鹿茸多肽對去卵巢大鼠骨質疏松預防作用的研究

龔 慶， 趙文海， 宋秋瑩，尹宏兵，冷向陽

(長春中醫藥大學附屬醫院 骨科，吉林 長春130021)

*通訊作者

鹿茸多肽對去卵巢大鼠骨質疏松預防作用的研究

龔 慶， 趙文海， 宋秋瑩，尹宏兵，冷向陽*

(長春中醫藥大學附屬醫院 骨科，吉林 長春130021)

骨質疏松癥是一類以骨量減少、骨組織微觀形態退化為特征的代謝性疾病，絕經后婦女為骨質疏松癥的高發人群。患骨質疏松癥后，骨組織強度降低，增高了骨折發生的風險，同時也會引起骨質疏松疼痛，以腰部疼痛尤為嚴重，極大地影響了患者的生活質量、消耗了醫療資源[1]。骨質疏松癥已成為全球性的公共健康問題。鹿茸是脊索動物門哺乳綱鹿科梅花鹿或者馬鹿雄鹿未骨化密生絨毛的幼角，鹿茸多肽是鹿茸中提取的主要活性成分，體外細胞實驗發現鹿茸多肽具有刺激成骨細胞增殖分化的作用[2,3]。本實驗將探究低、中、高劑量鹿茸多肽對于去卵巢大鼠血清骨代謝指標、股骨骨密度、股骨力學指標、股骨微觀形態的影響作用，探究鹿茸多肽對于去卵巢骨質疏松的預防作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

動物與藥品:Wistar大鼠48只，雌性，清潔級，體重量 180±10 g (由長春中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-(吉)2012-0005)；鹿茸多肽樣品(長春中醫藥大學)；阿侖膦酸鈉片，規格：6片/盒，10mg/粒(石藥集團歐意藥業有限公司)。

試劑:鈣(Ca2+)測試盒(碧云天生物技術有限公司，批號：20152824)；堿性磷酸酶(ALP)測試盒(碧云天生物技術有限公司，批號：20153463)。酸性磷酸酶(ACP)測試盒(碧云天生物技術有限公司，批號：20158235)；骨鈣素(OC)放射免疫分析藥盒(碧云天生物技術有限公司，批號：20157235)。

儀器:PUS-2018G半自動生化分析儀(普朗醫療科技公司)；BI-2000圖象分析系統，成都泰盟科技有限公司)；美國 HOLOGIC discovery WA 骨密度測定儀；CSS-44100生物力學測試儀(長春試驗機研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 取雌性Wistar大鼠48只，應用3%水合氯醛腹腔注射麻醉，常規消毒鋪單，其中40只摘除雙側卵巢，其余8只在相同位置做切口而不摘除卵巢作為假手術組。術后腹腔注射青霉素鈉10萬單位/只，連續3天給予10萬單位/只。術后15天，將摘除卵巢大鼠隨機分為模型組、阿侖膦酸鈉(陽性藥)組、鹿茸多肽低、中、高劑量組，每組8只。

1.2.2 藥物劑量設計 陽性對照藥阿侖膦酸鈉臨床用量10 mg/人/日，即0.14 mg/kg(人均體重按70 kg計)，折算成大鼠的等效劑量為24 mg/kg，作為該試驗陽性對照藥阿侖膦酸鈉的劑量行灌胃給藥。鹿茸中國藥典生藥推薦量為2 g/d，生藥中鹿茸提取率為0.9%，換算成大鼠的鹿茸多肽每日等效劑量為45 mg/kg。設鹿茸多肽低、中、高劑量分別為90 mg/kg,45 mg/kg，22.5 mg/kg。模型組、假手術組給予等容量的蒸餾水。以上各組進行每日灌胃，連續灌胃3個月。

1.2.3 標本采樣 末次給藥后8 h開始禁食(自由飲水)，末次給藥后24 h，用6%水合氯醛麻醉(0.5 ml/100 g)后由腹主動脈取血，3 000 轉/min離心5 min，取血清。處置后取左、右兩側股骨。

1.2.4 指標檢測 血清生化指標檢測：應用PUS-2018G半自動生化分析儀測血清中Ca2+、ACP、ALP、OC含量。股骨BMD測定：所有組別均進行股骨骨密度測定。具體步驟為：取左側股骨，按美國 HOLOGIC discovery WA 骨密度測定儀的說明書的操作步驟，將股骨放在骨密度測定儀的投影區，進行掃描，獲取骨密度數據。股骨生物力學檢測：取左側股骨，使用CSS-44100生物力學測試儀在跨距20 mm、速度5 mm/s的條件下測量其最大彎曲力、斷裂撓度的生物力學指標。骨結構光鏡觀察：取右側股骨用10%甲醛固定，脫鈣，常規石蠟包埋，切片，常規HE染色，采用BI-2000圖象分析系統拍取骨皮質，骨小梁靜態圖像，并測量圖像中骨皮質平均厚度和骨小梁面積。

1.3 數據處理

2 結果

2.1 血清生化指標結果

如表1所示，與模型組相比，鹿茸多肽各劑量組均對血清鈣離子水平有升高作用，且高劑量鹿茸多肽升高血清Ca2+[(2.572±0.183)mmol/L]的效果優于中[(2.535±0.220)mmol/L]、低劑量組[(2.524±0.289)mmol/L]，同時也優于陽性對照組[(2.497±0.251)mmol/L]；低、中、高劑量鹿茸多肽均可以降低血清ALP、ACP和OC，陽性對照組(P<0.05)。

