RNAi干擾Stat3基因誘導喉癌順鉑耐藥細胞凋亡及對Stat3信號轉導的影響

郭 慧,高 偉,秦 多，李曉明

(1.大連大學附屬新華醫院 耳鼻喉科，遼寧 大連116021；2.解放軍白求恩國際和平醫院 耳鼻咽喉頭頸外科全軍耳鼻咽喉頭頸外科中心)

*通訊作者

RNAi干擾Stat3基因誘導喉癌順鉑耐藥細胞凋亡及對Stat3信號轉導的影響

郭 慧1,高 偉1,秦 多1，李曉明2*

(1.大連大學附屬新華醫院 耳鼻喉科，遼寧 大連116021；2.解放軍白求恩國際和平醫院 耳鼻咽喉頭頸外科全軍耳鼻咽喉頭頸外科中心)

目的 利用RNA干擾Stat3基因，探討其對喉癌細胞系Hep-2細胞中對順鉑耐藥的細胞凋亡的影響。方法 常規體外培養人喉鱗狀細胞癌hep-2細胞株，重建質粒(pGPU6/GFP/Neo-sh Stat3 、 簡稱pG/G/N-sh Stat3)通過脂質體包裹轉染Hep-2細胞，實驗分為：Ⅰ 重建質粒(pG/G/N-sh Stat3)+順鉑(DDP)組；Ⅱ 單純重建質粒(pG/G/N-sh Stat3)組； Ⅲ 單純順鉑(DDP)組； Ⅳ 脂質體組； Ⅴ 陰性對照組。利用流式細胞技術檢測各試驗組轉染24 h、48 h及72 h后的細胞凋亡情況，及各試驗組轉染72h 后Stat3、p- Stat3及其靶目標基因產物Bcl-2蛋白表達水平。 結果 重建質粒(pG/G/N-sh Stat3)增強了順鉑對Hep-2細胞凋亡的促進作用；轉染72 h后，流式細胞儀檢測結果顯示重建質粒(pG/G/N-sh Stat3)+順鉑組的Stat3信號轉導通路蛋白Stat3、p- Stat3蛋白及其靶目標基因產物Bcl-2蛋白的表達受到明顯的抑制。結論 RNAi沉默STAT3基因通過抑制Stat3相關調控蛋白的表達，誘導喉癌順鉑耐藥細胞凋亡，增強人喉鱗狀細胞癌hep-2細胞株對化療的敏感性。

STAT3-siRNA；喉癌；RNA干擾；化療；凋亡

(ChinJLabDiagn,2017,21:0873)

目前，針對頭頸部鱗癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)生長快速、惡性度高、轉移侵襲力強的特點，臨床上常采用手術聯合放療和順鉑(DDP)、長春新堿(VCR) 類 、氟尿嘧啶(5-Fu) 等在內的化療的治療方式。伴隨著化療的推廣，腫瘤化療耐藥，即癌腫對化療藥物的敏感度減低成為困擾醫患的的又一難題，其中順鉑(DDP) 耐藥尤為顯著。

癌癥分子靶向治療的應用日益普遍，它主要針對確定的致癌位點和重要的信號傳導通路，設計相關藥物，從分子水平逆轉并切斷腫瘤細胞的惡性行為，使癌癥細胞特異性消失[1]。資料顯示，Stat3基因高表達于頭頸部鱗狀細胞癌中， Stat3基因影響了腫瘤的發生和成長，并且還參與了腫瘤遷移、侵襲、血管增生和免疫逃逸等相關現象，被定義為癌基因[2]。研究表明，Stat3的大劑量的持續激活與化療藥物耐藥性關系密切[3]。因此，我們以Stat3為靶目標，通過RNAi沉默Stat3基因誘發喉癌中順鉑耐藥細胞程序性死亡 ，并研究其對Stat3信號傳導通路相關調控蛋白的影響。

我們的前期工作已經發現，利用RNAi沉默Stat3基因可以提高放療療效，下調Stat3基因可以在體外引起喉癌順鉑耐藥細胞發生凋亡，從而提高惡性腫瘤細胞對各種化療藥物的敏感性[4]。

本實驗通過RNAi沉默Stat3基因表達，研究Stat3基因的靶向抑制與化療耐藥之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人鱗狀喉癌細胞株hep-2細胞株購于上海吉瑪公司，在完全RPMI medium 1640培養基中培養 (含鏈霉素100 μg/ml，10%小牛血清，青霉素100 u/ml)。MTT為invitrogen corporation公司產品。脂質體Lipofectamine 2000 由Sigma公司生產，質粒提取試劑盒購買于美國Promega公司，Stat3、p- Stat3、Bcl-xl鼠抗人單克隆抗體購買于Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法研究

