電感耦合等離子質(zhì)譜法測定蟲草及其制品的總砷及可吸收砷含量

孫鵬飛，李龍囡，丁 晴△

（1.江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫 214000； 2.江蘇省無錫藥品檢驗所，江蘇 無錫 214000）

·檢驗檢測·

電感耦合等離子質(zhì)譜法測定蟲草及其制品的總砷及可吸收砷含量

孫鵬飛1，2，李龍囡2，丁 晴2△

（1.江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫 214000； 2.江蘇省無錫藥品檢驗所，江蘇 無錫 214000）

目的 探討蟲草中砷殘留量的檢測及限度。方法 采用電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP－MS)法測定蟲草及其制品中總砷含量，離子色譜－電感耦合等離子質(zhì)譜(IC－ICP－MS)法測定總砷超標(biāo)樣品中可吸收砷的價態(tài)。采用微波消解法和人工腸液對樣品的總砷和人體可吸收砷進(jìn)行提取。結(jié)果 除1批涼山蟲草外，其余冬蟲夏草、偽品與混淆品總砷的含量均大于2 mg／kg的限量，而蟲草菌絲體、中成藥和保健品的含量都遠(yuǎn)低于限量值。結(jié)論 蟲草中人體可吸收砷占總砷的6.80% ～16.83%，可吸收砷含量以無機砷為主；不同產(chǎn)地的蟲草不同價態(tài)砷的含量有所差異，藏蟲草中AsO33－的含量明顯高于其他蟲草。

離子色譜－電感耦合等離子體質(zhì)譜；冬蟲夏草；砷；價態(tài)；質(zhì)量檢測

冬蟲夏草(Cordyceps)為麥角菌科蟲草屬真菌冬蟲夏草菌 Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.寄生于鱗翅目蝙蝠蛾科(Hepialidae)昆蟲幼蟲上所形成的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體[1]，常見于海拔4 000m以上的高山上[2]，主產(chǎn)于四川、西藏、云南等地[3]，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗疲勞、補腎益肺、止血化痰等多種功效[4]。由于生長環(huán)境和自身的富集作用，冬蟲夏草總砷含量超標(biāo)的現(xiàn)象常有發(fā)生[5－6]。而砷是對人體有害的重金屬元素，過量的砷會在人體中蓄積，破壞人體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致腎功能損傷，造成神經(jīng)病變，甚至影響胚胎發(fā)育[7]。砷對人體的毒性與其價態(tài)密切相關(guān)，以砷化合物的半致死量(LD50)計，其毒性依次為H3As＞AsO33－＞AsO43－＞MMA(一甲基砷酸)＞DMA(二甲基砷酸)＞TMAO(三甲基砷氧)＞AsC(砷膽堿)＞AsB(砷甜菜堿)[8]。因此，要全面評價中藥中砷的毒性，單純考察總砷的量是不夠的，還應(yīng)考察其各價態(tài)砷的含量，特別是無機砷的含量。本試驗中采用離子色譜－電感耦合等離子質(zhì)譜(IC－ICP－MS)技術(shù)同時、快速地分析蟲草中可吸收砷的價態(tài)，為相關(guān)殘留量的檢測及限度的制訂奠定了基礎(chǔ)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ICS1100型離子色譜儀（Thermo Fisher公司）；iCAP Q型 ICP－MS（Thermo公司）；MARS6微波消解儀（美國CEM公司）；EHD－16型趕酸板（東航科儀公司）；METTLER XS－205型電子天平(賽恩斯公司)；KH－300DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)公司)；ST－16型高速離心機（Thermo公司）；Milli－Q超純水機（Millipore公司）。

1.2 試藥

砷單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、AsC溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、MMA溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、DMA溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、AsO33－溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、AsO43－溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購于中國計量科學(xué)研究院；金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心；Ba，Bi，Ce，Co，In，li，U調(diào)諧液(質(zhì)量濃度為1.0μg／L)購于Thermo Scientific；水為超純水。

