急性應激大鼠的海馬DG區興奮性氨基酸在空間學習記憶中的變化

金美玉，吳建龍，金清華，李英順*

(1.吉林大學校醫院 內科,吉林 長春130012；2.延邊大學醫學院 生理學與病理生理學教研室，吉林 延吉133002；3.北京華圖宏陽教育問卷發展股份有限公司 吉林分公司，吉林 長春130061)

急性應激大鼠的海馬DG區興奮性氨基酸在空間學習記憶中的變化

金美玉1，吳建龍2,3，金清華2，李英順2*

(1.吉林大學校醫院 內科,吉林 長春130012；2.延邊大學醫學院 生理學與病理生理學教研室，吉林 延吉133002；3.北京華圖宏陽教育問卷發展股份有限公司 吉林分公司，吉林 長春130061)

目的 觀察海馬齒狀回(DG)區兩種興奮性氨基酸在急性應激模型大鼠空間學習記憶中的變化，初步探討應激影響空間學習記憶的部分神經化學機制。方法 本實驗采用束縛大鼠2 h的方法制備急性應激模型，觀察大鼠空間學習記憶能力和海馬DG區的谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)的含量變化，分別利用Morris水迷宮和腦部微量透析法和高效液相色譜法。 結果 1)在Morris水迷宮的定位航行實驗中，急性應激組的平均逃避潛伏期明顯長于對照組(P<0.05)；而在空間探索實驗中，穿越原站臺區次數兩組間無顯著性差異(P>0.05)。2)在MWM訓練第二天，海馬DG區Asp含量在對照組有增加趨勢，而在急性應激組有下降趨勢，兩組間比較有統計學意義(P<0.05)；兩組大鼠海馬DG區Glu的含量均未出現明顯的變化。結論 急性應激降低大鼠的空間學習能力，這可能與海馬DG區Asp的降低相關。

急性應激；海馬齒狀回；空間學習和記憶；興奮性氨基酸

(ChinJLabDiagn,2017,21:0893)

應激反應是指機體受到諸如寒冷、疼痛、饑餓、創傷、緊張、焦慮等一些有害刺激時伴隨著腎上腺皮質激素等多種激素升高的一系列非特異性適應性反應，可提高機體對傷害性刺激的耐受力[1]。有研究表明，與適度應激刺激可提高學習記憶能力相比,過強的急性應激或長期的慢性應激刺激反而會使人和動物的學習記憶能力受到明顯的損害[2]。海馬和前額葉是腦區中與學習記憶功能有密切相關的重要結構,也是應激易受累部位[3]。其中，海馬既受應激刺激的影響又參與應激的調節[4-6]。血中糖皮質激素濃度升高作為不良應激危害發生的主要原因之一，常常以海馬為其攻擊的主要靶區[7,8]。有報道說，當急性應激或長期外源性應激激素(主要為糖皮質激素)處理后,發現海馬依賴的學習記憶能力明顯損傷，提示應激引起突觸體結構和樹突形態的改變、神經發生抑制等可能性[9,10]。在動物海馬的CA1、CA3和齒狀回(dentate gyrus,DG)三個功能亞區中，DG區是成熟動物神經發生的唯一被公認部位，而動物記憶能力受損的強度與海馬區細胞數目不同程度的損傷有直接關系[4]。雖然這些研究表明，海馬的功能易受應激的影響，但有關應激對海馬區學習記憶的作用機制，尤其是涉及神經遞質的神經化學機制研究較少。谷氨酸(glutamate,Glu)和天冬氨酸(asparate,Asp)是較為公認的興奮性氨基酸遞質，它們的分布和作用相互重疊，其中Glu是海馬信息傳遞的主要承擔者，而且我們先前的研究發現海馬DG區的Asp和Glu可能參與主動回避學習的信息傳遞過程[11]。因此，本實驗以海馬DG區為主要研究靶區，觀察Asp和Glu在學習記憶過程中的含量變化，為急性應激對大鼠空間學習記憶影響的神經化學機制的探討提供部分依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

選用體重為300±20 g的 Wistar系雄性大鼠，(由延邊大學動物實驗中心提供)，隨機分為急性應激組和對照組，每組6只，專用實驗室內分籠飼養，室溫22-24℃，自由攝食和飲水。