1.2.1 重建質粒設計與構建 前期工作成功設計與合成并提純出重建質粒pGPU6/GFP/Neo-sh Stat3(pG/G/N-sh Stat3),DNA測序鑒定成功。

1.2.2 實驗分組與細胞轉染 常規培養Hep-2細胞， 生長于培養瓶，細胞融合至40%-60%時實驗分組：Ⅰ 重建質粒(pG/G/N-sh Stat3)+順鉑(DDP)組；Ⅱ 重建質粒(pG/G/N-sh Stat3)組； Ⅲ 單純順鉑(DDP)組； Ⅳ 脂質體組(Liposome)； Ⅴ 陰性對照組(Control)進行轉染。于熒光顯微鏡下觀察Hep-2細胞轉染率。

1.2.3 細胞凋亡檢測 利用脂質體轉染喉癌細胞后，細胞繼續培養16-24 h，然后依次將上述5組成功轉染的喉癌細胞制成單細胞混懸液， PBS處理，在70%冰乙醇中固定，37℃水浴1h， 4℃染色1 h，上流式細胞儀進行測定。

1.2.4 流式細胞儀檢測蛋白的表達

轉染24、48、72 h后，用胰酶消化各組實驗細胞，然后將細胞制成混懸液，無血清狀態下繼續培育細胞16-24 h， PBS處理，固定于4%多聚甲醛中，冰浴避光40 min，離心5 min， 倒掉上清； PBS清洗，離心，常溫固定； 然后用1 ml(5%血清+0.2% Trion-X 100)培養液重懸，繼續冰浴、 離心，依次加入Stat3、p- Stat3、 Bcl-xl鼠抗人單克隆抗體相對應的一抗； 冰浴10min后，離心、 清洗，加入二抗； 避光冰浴、清洗、離心后，重懸細胞流式細胞儀檢測。

1.3 統計學方法 全部數據采用SPSS 10.0統計軟件。計量資料數據比較使用方差分析、t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重建質粒(pG/G/N-sh Stat3)增加了順鉑對Hep-2細胞凋亡的促進作用 脂質體轉染喉癌細胞72 h后，pG/G/N-sh Stat3 +DDP組細胞凋亡率(33.71±1.96%)最高，與 pG/G/N-sh Stat3組、順鉑組、脂質體組、陰性對照組相比均有明顯的統計學差異(P<0.05)，Hep-2細胞經過重建質粒轉染及順鉑處理后隨著時間的增加細胞凋亡率呈上升趨勢， 48 h后上升延緩。重建質粒轉染及順鉑處理后喉癌細胞凋亡率和增值抑制率明顯增加。(見圖1,2)

2.2 重建質粒pG/G/N-sh Stat3與順鉑對Stat3信號傳導通路相關調控蛋白表達影響 喉癌Hep-2細胞被重建質粒pG/G/N-sh Stat3和順鉑聯合反應72 h后，Stat3、p- Stat3蛋白活性與表達下降，其靶目標基因產物Bcl-2蛋白表達下降。經兩樣本均數方差比較分析，pG/G/N-sh Stat3加順鉑組Stat3、p- Stat3、Bcl-2的蛋白表達熒光指數(1.331±0.221，1.253±0.185，1.236±0.209)大大低于另外四組，差異明顯，具有統計學意義(P<0.05)。經Pearson檢驗分析，治療各組之間p- Stat3與Bcl-2蛋白表達無明顯相關性(r=-0.074,P>0.05)。(見圖3～5，表1)

a:陰性對照組l;b:脂質體組;c:順鉑組;d:pG/G/N-sh Stat3;e:pG/G/N-sh Stat3+順鉑)

圖2 重建質粒轉染及順鉑處理后喉癌細胞凋亡率和增值抑制率及增值指數的比較

a:陰性對照組l;b:脂質體組;c:順鉑組;d:pG/G/N-sh Stat3;e:pG/G/N-sh Stat3+順鉑

2.3 pG/G/N-sh Stat3與順鉑對Stat3 mRNA的表達影響 轉染72 h后，pG/G/N-sh Stat3加順鉑組Stat3 mRNA表達明顯減弱，兩兩比較發現pG/G/N-sh Stat3加順鉑組Stat3 mRNA(Stat3/β-actin)光密度比值(0.243±0.904)顯著低于順鉑組、脂質體對照組及陰性對照組(P<0.05)，脂質體對照組和陰性對照組無明顯差異(P>0.05)。β-actin表達在各組之間無明顯差異(P>0.05)。(見圖6)