2.2 股骨BMD、骨力學測量結果

如表2所示，鹿茸多肽高[(0.221±0.012)g/cm3]、中[0.228±0.015)g/cm3]、低[(0.221±0.012)g/cm3]劑量組相比模型組[(0.212±0.018)g/cm3]均可以明顯增高股骨BMD值(P<0.05)，而鹿茸多肽各劑量組間比較則未見顯著差異(P>0.05)。在力學測試中發現，鹿茸多肽各劑量組均可以增加股骨力學性能,而高劑量鹿茸多肽對于增加最大彎曲力[110.11±9.341)N]和斷裂撓度[3.511±0.521)mm]作用最強，且鹿茸多肽對股骨斷裂撓度增加量甚至高于假手術組和陽性對照組。

表1 鹿茸多肽對骨質疏松大鼠(去卵巢模型)血清生化指標的影響±s，n=8)

注：與假手術組比較：△P<0.05、△△P<0.01、△△△P<0.001；與模型組比較：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。

表2 鹿茸多肽對骨質疏松大鼠(去卵巢模型)骨密度、骨力學、骨皮質厚度、骨小梁面積的影響±s，n=8)

注：與假手術組比較：△P<0.05、△△P<0.01、△△△P<0.001；與模型組比較：*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。

2.3 股骨骨微觀形態觀察測量

股骨微觀結構如圖1和圖2所示，通過對微觀結構下股骨骨皮質厚度和骨小梁面積進行觀察測量發現，與模型組相比， 陽性對照組增加股骨皮質厚度[(249.7±24.55對183.3±37.70) μm，P<0.01)]和骨小梁面積[(65624.3±15042.9對28424.4±9034.8) μm3，P<0.01)]具有顯著作用，鹿茸多肽各劑量組效果雖然不如陽性對照組，但仍可以顯著改善股骨骨皮質厚度增厚和骨小梁面積(P<0.05)。

3 討論

骨質疏松癥是一類代謝性骨病，其病理特征為骨量減少、骨皮質變薄及骨小梁數量減少。患骨質疏松癥后，骨組織力學強度嚴重下降，極大地增加了骨折的風險。同時，骨質疏松癥也會導致以腰背疼痛為主骨質疏松疼痛，嚴重影響患者的生存質量。絕經后女性由于雌激素缺乏，是骨質疏松癥的高發人群。

鹿茸為鹿科動物梅花鹿或馬鹿雄鹿未骨化密生絨毛的幼角，《本草綱目》中記載鹿茸具有“善于補腎壯陽，生精益血，補髓健骨”的功效。鹿茸多肽為鹿茸中主要的活性物質，近年來關于鹿茸多肽的多種藥理活性已經有了證實，如促進傷口皮膚愈合、提高機體免疫力、促進神經損傷再生、保護心肌細胞、修復軟骨損傷等[4-7]。呂秀華等在體外實驗中驗證了鹿茸多肽可以促進M3T3-E1細胞增殖和成骨方向表達[8]；趙長偉等通過臨床觀察發現骨質疏松患者服用鹿茸多肽后骨質疏松臨床癥狀發生明顯好轉[9]。本研究在構建大鼠去卵巢骨質疏松模型后，利用動物實驗分析鹿茸多肽對于骨質疏松治療情況，并將治療組分為3種劑量，評價鹿茸多肽對于骨質疏松癥的最佳治療劑量。

注：放大倍數：400×；A為模型組；B為陽性對照組；C為假手術組；D為鹿茸多肽低劑量組；E為鹿茸多肽中劑量組；F為鹿茸多肽高劑量組。

注：放大倍數：400×；A為模型組；B為陽性對照組；C為假手術組；D為鹿茸多肽低劑量組；E為鹿茸多肽中劑量組；F為鹿茸多肽高劑量組。

血清Ca2+、ALP、ACP和OC是機體骨轉換代謝的典型標志物，通過其數值的變化可以判斷機體骨代謝水平[10]。研究發現，給予鹿茸多肽后，血清鈣水平明顯升高，提示鹿茸多肽利于機體對鈣離子吸收。而血清堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和骨鈣素在給藥后均有下降的作用，說明鹿茸多肽有著抑制破骨細胞活性、減少骨吸收破壞的作用。

股骨BMD、骨力學強度是評價骨質疏松嚴重程度的最重要指標，BMD、骨力學強度的改善使得骨質疏松患者骨折風險大大減小，明確提升了患者生活生存質量。鹿茸多肽顯著促進骨組織生長，利于骨沉積作用，增加了骨密度和骨力學性能。觀察骨微觀形態可以最直觀的評價骨質疏松情況，骨質疏松的重要病理特征為骨量的減少，通過顯微鏡下觀察測量股骨皮質厚度和骨小梁面積而判斷骨量情況。鹿茸多肽可以增加骨皮質厚度和骨小梁面積，說明其有著良好的改善骨質，預防骨質疏松的作用。

本實驗結果表明,鹿茸多肽對去卵巢大鼠骨質疏松癥模型有顯著的預防作用， 研究中所檢測的各項指標與臨床骨質疏松患者情況平行，可考慮將實驗成果進行臨床轉化。在我們的研究中尚未涉及鹿茸多肽對于骨質疏松癥預防作用的機制研究，后續研究中我們將進行相關的實驗。

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1007-4287(2017)05-0890-04

2016-08-27)