[3-5]。最近研究表明miR-29在RIRI中的表達存在變化[6]，但是其和RIRI的進展之間的關系還不明確。本研究通過分析miR-29以及其潛在靶基因PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)在RIRI中不同時間點的表達變化，分析其和腎損傷的相關性，明確miR-29和PTEN在臨床上對RIRI的診斷意義。

1 材料與方法

1.1 材料

戊巴比妥鈉，北京普博斯生物科技公司；TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit購自invitrogen，SYBR Green購自Takara；引物合成于蘇州金唯智；PTEN、β-actin抗體購自Santa Cruz公司；二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物飼養以及RIRI模型構建

清潔級雄性SD大鼠50只，體質量(200±20) g，鼠齡5周左右，飼養于21℃-25℃， 65%-70%濕度，自然光照周期環境中飼養，術前自由進食和飲水，適應性飼養7天，各組大鼠均以同樣的飼養條件。大鼠采用隨機數字表法分為假手術組(sham operation group，SO group)、RIRI組(RIRI group)，兩組有各分為5個時間點：0天、1天、2天、5天、7天，每個時間點5只。參照文獻[7]的手術方式進行RIRI模型構建：3%戊巴比妥鈉按照1-1.5 ml/kg的比例進行腹腔注射麻醉。經腹正中切口，用眼科剪打開大鼠皮層，游離大鼠皮層肌層以及腹腔，切除大鼠左側腎臟，找到并游離分出右側腎蒂，用無損動脈夾夾閉腎蒂40 min后恢復灌注，RIRI模型構建后腎臟立即由紅色變為黑紫色，SO group僅暴露腎蒂不夾閉。45 min后小心去除無損動脈夾恢復血流灌注，觀察腎臟顏色由暗紅色或蒼白色慢慢變為鮮紅色，表明成功恢復腎臟血流灌注；然后向腹腔注射1 ml滅菌生理鹽水以恢復腹腔環境。手術完畢，分層縫合關閉腹腔后將大鼠置于常規環境飼養，注意給大鼠保溫并恢復正常飲食，觀察大鼠生命體征。分別于0天、1天、2天、5天、7天斷頸法處死大鼠，取大鼠心臟血液5 ml。從大鼠背部正中取一手術切口切除腎臟，快速放入液氮中速凍備用。

1.3 腎功能檢測

經大鼠心臟采血5 ml，室溫放置，2 500 r /min，離心10 min，留取上層血清，Olympus AU2700 全自動生化分析儀檢測大鼠血清血肌酐(Serum creatinine，Scr)、尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)水平。

1.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

MiR-29a表達采用qRT-PCR檢測。收集組織樣品，液氮研磨，加入1 ml Trizol提取液提取組織總RNA。miRNA逆轉錄采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit進行。qPCR采用SYBR Green法檢測。反應體系為：cDNA 5.0 μl；上游引物0.5 μl；下游引物0.5 μl；2× SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，ddH2O 4.0 μl，總體積為20 μl。qPCR擴增條件為：94 ℃預變性5 min，然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 30 s進行40個循環。以GAPDH表達為內參，相對表達水平采用2-ΔΔCt進行計算。每個樣重復3次。檢測引物如表1。

表1 檢測引物序列

1.5 Western blot

收集組織樣品，利用全蛋白提取試劑盒抽提腎組織總蛋白。BCA法測定總蛋白濃度，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，電轉；一抗(PTEN稀釋比為1∶5 000，β-actin 為1∶5 000)，37℃孵育2 h，二抗室溫孵育1 h，暗室放X-光片夾中，曝光顯影、定影，用圖像分析軟件( Image Pro.Plus 6.0)對目的條帶的灰度進行分析。

1.6 數據統計

2 結果

2.1 大鼠的腎功能變化

Scr、BUN水平常用于反映腎功能的變化。和SOgroup相比，RIRIgroup的Scr水平在各個時間點均顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。和SOgroup相比，RIRIgroup的BUN水平在各個時間點(0h除外)均顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。Scr、BUN水平在1天后達到最大值，然后隨著時間的推移，Scr、BUN水平逐漸下降，7天后接近SOgroup。結果如表2所示。

2.2MiR-29a和PTEN在各組大鼠腎組織中的表達

MiR-29a的表達采用qRT-PCR檢測，結果如表3所示。和SOgroup相比，RIRIgroup的miR-29a水平在各個時間點均顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。MiR-29a的表達在1天后達到最小值，然后隨著時間的推移，miR-29a的表達水平逐漸上升，7天后接近SOgroup。PTEN的表達采用westernblot檢測，結果如圖1和表3所示。和SOgroup相比，RIRIgroup的PTEN水平在各個時間點(0h除外)均顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。PTEN的表達在1天后達到最大值，然后隨著時間的推移，PTEN的表達水平逐漸下降，7天后接近SOgroup。