Y1～Y4（冬蟲夏草，Cordyceps sinensis，產(chǎn)地為西藏）；Y5（冬蟲夏草，Cordyceps sinensis，產(chǎn)地為四川）；Y6（安徽蟲草，CordycepshawkesiiGray，產(chǎn)地為安徽）；Y7～Y10（古尼蟲草，Cordycepsgunnii，購于貴州）；Y11（涼山蟲草，Cordyceps liangshanensis Zang，Liu et Hu，產(chǎn)地為四川）；Y12（北蟲草，Cordycepsmilitaris，產(chǎn)地為上海）；Y13～Y15（金水寶膠囊，藥品，由菌絲體 Paecilomyceshepia－lihen etDai制成）；Y16（寧心寶膠囊，藥品，由菌絲體 Cephalospovium sinens is Chen.sp.nov制成）；Y17（蟲草膠囊，保健食品，由蟲草菌絲體制成）；Y18（蟲草膠囊，保健食品，由冬蟲夏草、麥綠素制成）；Y19（蟲草清肺膠囊，藥品，處方含量為1 000粒含1.4 g）；Y20（利肺片，藥品，處方含量為1 000片含4 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 IC及ICP－M S條件

2.1.1 IC條件

色譜柱：DionexIonPacAs19柱(250 mm×4 mm，4μm)；流動相：含10 mmol／L乙酸鈉、3 mmol／L硝酸鉀、10mmol／L磷酸二氫鉀、0.2mmol／L乙二胺四乙酸二鈉的緩沖液（氨水調(diào)節(jié)pH為10）－無水乙醇（99∶1）；流速：1.0mL／min；進(jìn)樣體積：25μL；柱溫：30℃。

2.1.2 ICP－MS條件

KED模式；檢測質(zhì)量數(shù) m／z＝75(As)；霧化室溫度：2℃；載氣：高純氬；碰撞氣體：高純氦。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制及線性關(guān)系考察

砷標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密吸取砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用10%硝酸稀釋至0，5，10，50，100，200μg／L的系列質(zhì)量濃度溶液，作為砷總量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（C）、信號強度（cps）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為 A＝1 150.332 7C＋475.103 5，r＝0.999 5（n＝6）。結(jié)果表明，砷單元素質(zhì)量濃度線性范圍是0～200μg／L。

砷價態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密吸取 AsB，MMA，DMA，AsO33－，AsO43－對照品溶液適量，加0.02mol／L乙二胺四乙酸二鈉溶液配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。其中AsB，MMA，DMA質(zhì)量濃度為1，2，5，10，20μg／L，AsO33－，AsO43－質(zhì)量濃度為 1，5，10，25，50μg／L（分別以 AsB，MMA，DMA，AsO33－，AsO43－計）。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（C）、信號強度（cps）為縱坐標(biāo)，5種價態(tài)砷在擬訂色譜條件下分離狀態(tài)較好(見圖1)，且在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表1。

2.3 總砷含量測定

2.3.1 方法學(xué)考察

精密度試驗：取質(zhì)量濃度為200μg／L的砷標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果的 RSD為3.40%（n＝6），表明儀器精密度好。

重復(fù)性試驗：取樣品Y3約0.2 g，共6份，分別按供試品溶液的制備方法操作，進(jìn)行測定，計算砷的含量。結(jié)果的 RSD為3.41%（n＝6），表明方法重復(fù)性好。

加樣回收試驗：取冬蟲夏草樣品Y3約0.1 g，精密稱定，加入10μg／m L的砷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.125m L，按供試品溶液制備方法制備溶液，平行測定6份，計算回收率。結(jié)果見表2。

圖1 5種不同價態(tài)砷的分離效果圖

表1 5種不同價態(tài)砷的線性回歸方程

表2 冬蟲夏草總砷加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

檢出限確定：取超純水連續(xù)進(jìn)樣11次，導(dǎo)出質(zhì)量濃度 SD值，SD值的3倍和10倍分別為儀器檢出限和定量限。結(jié)果儀器檢出限為0.094μg／L（n＝11），定量限為0.313μg／L（n＝11）。

