三維打印雙相磷酸鈣陶瓷支架在骨組織工程中的應用

李佳樂，夏軼超，澈力格爾，劉 敏，王梓霖， 韓 冰*

(1.吉林大學口腔醫院 口腔頜面外科，吉林 長春130021；2.吉林省牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室)

三維打印雙相磷酸鈣陶瓷支架在骨組織工程中的應用

李佳樂1，2，夏軼超1，澈力格爾1，劉 敏1，王梓霖1， 韓 冰1*

(1.吉林大學口腔醫院 口腔頜面外科，吉林 長春130021；2.吉林省牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室)

目的 探索研究三維打印技術制備的由羥基磷灰石/β-磷酸三鈣(HA/β-TCP)組成的雙相磷酸鈣陶瓷(BCP)支架在骨組織工程中的應用潛力，為其作為骨組織工程支架提供試驗基礎。方法 通過三維打印技術制備質量比為3∶7的HA/β-TCP復合納米支架，掃描電鏡(SEM)觀察支架形態。將支架與兔骨髓間充質干細胞共培養；通過CCK-8實驗檢測支架的生物相容性以及種子細胞在支架上的增殖分；并以相同材料制備的壓模片進行比較。結果 三維打印技術制備的雙相磷酸鈣陶瓷支架為三維均勻多孔隙結構，骨髓基質干細胞能夠在此支架上很好的增殖，分化。結論 三維打印制備雙相磷酸鈣陶瓷支架有較好的相容性，可促進細胞的分化，可作為細胞支架應用于骨組織工程中。

三維打印技術； 納米羥基磷灰石； β-磷酸三鈣 ；骨髓間充質干細胞； 骨組織工程

(ChinJLabDiagn,2017,21:0878)

因先天畸形、自然災害及交通事故所致外傷、腫瘤及感染等各種因素引起的骨缺損在臨床上十分常見。這些骨缺損不同程度地影響著患者缺損部位的形態與功能，常常給患者帶來極大的不便[1]。傳統的治療方法都有著各自的局限性。如自體骨移植于供骨區的二次損傷，來源有限；同種異體骨移植雖經過處理，但易引起免疫反應，易吸收易感染等；人工骨材料如金屬等在力學性能及生物學性能上與骨組織存在顯著的差異等[2,3]。由于現行骨缺損修復方法存在以上問題，骨組織工程修復骨缺損受到了越來越多的重視，已成為臨床醫學及生物學研究的重點。

組織工程包括支架，種子細胞，生長因子這三個關鍵因素。其中，骨支架的性能常常影響組織工程的成敗。理想的骨支架材料應具有良好的生物相容性，生物力學性，生物降解性。同時又應具有較高的可塑性，且易于加工，來源充足等優點[4,5]。

雙相磷酸鈣(Biphasic calcium phosphate,BCP)，由羥基磷灰石(HA)和β-磷酸三鈣(β-TCP)組成。其化學成分與骨組織的無機成分相似，目前已被廣泛應用于組織工程支架的研究中，對于骨缺損的修復和重建中有著重要的研究價值。

支架的制備方法大致分為相分離法，氣體發泡法，熔鹽法，微球法等傳統制備方法。然而，這些傳統方法都不能精確的控制其孔隙。三維打印技術是根據預先設計的模型，通過逐層沉積以完成整個支架的制備，可以精確地完成形狀以及孔隙的要求[6]。

本實驗使用雙相磷酸鈣陶瓷作為支架材料，利用三維打印技術，制備質量比為HA/β-TCP：30/70的準確控制孔隙大小結構的三維雙相磷酸鈣陶瓷支架，研究微觀支架結構，及骨髓間充質干細胞在支架上的增殖，探討其應用于骨組織工程的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 普通級健康新西蘭大白兔，2周齡，體重約300 g，雌雄不限，由吉林大學動物實驗中心提供。

1.1.2 試劑和材料 L-DMEM培養基(Hyclone，美國)；胎牛血清(Gibco，美國)；CCK-8(Sigma，美國)；HA、β-TCP、PVA(中科院上海市硅酸鹽研究所)。

1.1.3 主要儀器 三維打印機(弗勞恩霍夫研究所，德國)；CO2恒溫細胞培養箱(Sanyo，日本)；酶標儀(Bio-RAD，美國)；掃描電鏡(SEM,SHIMADZU SSX-550，日本)。