表2 各組中Scr、BUN水平

注：*表示P<0.05

表3 各組中miR-29a和PTEN表達水平

注：*表示P<0.05

圖1 PTEN在各組中的表達

2.3 實驗組大鼠腎組織MiR-29a和PTEN表達的相關性以及和腎功能的相關性

由表1和表2可知：從RIRI各個時間點來看，Scr、BUN和PTEN水平在1天后達到最大值，然后隨著時間的推移，Scr、BUN和PTEN水平逐漸下降，7天后接近SO group，而miR-29a的表達在1天后達到最小值，然后隨著時間的推移，miR-29a的表達水平逐漸上升，7天后接近SO group，該結果表明在RIRI中Scr、BUN和PTEN的表達具有相同的變化趨勢，而和miR-29a的表達趨勢相反，推斷PTEN和Scr、BUN的表達可能具有正相關性，而miR-29a和Scr、BUN的表達可能具有負相關性。通過生物信息學分析表明PTEN可能為MiR-29a的潛在靶基因。相關性分析結果如表3所示，該結果表明MiR-29a的表達和PTEN、Scr和BUN的表達具有顯著負相關性(P<0.001)，PTEN的表達和Scr、BUN水平具有顯著正相關性(P<0.001)。

表3 相關性分析(相關系數r)

注：r值均為P<0.001

3 討論

RIRI能夠對RTECs造成不可逆性的損傷，明顯損害腎功能。Scr、BUN水平常用于反應腎功能的變化，本研究表明RIRI中Scr和BUN水平顯著升高，其中在1天后升高達到最高點，隨后Scr、BUN說逐步降低，7天后Scr、BUN水平接近SO group，該結果表明RIRI能夠損傷腎功能，模型構建成功。

MiR-29a是miR-29家族中的一個重要組成部分，在生物體內發揮重要的作用。在糖尿病小鼠中，miR-29表達下調，和SCr和BUN水平呈負相關，過表達miR-29能夠抑制高糖環境導致的RTECs的損傷[8]。miR-29家族和缺血再灌注損傷也有著密切的聯系。有研究表明下調miR-29a的表達能夠保護心臟免受缺血再灌注損傷[6,9]。本研究表明miR-29a在RIRI中的表達降低，和李和文實驗結果類似，李和文[10]采用基因芯片分析表明在RIRI中miR-29在RIRI中表達顯著下調。本研究還表明miR-29的表達在1天后降低到最低點，隨后miR-29a的表達逐步升高，7天后miR-29a的表達接近SO group， miR-29a的表達和Scr和BUN的水平呈顯著負相關，該結果提示miR-29a和腎功能損傷程度呈負相關。在RIRI中，RTECs的凋亡是RIRI的早期的病理生理變化和主要的病理表現特征。mir-29a在其他疾病研究中已被認為是強有力的抗凋亡因子，它通過抑制靶基因的表達發揮其抗凋亡作用[11,12]，同時miR-29a能夠阻止其他原因導致的RTECs的凋亡，保護腎組織和功能[13]。所以本研究認為mir-29a可能能夠抑制由RIRI造成RTECs凋亡從而對腎組織起到保護作用，調控miR-29a的表達可能能夠改善RIRI導致的腎功能損傷。

MiRNA一般通過結合靶基因的3′-UTR調控靶基因的轉錄。miR-29a的潛在靶基因有PUMA (P53 up-regulated modulator of apoptosis)[14]，Cdc42 (cell division control protein 42)和Srgap2 (SLIT-ROBO Rho GTPase-activating protein 2)[15]，PTEN等。本研究結果表明PTEN的表達和miR-29a的表達呈負相關，說明在RIRI中miR-29a可能調控PTEN的表達。RIRI發生機制復雜，目前認為可能與氧自由基生成、細胞內鈣超載、炎癥因子的激活、膜脂質過氧化等多種因素有關。PTEN為一新發現的抑癌基因，通過阻止細胞生長、過快分裂或者分裂不受控制，進而調控細胞分裂周期，在細胞生物學行為中發揮重要作用。下調PTEN能夠減少ROS和炎癥因子的表達，改善腸道缺血再灌注損傷[16]；在RIRI中，HIF-1/miR-687/PTEN信號通路通過下調PTEN的表達改善RIRI導致腎功能損傷[17]。本研究結果表明PTEN的表達和Scr和BUN的水平呈顯著正相關，該結果表明PTEN和腎功能損傷程度呈正相關，能夠作為臨床上RIRI的診斷基因，抑制PTEN的表達可能能夠減少ROS和炎癥因子的表達，減弱RIRI導致的腎功能損傷。

總之，在RIRI中，PTEN可能是miR-29a調控的靶基因，miR-29a和PTEN的表達和腎缺血再灌注損傷導致腎功能損傷有顯著的聯系，為針對miR-29a及PTEN基因靶向治療RIRI提供一定的實驗基礎。但是在RIRI中miR-29a對PTEN是否存在調控作用，參與調控的下游信號通路以及能否對RIRI的預防和治療有作用還待進一步探討，下一步擬采用細胞和動物RIRI模型分析調控miR-29a和PTEN對RIRI的預防和治療作用，為RIRI的治療提供更多的實驗思路。

[1]Dragun D,Hoff U,Park JK,et al.Ischemia-reperfusion injury in renal transplantation is independent of the immunologic background[J].Kidney Int,2000,58(5):2166.