穩(wěn)定性試驗：選取1份4℃冰箱保存的供試品溶液，分別于 1，2，3 d進(jìn)樣測定。結(jié)果總砷的 RSD為6.98%（n＝3），表明供試品溶液于 3 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2 樣品總砷含量測定

將樣品置烘箱中60℃干燥3 h，打粉，過2號篩，備用。取粉末0.2 g，精密稱定，置消解罐中，加5 mL濃硝酸，置趕酸板上120℃預(yù)消解30min，冷卻，將消解罐置微波消解儀中180℃消解30min，將消解后樣品轉(zhuǎn)移至50mL聚四氟乙烯容量瓶中，加入1μg／mL的金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液200μL，用超純水定容至刻度線。4 000 r／min離心15 min，取上清，用ICP－MS測定總砷的含量。除不加金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液外，其余同法制備試劑空白溶液。結(jié)果見圖2。

圖2 20批樣品總砷測定結(jié)果（n＝3）

2.4 人體可吸收砷含量測定

2.4.1 方法學(xué)考察

精密度試驗：用含AsB，MMA，DMA，AsO33－，AsO43－各5μg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果的 RSD分別為2.14%，4.04%，3.20%，2.40%，3.98%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取樣品Y3約0.2 g，精密稱定，共6份，分別按供試品溶液的制備方法操作，并進(jìn)行測定。結(jié)果AsB，AsO33－，AsO43－的 RSD分別為 4.13%，4.17%，2.89%（n＝6），表明方法重復(fù)性好。

加樣回收試驗：取樣品Y3約0.1 g，精密稱定，加入含 AsB，MMA，DMA，AsO33－，AsO43－各0.2，2.0，2.0，4.0，2.0μg／m L不同價態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)混合溶液25μL，依法制備供試品溶液，平行測定6份，計算回收率。結(jié)果見表3。

檢出限確定：將1μg／L的不同價態(tài)砷標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)樣，計算各峰信噪比，并將信噪比轉(zhuǎn)換為3∶1作為各價態(tài)砷的檢測限。結(jié)果AsB，MMA，DMA，AsO43－的檢測限約為0.25μg／L，AsO33－的檢測限約為0.15μg／L。

表3 冬蟲夏草人體可吸收砷回收試驗結(jié)果（n＝6）

表4 冬蟲夏草中人體可吸收砷的含量測定結(jié)果（mg／kg，n＝3）

2.4.2 樣品不同價態(tài)砷含量測定

取樣品0.2 g，精密稱定，置15m L塑料離心管中，精密加入人工腸液10m L，37℃水浴超聲1 h，搖勻，靜置24 h，4 000 r／min離心15min，上清液用0.45μm濾膜濾過，搖勻，按同一方法作空白試驗。采用IC－ICP－MS測定10批樣品各價態(tài)砷的含量，結(jié)果見表4。樣品中不同價態(tài)砷含量與其總砷量進(jìn)行比較，結(jié)果見圖3。

圖3 不同價態(tài)砷（以砷計）占樣品總砷百分比

3 討論

控制冬蟲夏草中重金屬的含量，對于提高藥材質(zhì)量、保證安全用藥具有重要的意義[9－12]。本試驗中采用ICP－MS法對20批蟲草及有關(guān)制品中的總砷量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：除1批涼山蟲草外，5批藏蟲草、1批四川蟲草、1批安徽蟲草和4批古尼蟲草總砷含量均超出2015年版《中國藥典（一部）》[1]及2004年版《藥用植物及制劑外貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[13]中規(guī)定的“As≤2mg／kg”。蟲草花、蟲草菌絲體、保健食品及中成藥中總砷的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于規(guī)定限量；正品蟲草、偽蟲草及地方習(xí)用蟲草總砷的含量未發(fā)現(xiàn)明顯差異。