a:陰性對照組l;b:脂質體組;c:順鉑組;d:pG/G/N-sh Stat3;e:pG/G/N-sh Stat3+順鉑

a:陰性對照組l;b:脂質體組;c:順鉑組;d:pG/G/N-sh Stat3;e:pG/G/N-sh Stat3+順鉑

表1 重建質粒轉染及順鉑作用喉癌細胞72 h后Stat3,p- Stat3,Bcl-2Bcl-2蛋白的表達

＊和陰性對照組比較,＊P<0.05;△和順鉑組比較,△P<0.05

精準醫療時代，化療與其他治療手段聯合發揮著獨特的作用，其中以順鉑為根本的化療方案廣泛應用于各種惡性腫瘤的治療，其中包括喉鱗狀細胞癌。臨床上之所以采用聯合用藥，主要目的是為了減少只用一種藥物而引起的腫瘤耐藥作用，增強癌腫細胞對化療藥物的靈敏度，減低耐藥細胞復制，盡可能的殺傷腫瘤細胞。為了減少腫瘤耐藥，多使用化療增敏劑，化療增敏劑又叫耐藥逆轉劑，是指化療藥物與少許劑量的該化學物質聯合應用可以提高化療療效[5]。常用的化療增敏劑主要有基因制劑、多藥耐藥(Multidrug Resistance MDR)逆轉劑、中藥及其提取物、乏氧細胞殺傷劑、其他藥物。

a:陰性對照組l;b:脂質體組;c:順鉑組;d:pG/G/N-sh Stat3;e:pG/G/N-sh Stat3+順鉑

順鉑治療喉癌的主要機理是與喉鱗癌細胞的DNA分子組成鏈內、外交叉聯，和DNA蛋白質交聯，導致DNA分子受損，引起細胞程序性死亡[6]。

癌瘤細胞的DNA損傷修復系統，是導致以順鉑為代表的喉鱗癌化療耐藥的因素之一，主要原因是，順鉑與核蛋白連接后，形成了順鉑與DNA鏈內或鏈間的交聯、DNA-蛋白質之間的交聯受到損壞， 在促分裂原的幫助下DNA損傷信號激活p73、p53、蛋白激酶等多種信號傳導途徑，進一步激活凋亡信號，最終導致腫瘤細胞凋亡受到抑制。而跨膜受體酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine protein kinase,TPK)家族成員可通過JAK途徑或直接磷酸化Stat3蛋白，引起EGFR-STAT3信號轉導通路，假如可以抑制這一途徑，就可以抑制激活凋亡信號，阻止喉癌細胞凋亡受到抑制。本次實驗就是通過重建質粒(pG/G/N-sh Stat3)抑制Stat3信號傳導通路相關調控蛋白，從而抑制激活凋亡信號，防止喉癌細胞凋亡受到抑制。

此次實驗中，我們觀察到重建質粒(pG/G/N-sh Stat3)與順鉑同時作用于Hep-2細胞72 h后，應用流式細胞技術檢測到Stat3及p- Stat3蛋白活性與表達下降，同時靶目標基因產物Bcl-2表達明顯下調，而其余幾組中Stat3及p- Stat3、Bcl-2蛋白無明顯改變，說明重建質粒(pG/G/N-sh Stat3)可以起到順鉑化療增敏劑的作用，抑制Stat3的表達從而起到對順鉑化療增敏的作用。

腫瘤細胞凋亡機制相當復雜[7]，近期研究發現，癌細胞中Stat3的抗凋亡作用存在有兩條途徑，分別是Bcl-2依賴途徑、Bcl-2非依賴途徑。在人骨髓瘤細胞系U266中研究員曾經發現Bcl-2依賴的途徑，他們通過大量研究發現持續激活Stat3基因能夠誘發抗凋亡基因Bcl-2的高度活化，阻斷Stat3信號傳導亦可引起癌細胞中Bcl-xl的表達減弱，可以導致細胞大量程序性死亡。

從此次實驗中我們觀察到：轉染重建質粒(pG/G/N-sh Stat3)的細胞因為受到順鉑的影響，其細胞凋亡率比未被重建質粒轉染的細胞和單純順鉑作用的細胞的凋亡率明顯升高，說明質粒pG/G/N-sh Stat3可以通過阻止Bcl-2的表達，強化順鉑對Hep-2細胞凋亡的促進作用。而且，從Stat3 RT-PCR表達結果可以看出，同時進行質粒(pG/G/N-sh Stat3)轉染和化學治療細胞中的Stat3 mRNA表達量明顯下降，與單純重建質粒轉染組、單純順鉑治療組、陰性對照組有明顯差異，進一步證明RNAi干擾亦可以從RNA水平上強化順鉑對Stat3基因表達的限制作用。