1.2 微量透析探針的插入和急性應激模型的制備

大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉并固定在腦立體定位儀上。碘伏消毒，剪開頭皮，暴露前后囟，參照Paxinos和watson圖譜，將透析探針用的外套管固定在一側海馬DG區高于1.5 mm的部位(坐標為：AP 3.2 mm；L/R 1.6 mm；H 2.5 mm)，并用牙科水泥固定于顱骨上。術后第二天，在動物清醒狀態下經外套管插入自制微量透析探針用蠟固定好，后者超出外套管1.5 mm，尖端為乙酸纖維素半透膜(直徑0.2 mm，濾過物質分子量小于50000的物質)。術后第三天制備急性應激模型，其具體步驟如下：大鼠用乙醚麻醉，放入束縛器中，隨后將四肢固定在束縛器上，待大鼠清醒后進行2 h的急性束縛應激，對照組除了不進行束縛，其他過程均與急性應激組相同。模型制備完成后馬上進行下一步的微量透析和行為學實驗。

1.3 Morris水迷宮檢測

Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)系統中測試用圓形水池直徑120 cm、高60 cm，水池中水面高約45 cm，圓形有機玻璃平臺任意放置于某一象限的中心位置，其直徑10 cm、高40 cm，淹沒于水面下約2 cm處。室溫及水溫均保持在22±2℃。由距水面上方1.5米處連接于路徑追蹤系統的攝像機跟蹤拍攝和采集大鼠游泳圖像，通過電腦進行分析。在連續4天的MWM定位航行實驗中，記錄大鼠自入水到找到站臺后四肢爬上站臺所需時間即逃避潛伏期作為大鼠學習能力的檢測指標。在MWM實驗第5天，去除站臺，進行空間探索實驗。記錄大鼠穿越原站臺區次數作為大鼠記憶能力的檢測指標，即每只大鼠從同一位點入水后120 s內游經原站臺區的次數。

1.4 海馬DG區的微量透析和兩種氨基酸濃度的測定

透析探針連接微量泵灌流Ringer’s液(147 mM NaCl，4 mM KCl，2.3 mM CaCl2，pH 6.5)，灌流速度為1.5 μl/min，灌流30分鐘后開始收集樣本，每個樣本收集10分鐘，每次收集三個樣本，取平均值。將12 μl的樣本與3 μl的4 mM OPA溶液混合，常溫下反應2.5 min后抽取10 μl的反應液，利用手動進樣器注入到生物活性物質微量分析系統(HTEC-300，Eicom，Japan)，經高效液相色譜分離柱和電化學檢測器測定各個樣本中的Glu和Asp的濃度。

1.5 組織學鑒定

實驗結束后，將動物斷頭取腦，用10%福爾馬林溶液固定腦組織三天后進行冰凍切片、中性紅染色，鑒定微量透析探針到達部位，數據統計只采用探針進到海馬DG區者。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 急性應激模型大鼠的空間學習記憶能力的變化

兩組大鼠在為期4天的MWM定位航行訓練中，其逃避潛伏期均有不同程度的縮短的趨勢，提示空間學習的形成過程，但急性應激組在第二天的潛伏期明顯長于同一天的對照組(P<0.05，見圖1)。急性應激組的平均潛伏期為64.37±8.59s，與對照組(37.73±4.78s)相比明顯延長(P< 0.05)。見圖1B)。訓練第5d移除平臺，進行空間探索實驗，結果顯示，120s內穿越原平臺區次數雖然在急性應激組有下降的趨勢，但兩組間無統計學差異(P>0.05，圖2)。

2.2 急性應激對海馬DG區Asp和Glu濃度的影響

*P<0.05,與對照組相比

圖2 急性應激對MWM空間探索實驗中的穿越原站臺區次數的影響

與對照組大鼠相比，急性應激組大鼠海馬DG區細胞外液中的Asp和Glu基礎水平均有下降的趨勢，但兩組間無顯著性差異(均為P>0.05，圖3)。在5d的MWM訓練過程中，訓練第二天的大鼠海馬DG區細胞外液中的Asp含量，在對照組有增加趨勢，而在急性應激組有下降趨勢(但無統計學意義，均為P>0.05)，兩組間有顯著性差異(P<0.05，見圖4)。兩組大鼠海馬DG區細胞外液中的Glu含量在5d的MWM訓練過程中均未出現明顯的變化(均為P>0.05，圖5)。

