以腦源性神經營養因子等干預視神經損傷大鼠視神經應力松弛特性分析

王 玲,李 鵬,姜 琦

(1.吉林大學中日聯誼醫院 眼科，吉林 長春130033;2.吉林大學南嶺校區 工程力學系，吉林 長春130022;3.吉林大學中日聯誼醫院 腎病科，吉林 長春130033)

以腦源性神經營養因子等干預視神經損傷大鼠視神經應力松弛特性分析

王 玲1,李 鵬2,姜 琦3*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 眼科，吉林 長春130033;2.吉林大學南嶺校區 工程力學系，吉林 長春130022;3.吉林大學中日聯誼醫院 腎病科，吉林 長春130033)

視神經損傷是以藥物治療、手術治療，還是以糖皮質激素治療，仍存在著較大的爭議[1]。近期視神經損傷以干細胞移植治療已在動物實驗中取得了一定的進展[2]。干細胞移植治療視神經損傷很可能成為一條嶄新的途徑[1]。關于以人臍血干細胞hUCBSC(human umbilical cord blood stem cells)干預治療視神經損傷，周丹[3]以人臍血干細胞干預治療大鼠外傷性視神經部分損傷進行了研究，得出了聯合使用人臍血干細胞和神經營養因子可以促進神經傳導功能恢復的作用，神經營養因子、人臍血干細胞、神經營養因子聯合人臍血干細胞對大鼠外傷性視神經部分損傷后視神經傳導功能的恢復具有促進作用的結論。Zhao和Gluckman等[4,5]的研究結果表明，通過向動物眼玻璃體腔注射hUCBSC 可以在一定程度上起到修復TON,減緩RGC 進行性死亡，減少視功能喪失的作用。李云琴等[1]觀察了以人臍血干細胞hUCBSC干預視神經損傷動物模型后的效果， 研究發現，以人臍血干細胞移植后，對SD 大鼠部分受損的視網膜神經節細胞( retinal ganglion cells，RGC) 具有保護的作用，得出了向視神經損傷大鼠玻璃體腔注射hUCBSC 可減緩視網膜中RGC 的凋亡，對RGC 具有一定的保護作用的結論。

關于人腦源性神經營養因子干預治療視神經損傷動物模型，劉勇等[6]對-綠色熒光蛋白(GFP)基因神經干細胞、轉染人腦源性神經營養因子(brain—derived neurotrophic factor，hBDNF)干預視神經損傷大鼠hBDNF、 GFP在視網膜內的存活、遷移和分化情況和對視神經損傷后視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells，RGCs)存活的影響進行了研究，得出了移植后的hBDNF—GFP—NSCs可少數可分化為視網膜神經節樣細胞；還可以分化為神經元和神經膠質細胞，移植hBDNF—GFP—NSCs可以增加RGCs的存活數17的結論。關于視神經動物模型以藥物治療后的生物力學實驗研究，Jiang等[7]復制家兔視神經損傷模型，分別以重組人睫狀神經營養因子、以中藥復光顆粒、重組人睫狀神經營養因子聯合中藥復光顆粒進行干預治療后取各組視神經進行拉伸實驗，結果表明，中藥復光顆粒、重組人睫狀神經營養因子、中藥復光顆粒聯合重組人睫狀神經營養因子干預組拉伸力學性能指標均大于視神經損傷模型組，差異顯著(P<0.05).得出了視神經損傷模型以重組人睫狀神經營養因子、中藥復光顆粒、中藥復光顆粒聯合重組人睫狀神經營養因子干預治療后，動物視神經的拉伸力學性能指標均有一定的恢復的結論。對視神經損傷動物模型以腦源性神經營養因子、人臍血干細胞干預治療后視神經的應力松弛分析鮮有報道，鑒于視神經損傷治療的需要，本實驗分別以腦源性神經營養因子和人臍血干細胞干預治療視神經損傷動物模型后進行應力松弛實驗，以應力松弛特性指標研判人臍血干細胞、腦源性神經營養因子干預治療視神經損傷大鼠的療效，旨在為臨床治療視神經損傷提供應力松弛力學特性參數。

1 材料與方法

實驗大鼠：6月齡雄性SD大鼠60只,體質量320-330 g，購于吉林大學實驗動物部。實驗前通過腹腔注射10%水合氯醛(35 mg/kg麻醉大鼠，檢查大鼠外眼及眼底有無病變，對無病變大鼠納入實驗。動物飼養室溫度22-25℃，自然光照，每天光照12小時，室內空氣流通，相對濕度58-71%，大鼠在籠中自由攝食飲水。60只大鼠隨機分為視神經損傷以BDNF干預組20只，視神經損傷模型組20只、視神經損傷模型以人hUCBSC干預組20只，在各組大鼠中隨機取20只大鼠正常眼(右眼)為正常對照組。