經過實驗我們得出如下結論，質粒(pG/G/N-sh Stat3)可以增強化療對腫瘤細胞凋亡的誘導，并且還可以強化其對腫瘤細胞生長、 分裂的抑制作用，可以助力化療，起到化療增敏劑的效果。進一步驗證了阻斷Stat3信號傳導，能夠幫助化療阻滯喉癌細胞周期、限制細胞生長，增強其對Hep-2細胞凋亡的誘導，從而增強Hep-2細胞對順鉑的敏感性，可以通過不追加化療藥物劑量，而實現增加喉鱗癌細胞化療療效。

綜上，證實了RNAi干擾技術可以逆轉喉鱗癌化療耐藥，其有效性得到肯定，加深了研究者們對化療耐藥機制的了解，為我們在基因水平上改變腫瘤細胞的化療敏感性提供了線索，為尋找高效、低毒性的基因制劑方面的化療增敏劑指明了方向。

[1]Peralta-Zaragoza O,Bermudez-Morales VH,Perez-Plasen-cia C,et al.Targeted treatments for cervical cancer:a review [J].Onco Targets Ther,2012,5:315.

[2]Avalle,L,Pensa,S,Novelliu F,et al.STAT1 and STAT3 in tumorigenesis:a matter of balance[J].JAK-STAT,2012,1(2):65.

[3]Ji T,Gong D,Han Z,et al.Abrogation of constitutive Stat3 activity circumvents cisplatin resistant ovarian cancer[J].Cancer Lett,2013,341(2):231.

[4]王俊閣,李曉明,陳英會,等.信號轉導及轉錄活化因子3反義寡核苷酸聯合化療調控喉癌細胞增殖與凋亡的分子機制[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2007,42(3):222.

[5]Limtrakul P.Curcumin as chemosensitizer J[J].Adv Exp Med Biol,2007,595:269-300.

[6]薛惠榮，王麗萍，耿嘉男，等.siRNA沉默HIF-1α基因對人卵巢癌細胞SKOV3/DDP耐藥的影響[J].中國實驗診斷學，2013，8(17):1045.

[7]Brenner C,Galluzzi L,Kepp O,et al.Decoding cell death signals in liver inflammation[J].J Hepatol ,2013,59(3):583.

RNA interference Stat3 gene induced laryngeal carcinoma cisplatin resistant cell apoptosis of Stat3 signaling pathway

GUOHui,GAOWei,QINDuo,etal.

(DepartmentofOtolaryngolog，XinhuaHospital,Dalian116021,China)

Objective By using RNA interference STAT3 gene,discuss the effect of cell apoptosis for cisplatin resistance in the hep-2 cell (laryngeal squamous cell carcinoma cell) .Methods In vitro cultivation the hep-2 cell (laryngeal squamous cell carcinomacell) ,reconstruct plasmid (pGPU6/GFP/Neo-sh Stat3,hereinafter referred to as pG/G/N-sh Stat3) by liposome transfection package hep- 2 cells,the experiment is divided into:Ⅰ reconstruction plasmid (pG/G/N-sh Stat3) + cisplatin (DDP) group;Ⅱ pure reconstruction plasmid (pG/G/N-sh Stat3) group;Ⅲ pure cisplatin (DDP) group;Ⅳ liposome group;Ⅴ negative control group.By using Flow cytometry technology to detect apoptosis of cell of different experimental transfection 24 h,48 h and 72 h,and protein expression levels of Stat3,p-Stat3 and its target gene product the Bcl-xl of different experimental transfection after 72 h.Results Reconstruction plasmid (pG/G/N-sh Stat3) enhances the promoting role of cell apoptosis by DDP in Hep-2 cell,After transfection of 72 h,flow cytometry showed that the expression was significantly inhibited of the STAT3 signal transduction pathway related protein in the reconstruction plasmid (pG/G/N-sh Stat3) + cisplatin (DDP) group.Conclusion By inhibiting the expression of STAT3 related regulatory proteins,RNAi STAT3 gene silence apoptosis induction of laryngeal cancer cisplatin resistance,increase chemotherapy sensitivity of the hep-2 cell (laryngeal squamous cell carcinoma cell) .

STAT3-siRNA;Laryngeal cancer；RNA interference;Chemotherapy;apoptosis

1007-4287(2017)05-0873-05

R739.65

A

2016-09-12)