圖3 急性應激對海馬DG區Asp和Glu基礎濃度的影響

*P<0.05,與對照組相比

圖5 急性應激對MWM訓練過程中的海馬DG區Glu濃度的影響

3 討論

當今世界中人們為了適應節奏逐漸加快的競爭和發展，常常需要承受來自社會不同方面的種種壓力，而這些壓力經常使人們處于不同程度的應激狀態，可見，應激是一種廣泛存在于人類生活中的事件。應激作為機體對體內、外有害刺激所做出的非特異性防御反應，對維持機體生命活動具有極其重要的意義，另一方面，它也可能產生負面影響成為許多疾病的重要誘因。應激可以按刺激持續時間的長短分為急性和慢性應激，其中急性應激的應激原一般指的是持續時間較短的突發的、不重復的事件。為了探討急性應激影響海馬學習記憶功能的部分神經化學機制，本實驗采用急性束縛2h的方法制備了大鼠急性應激模型，并用MWM系統觀察了急性應激對大鼠空間學習記憶的影響，結果顯示，急性應激可以部分損害大鼠的空間學習能力。

如前所述，海馬作為空間學習和記憶形成的關鍵部位，在腦區中最容易受急性應激或應激激素的影響[3,7,8]。在中樞神經系統中，Glu和Asp作為典型的興奮性氨基酸類遞質均作用于促離子型谷氨酸能受體，其作用相互交叉[12]。研究表明，興奮性氨基酸及其NMDA受體在海馬內信息傳遞過程中承擔著重要角色[13]，且本實驗室先前的研究也提示海馬DG區的Asp和Glu可能參與主動回避學習過程[11]。因此，本實驗以海馬DG區Glu和Asp為研究靶點，利用腦部微量透析法和高效液相色譜法測定上述兩種物質在空間學習記憶過程中發生的含量變化，探討急性應激損害空間學習能力的部分神經化學機制。本實驗結果顯示，在急性應激延長大鼠逃避潛伏期的MWM訓練第二天，海馬DG區Asp含量明顯低于對照組，提示急性束縛應激引起的大鼠空間學習能力下降，可能與學習過程中海馬DG區Asp水平減少有關。

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Changes of excitatory amino acids in hippocampal dentate gyrus during spatial learning and memory in a rat model of acute stress

JINMei-yu，WUJian-long,JINQing-hua,etal.

(DepartmentofInternalMedicine,JinlinUniversityHospital,Changchun130012，China)

Objective To observe the changes of asparete (asp) and glutamate (Glu) levels in the hippocampal dentate gyrus (DG) in a rat model of acute stress (AS) during Morris water maze (MWM) test,and to investigate neurochemical mechanism responsible for spatial learning and memory abnormity induced by acute stress.Methods AS model was prepared by 2 h restraint,and then the spatial learning and memory of rats were measured by Morris water maze (MWM) test,and the extracellular concentration of Asp and Glu in the DG were simultaneously determined by in vivo microdialysis and HPLC.Results 1) Compared with the control group,the mean escape latency was significantly increased in AS group (P<0.05).2) In AS group,the extracelluar concentration of Asp in the DG was significantly lower than that in control group on the 2nd day of MWM test (P<0.05); and Glu levels in the DG were not changed during MWM test in each group.Conclusion The lesion of spatial learning in AS model rats may be associated with the decrease of Asp in the hippicampal DG region.

acute stress; hippocampal dentate gyrus; spatial learning and memory; excitatory amino acids

吉林省衛生廳衛生計生科研計劃項目(2015z053)；延邊大學自然科學基金(602013110)

*通訊作者

1007-4287(2017)05-0893-04

R338

A

金美玉(1968-)，女，碩士，副主任醫師,研究方向為神經內科學;李英順(1968-)，女，碩士，副教授，研究方向為神經生理學。

2016-11-25)