藥物：腦源性神經營養因子(BDNF)，上海酶聯生物科技有限公司(上海，中國)人臍血干細胞(hUCBSC)，深圳北科生物公司生產(深圳，廣東省，中國)。

大鼠視神經損傷模型的復制：按參考文獻[7]的方法復制大鼠視神經損傷模型，將大鼠俯臥位固定于手術臺上,向大鼠腹腔內注射0.1%的烏拉坦(5 mg/kg)水合氯醛麻醉大鼠,之后將大鼠左眼頂側眶上皮膚切開，露出頂側眶、眶壁和眶上緣切跡頂側眶,切除眶上緣切跡兩側部分眶壁骨板(寬5 mm，深7-8 mm),將后部眼球筋膜剪開,沿上直肌向球后鈍性分離,暴露眼球后視神經。在離后極部約3 mm，游離視神經約5 mm,用相當于98 g恒定壓力的反向血管夾(型號：W40160，規格：3.7 cm；上海醫療器械廠(上海，中國) 鉗夾同一部位的視神經5 s。術野用慶大霉素液沖洗5次后，以,青島耐克醫材有限公司(青島，山東省，中國)生產的10-0號尼龍線分層縫合。造模后立即觀察,對光反射消失,傷眼瞳孔散大，視網膜血管無出血或梗塞大鼠作為造模成功的動物納入實驗。

藥物干預：對視神經損傷大鼠以人臍血干細胞(hUCBSC)干預組大鼠于造模7天后，用注射器向大鼠玻璃體內一次性注射hUCBSC106個[7]。對視神經損傷模型以腦源性神經營養因子(BDNF)干預組大鼠于造模7天后[7]，用注射器向大鼠玻璃體內一次性注射BDNF50 ng。

各組大鼠視覺電生理檢測：各組大鼠于造模后即刻和造模30d后以REFZ-POZE21sompace型視覺電生理儀(德國、慕尼黑)檢測各組大鼠的閃光視覺誘發電位(F-VEP)指標，參考電極置于額部正中，記錄電極放于枕骨結節上1.5-2.0 cm處，將參考皮膚電極放置在眼眶顳側，將接地電極放置在耳垂；將角膜接觸鏡電極放好，電極放好后開始刺激，閃光照度2 擋，60lx，頻率2Hz，分析時間250 ms。

各組大鼠視覺電生理檢測完成后，以耳緣靜脈注氣法處死各組大鼠，使視神經暴露，在蘇州六六科技股份有限公司(蘇州，江蘇省，中國)生產的YZ6F直接檢眼鏡下以手術刀切取大鼠眶內段同一部位視神經，放在裝有生理鹽水的容器內，存放于4℃冰箱內。

大鼠視神經試樣應力松弛實驗： 以CCs-3型讀數顯微鏡(長春市第三光學儀器廠)測量視神經試樣的幾何尺寸，試樣長度為10 ±0.1 mm，視神經損傷模型以hUCBSC干預組試樣直徑0.79-0.82 mm、正常對照組試樣直徑0.78-0.82 mm，視神經損傷模型組試樣直徑0.76-0.81 mm、 視神經損傷模型以BDNF干預組試樣直徑00.780-81 mm mm。按參考文獻[8]的方法分別對每個試樣進行預調處理后待用。應力松弛實驗溫度設定為36.5±1.0℃，將試樣裝夾在MODEL55100型電子萬能試驗機(長春試驗機研究所生產)的夾具內，以60%/min的速度對試樣進行應力松弛實驗，當各組大鼠視神經試樣應力為0.386 Mpa，視神經損傷模型組試樣應變為2.86%、正常對照組試樣應變為3.14%、視神經損傷模型以BDNF干預組試樣應變為2.94%、視神經損傷模型以hUCBSC干預組試樣應變為3.06%時保持應變恒定，應力松弛實驗時間為7 200 s。達到7 200 s時，計算機自動輸出應力松弛實驗結果。實驗中不斷的向試樣淋生理鹽水，以使試樣保持濕度。

統計學分析方法：以美國SPSS16.0 軟件包(SPSS,Chicago,IL,USA)對視神經試樣應力松弛實驗數據進行分析，計量資料以mean±SD表示，采用Sceffe法和單因素方差分析法比較組間數據差異，P<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 各組大鼠閃光視覺誘發電位(F-VEP)檢測結果

各組大鼠視神經閃光視覺誘發電位(F-VEP)檢測結果見表1。

表1 各組大鼠視神經閃光視覺誘發電位(F-VEP)檢測結果(n=20)

注:造模30天后各組比較：與模型組比較aP<0.05,與hUCBSC干預組比較，bP<0.05。

F- VEP 記錄 圖形分析標準: P1 波幅值為自N1 波谷底至P1 波峰頂,潛伏期為自觸發時至P1峰為止。

2.2 以計算機擬合的視神經試樣應力松弛實驗曲線

以計算機擬合的視神經試樣應力松弛實驗曲線見圖1.