有報道稱，大部分真菌對生長環(huán)境中的重金屬元素具有較好富集能力[14]，因此蟲草中總砷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人工培養(yǎng)的蟲草花及蟲草菌絲體，甚至超出規(guī)定限量，很可能是由于生長環(huán)境中砷元素含量較高引起的。另外，蟲草采挖時泥土未清理干凈也可能是導(dǎo)致其總砷含量超標(biāo)的另一個原因。中成藥和保健品中含有冬蟲夏草，但含量較低，未發(fā)現(xiàn)總砷超標(biāo)現(xiàn)象。

為進(jìn)一步確定蟲草中人體可吸收的砷的量及其毒性，本研究中采用人工腸液對有關(guān)樣品進(jìn)行消化并采用IC－ICP－MS法對4批藏蟲草、1批四川蟲草、1批安徽蟲草、4批古尼蟲草中砷的價態(tài)進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，人體可吸收的砷的量占總砷的6.80%～16.83%，且含量以無機砷為主，占人體可吸收砷總量的90%以上，有機砷僅AsB有所檢出。冬蟲夏草中AsO33－占人體可吸收砷的比重要大于偽冬蟲夏草及其混淆品。不同產(chǎn)地間，藏蟲草AsO33－的量占可吸收砷的比重達(dá)到63%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他產(chǎn)地蟲草。世界衛(wèi)生組織（WHO）建議，每人無機砷的安全攝入量為129μg／d，而我國一般人群攝入量為 75.45～88.58μg／d[15]。按 Y10無機砷含量計算，每人可服用的冬蟲夏草的限量為29.25 g／d，而2015年版《中國藥典（一部）》建議用量為3～9 g／d。因此，就食用蟲草而言，每日無機砷總攝入量是不至于超過允許限量的。由于冬蟲夏草價格昂貴，收集的實驗樣品有限，有關(guān)結(jié)果尚需進(jìn)一步試驗驗證。

綜上所述，本研究中建立了測定冬蟲夏草砷價態(tài)的IC－ICP－MS法，重現(xiàn)性好，回收率高，基本能夠滿足蟲草砷形態(tài)的定量分析，可為相關(guān)有害元素檢測提供一定依據(jù)。

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Content Determ ination of Total and Absorbable Arsenic in Cordyceps Sinensis and Relevant Products by ICP－MS

Sun Pengfei1,2,Li Longnan2,Ding Qing2
(1.College of Pharmacy,Jiangnan University,Wuxi,Jiangsu,China 214000; 2.Wuxi Institute for Drug Control of Jiangsu Province,Wuxi,Jiangsu,China 214000)

Ob jective To investigate the detection and limit of arsenic residue in Cordyceps Sinensis and its products.M ethods The content of total and absorbable arsenic in Cordyceps Sinensis and relevant products were determined by ICP－MS,the valence of absorbable arsenic in the total arsenic excess sample by IC－ICP－MS.The total arsenic and the arsenic can be absorbed by human body in the sample were extracted by the microwave digestion method and artificial intestinal juice.Results In addition to a batch of Cordyceps Liangshanensis,the total arsenic content in all the Cordyceps Sinensis and its adulterants exceeded the standard of 2 mg／kg.The contents of Cordyceps Sinensis mycelium,Chinese patent medicine and health products are far below the limit.Conclusion The absorbable arsenic accounted for 6.80% －16.83% of the total arsenic,and most of the absorbable arsenic is inorganic arsenic.The content of different valence state of arsenic in different regions of Cordyceps Sinensis is different.The content of AsO33－in Tibetan Cordyceps Sinensis is significantly higher than the others.

IC－ICP－MS;Cordyceps Sinensis;arsenic;valence state;quality test

2016－10－01；

2017－01－20)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.07.009

孫鵬飛（1991－），男，在讀碩士研究生，研究方向為藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，（電子信箱）947645776＠qq.com。

丁晴，女，主任藥師，研究方向為中藥鑒定與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，（電子信箱）dqwx2007＠126.com。

R284.1；R282.71

A

1006－4931(2017)07－0027－05