1.2 方法

1.2.1 支架的制備 制備的支架為圓柱狀，高3 mm，直徑3 mm。孔隙為正方形，孔徑為400 μm。在打印制備中，選擇納米 HA 和納米 β-TCP粉末為原材料，以質量比為30∶70 的比例混合。以聚乙烯醇(poly vinyl alcohol ，PVA)為粘結劑。將上述 10 g 混合粉末與 5.6 g PVA 水溶液(質量比為6%)均勻混合配成可注射型的膏狀物。噴射針頭的壓力控制在 200 到400KPa 之間，控制移動速度為 6 mm/s。根據預定模型數據控制噴射針頭在三維方向的定向移動分層打印，直至整個支架打印完成。初模型在室溫下干燥過夜，第二天在1 100℃燒結3 h，BCP 支架最終成型[7]。同期制備BCP壓模片材料作為對照。將上述混合好的粉末放置于模具中，用5 Mpa的壓縮強度制成與三維打印支架材料直徑及高度相同的圓柱形，同樣于1 100℃燒結3 h，制備成型。

1.2.2 SEM表面形態觀察 干燥后的支架表面噴金，對其表面進行掃描電子顯微鏡(SEM)觀察。

1.2.3 兔骨髓間充質干細胞(BMSC)的分離培養 兔處死脫毛處理后，置入75%的酒精中消毒，移至超凈臺內，無菌條件下解剖分離出雙下肢骨，剪去骨一端，用內含配置好的培養基的注射器抽取骨髓腔內骨髓。后將抽取的骨髓-培養液注射入培養瓶中。于37℃孵箱中靜置培養。靜置72 h后行第一次半換液。后常規培養傳代。傳至第三代時即為需要的骨髓間充質干細胞[8]。

1.2.4 CCK-8實驗檢測細胞增殖活性 將組織培養板表面(tissue culture plate surface,TCPS)作為空白組。即分為三組：實驗組，對照組，空白組。每組設置6個重復。支架及壓片經去離子水超聲振蕩清洗，烘干，高壓蒸汽滅菌后放入96孔培養板中，每孔放置 1 件材料。取上述細胞，制備細胞懸液，每孔(材料表面和孔板底)接種細胞數量為2×103個，常規培養。分別于1 d、3 d、5 d、7 d后終止培養。在超凈臺中每孔加入CCK-8溶液10 μL后孵育，37℃，2 h。每孔吸取孔內溶液，按照原來的順序加入到新的96孔板中，450 nm波長測量各組溶液吸光度值A。按照下述公式計算細胞增殖活性：Cell viability(%)= A sample / A control ×100(其中A control 代表對照組的吸光度值，A sample 代表實驗組的吸光度值。)

1.2.5 統計學分析 使用SPSS22.0統計軟件包對數據進行多因素方差分析及T檢驗。P<0.05被認為有統計學意義。

2 結果

2.1 支架的宏觀結構 如圖1，采用三維打印技術制備的支架呈圓柱型，支架孔隙大小均勻，孔隙互相連通(圖1A)；壓制模片(圖1B)質地均勻，表面光滑。

圖1 制備的雙相磷酸鈣陶瓷支架，1A所示為三維打印的三維多孔支架，1B為利用模具壓縮成型的模片

2.2 SEM觀察 支架表面結構的掃描電鏡見圖2。可以看出三維打印制備的支架孔隙控制的十分均勻，大小一致，孔隙之間相互連接。空隙大小在350-450 μm之間。空隙壁粗糙不平，有許多可達微米級別的微孔。

圖2 三維打印 BCP 支架的掃描電鏡，BCP 支架表面的微觀結構(2a,2b)，孔隙壁表面的微觀結構(2c，2d)

2.3 CCK-8實驗結果 BMSC與支架共培養1,3,5,7 d 后各組支架表面粘附細胞吸光度值結果見圖3。可見，各組的吸光度值隨培養時間逐漸增大，說明細胞數量隨時間增加穩定增長。結果表明，骨髓間充質干細胞在支架上可以穩定生長。在體外培養 1 d，3d，5 d，空白組的細胞數量明顯高于實驗組及對照組組(P<0.05)。在1 d時，可見對照組細胞數量高于實驗組(P<0.05)，而在第3 d，5 d 時，對照組與實驗組細胞數量無明顯差異(P>0.05)。培養7 d 后，對照組的細胞數量低于實驗組及空白組(P<0.05)。

3 討論

本實驗制備的BCP支架中的HA和β-TCP是目前使用較多的已被驗證性能較好的支架材料。β -TCP的成分與骨礦物組成相似，生物相容性好，被植入體內后逐漸降解，最終無異物殘留，這使得材降解后所形成的新骨不受影響；而且新骨強度優于新骨-材料結合的強度；但疲勞強度低，脆性大，力學性能一般，降解快[9]。HA的化學組成及晶體結構與人骨骼中的磷灰石相類似，形態穩定，力學性能良好，是公認的性能良好的骨修復材料，但其降解速率緩慢[10]。通過調控兩種材料的混合比例，使得材料的降解率變的可調控，可滿足組織工程的降解要求。