[2]Park SS,Caballero S,Bauer G,et al.Long-term effects of intravitreal injection of gmp-grade bone-marrow-derived cd34+ cells in nod-scid mice with acute ischemia-reperfusion injury[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2012,53(2):986.

[3]Hu H,Jiang W,Xi X,et al.Microrna-21 attenuates renal ischemia reperfusion injury via targeting caspase signaling in mice[J].Am J Nephrol,2014,40(3):215.

[4]Lorenzen JM,Kaucsar T,Schauerte C,et al.Microrna-24 antagonism prevents renal ischemia reperfusion injury[J].J Am Soc Nephrol,2014,25(12):2717.

[5]吳 玨,劉 芬,阮瓊芳,等.Mirna-92a在缺血再灌注腎損傷中的表達變化[J].實驗與檢驗醫學,2010,28(1):9.

[6]Ye Y,Perez-Polo JR,Qian J,et al.The role of microrna in modulating myocardial ischemia-reperfusion injury[J].Physiol Genomics,2011,43(10):534.

[7]梅 玫,申兵冰,趙洪雯,等.瞬時受體電位通道m7和程序性壞死標志物rip1在大鼠腎臟缺血再灌注損傷中的表達及意義[J].第三軍醫大學學報,2014,36(16):1689.

[8]Zhou L,Xu DY,Sha WG,et al.High glucose induces renal tubular epithelial injury via sirt1/nf-kappab/micror-29/keap1 signal pathway[J].J Transl Med,2015,13(352):015.

[9]Ye Y,Hu Z,Lin Y,et al.Downregulation of microrna-29 by antisense inhibitors and a ppar-gamma agonist protects against myocardial ischaemia-reperfusion injury[J].Cardiovasc Res,2010,87(3):535.

[10]李和文.腎缺血再灌注損傷中mirna表達譜篩選及mir-98調控huvec凋亡的作用[D].第二軍醫大學,2015.

[11]Matsumoto Y,Itami S,Kuroda M,et al.Mir-29a assists in preventing the activation of human stellate cells and promotes recovery from liver fibrosis in mice[J].Mol Ther,2016,2(10):127.

[12]Hu W,Dooley J,Chung SS,et al.Mir-29a maintains mouse hematopoietic stem cell self-renewal by regulating dnmt3a[J].Blood,2015,125(14):2206.

[13]Lin X,Zhou X,Liu D,et al.Microrna-29 regulates high-glucose-induced apoptosis in human retinal pigment epithelial cells through pten[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,2016,52(4):419.

[14]Ouyang YB,Xu L,Lu Y,et al.Astrocyte-enriched mir-29a targets puma and reduces neuronal vulnerability to forebrain ischemia[J].Glia,2013,61(11):1784.

[15]Franceschetti T,Kessler CB,Lee SK,et al.Mir-29 promotes murine osteoclastogenesis by regulating osteoclast commitment and migration[J].J Biol Chem,2013,288(46):33347.

[16]Liu Z,Jiang J,Yang Q,et al.Microrna-682-mediated downregulation of pten in intestinal epithelial cells ameliorates intestinal ischemia-reperfusion injury[J].Cell Death Dis,2016,28(7):84.

[17]Bhatt K,Wei Q,Pabla N,et al.Microrna-687 induced by hypoxia-inducible factor-1 targets phosphatase and tensin homolog in renal ischemia-reperfusion injury[J].J Am Soc Nephrol,2015,26(7):1588.

Clinical significance of miR-29a and PTEN in renal ischemia reperfusion injury

LIDe-hui,MAOYi*.

(ThePeople’sHospitalofKaixianCounty,Kaixian405400,China)

Objective To investigate the clinical significance of miR-29a and PTEN in renal ischemia-reperfusion injury (RIRI) in SD rat.Methods 50 SD rats were fed to structure the RIRI model.The level of serum creatinine (Scr) and blood urea nitrogen (BUN) were detected by fully automatic biochemical analyser.The expression of miR-29a were detected by qRT-PCR and the expression of PTEN were detected by western blot.The correlation of miR-29a,PTEN and renal function were analyzed.Results In RIRI rats,the level of Scr,BUN,and PTEN were significantly increased,and the level of miR-29a were significantly decreased.The expression levels of miR-29a and PTEN,Scr,BUN appeared to be negative correlation in RIRI rats,in contrast,the PTEN and Scr,BUN appeared to be positive correlation in RIRI rats.Conclusion In RIRI rats,the expression of miR-29 and PTEN had significant associated with RIRI-induce renal function injury.MiR-29 and PTEN could be a potential target genes to treat the RIRI.

renal ischemia-reperfusion injury;miR-29a;PTEN;serum creatinine;blood urea nitrogen

1007-4287(2017)05-0806-04

R446.8

A

2016-11-24)