圖1 以計算機擬合的大鼠視神經應力松弛實驗曲線

視神經應力松弛實驗結果顯示，BDNF干預組hUCBSC干預組大鼠視神經的7 200 s應力下降量大于模型組大鼠視神經的7 200 s應力下降量(P<0.05)，以hUCBSC干預組大鼠視神經的7 200 s應力下降量大于以BDNF干預組鼠視神經的7 200 s應力下降量(P<0.05)，各組大鼠視神經試樣的應力松弛曲線的函數表達關系均是以對數關系變化的。

3 討論

通過電生理檢測判斷視神經損傷恢復效果是一種重要的檢測方法。各組大鼠視神經電生理檢測結果表明，模型組大鼠視神經峰值電壓小于視神經損傷動物模型以BDNF干預治療組和以hUCBSC干預治療組(P<0.05)，模型組大鼠峰潛時值大于視神經損傷動物模型以BDNF干預治療組和以hUCBSC干預治療組(P<0.05)，視神經損傷動物模型以BDNF干預治療組Pl峰值電壓小于視神經損傷動物模型以hUCBSC干預治療組(P<0.05)。

各組大鼠視神經應力松弛實驗結果顯示，視神經損傷動物模型以BDNF干預組和以hUCBSC干預組大鼠視神經的7200s應力下降量大于視神經損傷動物模型組(P<0.05)，視神經損傷動物模型以BDNF干預組7200s應力下降量小于以hUCBSC干預組 (P<0.05)，各組大鼠視神經試樣的應力松弛曲線均以對數函數關系變化，視神經損傷后改變了視神經的應力松弛特性。

大鼠視神經電生理、應力松弛檢測結果證明，視神經損傷模型大鼠以BDNF、hUCBSC干預治療后，對視神經損傷模型大鼠電生理指標、應力松弛特性指標具有恢復的作用，說明視神經損傷模型大鼠通過以BDNF神經營養因子、人臍血干細胞(hUCBSC)干預治療，具有一定的療效，以hUCBSC的干預治療神經損傷模型大鼠的效果更好。

視神經為粘彈性生物材料，粘彈性生物材料的粘彈性的表現形式主要為蠕變和應力松弛，視神經的應力松弛特性是視神經承受應變適應性的反應。視神經的應力松弛特性是為了適應其生理功能需要而存在的，視神經正常范圍的應力松弛力學特性有利于抵抗恒變形對視神經的傷害，完整結構的視神經應力松弛特性有利于視神經的生理功能需。分析認為，大鼠視神經損傷后，纖維結構紊亂、排列發生了改變，對應力松弛特性產生了影響。視神經損傷通過以hUCBS、BDNF干預治療后視神經的應力松弛特性得到了一定的恢復。

Chen等[10]對視神經損傷動物模型的研究發現，在動物玻璃體腔內注入BDNF，1周后視網膜存活的RGCs比例增高，得出了視神經損傷動物模型以BDNF干預治療有一定的效果，RGCs具有保護軸突作用的結論。大量的研究結果表明，外源性供給BDNF及GDNF可很好的改善節細胞的存活率,促進節細胞軸突再生[11]。本實驗結果支持參考文獻[11]視神經損傷模型動物通過BDNF干預治療可改善視神經節細胞的存活率,促進節細胞軸突再生的觀點，

臍血作為干細胞的重要來源，廣泛的應用于修復神經損傷的臨床及基礎研究中，臍血間充質干細胞對神經損傷修復的機制尚未完全搞清楚，分析認為，其作用機理系由于在局部微環境的刺激下，干細胞通過自分泌的形式產生各種細胞因子向受損組織分化并替代受損細胞，與周圍細胞建立聯系促進神經功能的恢復[12-14]。

以往以藥物干預治療視神經損傷動物的效果以電生理測試、觀察組織形態等研究居多[1]。本實驗與以往研究的區別是，對比分析了對視神經損傷模型大鼠、視神經損傷模型大鼠以BNTF、以hUCBSC干預治療后視神經的應力松弛特性，以歸一化分析的方法的方法處理各組大鼠視神經的應力松弛實驗數據，得出了各組大鼠視神經的歸一化應力松弛函數方程，建立大鼠視神經的歸一化應力松弛函數方程，能定量的闡明大鼠視神經的應力松弛力學特性。本文的創新性是以視神經的應力松弛特性等研判視神經損傷模型以BNTF、以hUCBSC干預視神經損傷的效果。

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吉林省科技發展計劃資助項目(20110492)

*通訊作者

1007-4287(2017)05-0901-04

2016-12-24)