*P<0.05、**P< 0.01。

這也是我們將HA與β -TCP的比例定為3∶7的原因之一。一方面，HA的低降解率和較好的力學性能可以緩和因β -TCP的快速降解而降低的支架結構的穩定與強度，使得支架在降解，細胞的增殖分化，新骨在形成的過程中仍有支架的“框架支撐”。另一方面，β -TCP在BCP中優先于HA降解，產生較多的游離鈣、磷離子，“創造”其周圍的過飽和狀態，礦化物質地沉積從而引導新骨形成，并吸引周圍的骨形成蛋白(BMPs)，誘導間充質干細胞向成軟骨細胞或成骨細胞方向分化，促進成骨[11]。然而，過多的游離的鈣磷離子會引起炎癥反應，使創口延期愈合，從而影響新骨形成[12]。 所以我們最終將兩種材料的比例設置為3∶7。

對于細胞的生長來說，100-500 μm孔隙率對于非常有利于細胞長入[13],而據報道，如果孔徑大于300 μm，十分有利于血管化和骨再生[14]。在另一方面，如果孔徑較大，支架的力學性能將會大打折扣。最后，本實驗設計制備的孔隙大小定為400 μm。從SEM圖像可以很明顯的看出，通過三維打印技術制備的BCP支架有著350-450 μm大小的孔隙，且孔隙大小、分布均勻并互相連通，對細胞粘附增殖有良好促進作用[15]。此外，鏡下可觀察到支架表面有很多微孔(圖 2.c,d)，這些微孔增加了材料的表面積，也增加了細胞在材料的表面粘附和增殖的空間。

CCK-8結果表示，在細胞培養1天和3天之后，實驗的細胞增殖比空白和對照組低。且空白組較其他兩組一直表現出較高的細胞數量。這似乎與我們的預期相矛盾。這可能是制備的細胞懸液在滴入支架進行細胞接種時，有些細胞會通過支架的孔隙落入到孔板底部，未能成功種植于支架表面。這使得支架比其他兩組有更低的原始細胞的數量。在體外培養5天后，實驗組的細胞數量已與對照組相接近，7天后就表現為高于對照組。這說明，BCP支架顯示更優良的的生物相容性。此外，在四個檢測時間點，與其他兩組相比，空白組的細胞數量一直表現較高水平。這可能是培養孔板底經過處理有著親水性能較好的表面而能促進細胞的粘附，使得細胞更容易種植[16]。同時干細胞處于分化狀態時其增殖水平會減低甚至是停止，這也使得有支架材料的細胞數量較空白組表現“稍低水平”。培養后期，BCP支架與具有二維平面結構的模片和空白對照組相比有著更大的表面積。由于細胞在限定空間內增殖發生的接觸抑制，BCP支架表現出了更高的細胞增殖率，細胞數量也與孔板表現沒有明顯差距。

綜上所述，利用三維打印技術制備的多孔雙相磷酸鈣陶瓷骨支架具有良好的生物相容性，其互通完善、交通良好的均勻孔隙以方形的形式存在，表面粗糙的微孔形態也使得這種三維孔隙結構有利于細胞粘附、增殖。本實驗初步驗證了BCP支架在骨組織工程中應用潛力，為后續實驗及其臨床應用提供了基礎。

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The application of Biphasic calcium phosphates ceramic scaffold by 3D printing in bone tissue engineering

LIJia-le,XIAYi-chao,CHELigeer,etal.

(DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,SchoolandHospitalofStomatology,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To evaluated the biphasic calcium phosphates ceramic scaffold by 3D printing,which is consists of hydroxyapatite and β-tricalcium phosphate (HA/β-TCP),and provide the experimental basis used for bone tissue engineering.Methods 3D printing technology was applied to prepare porous BCP scaffolds，and BCP cylinder was were prepared by mold materials.The composition ratio of BCP (%HA/%β -TCP) was 30/70.Scaffold was observed by scanning electron microscopy (SEM) .Rabbit bone mesenchymal stem cells were seeded on the scaffolds and cultured together.Results Scaffold-BMSCs were investigated with regard to cellular,spreading and proliferation through analyses of CCK-8.Conclusion The BCP scaffold had a good biocompatibility and may be a promising material in bone tissue engineering.

3D printing technologies;Nano-hydroxyapatite;β-tricalcium phosphate;bone mesenchymal stem cells;bone tissue engineering

吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目(吉科教合字[2015]第525號)

*通訊作者

1007-4287(2017)05-0878-04

R783.1

A

2016-10-11)