電感耦合等離子質譜法測定蟲草及其制品的總砷及可吸收砷含量

孫鵬飛，李龍囡，丁 晴△

（1.江南大學藥學院，江蘇 無錫 214000； 2.江蘇省無錫藥品檢驗所，江蘇 無錫 214000）

·檢驗檢測·

電感耦合等離子質譜法測定蟲草及其制品的總砷及可吸收砷含量

孫鵬飛1，2，李龍囡2，丁 晴2△

（1.江南大學藥學院，江蘇 無錫 214000； 2.江蘇省無錫藥品檢驗所，江蘇 無錫 214000）

目的 探討蟲草中砷殘留量的檢測及限度。方法 采用電感耦合等離子質譜(ICP－MS)法測定蟲草及其制品中總砷含量，離子色譜－電感耦合等離子質譜(IC－ICP－MS)法測定總砷超標樣品中可吸收砷的價態。采用微波消解法和人工腸液對樣品的總砷和人體可吸收砷進行提取。結果 除1批涼山蟲草外，其余冬蟲夏草、偽品與混淆品總砷的含量均大于2 mg／kg的限量，而蟲草菌絲體、中成藥和保健品的含量都遠低于限量值。結論 蟲草中人體可吸收砷占總砷的6.80% ～16.83%，可吸收砷含量以無機砷為主；不同產地的蟲草不同價態砷的含量有所差異，藏蟲草中AsO33－的含量明顯高于其他蟲草。

離子色譜－電感耦合等離子體質譜；冬蟲夏草；砷；價態；質量檢測

冬蟲夏草(Cordyceps)為麥角菌科蟲草屬真菌冬蟲夏草菌 Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.寄生于鱗翅目蝙蝠蛾科(Hepialidae)昆蟲幼蟲上所形成的子座及幼蟲尸體的復合體[1]，常見于海拔4 000m以上的高山上[2]，主產于四川、西藏、云南等地[3]，具有調節免疫、抗腫瘤、抗疲勞、補腎益肺、止血化痰等多種功效[4]。由于生長環境和自身的富集作用，冬蟲夏草總砷含量超標的現象常有發生[5－6]。而砷是對人體有害的重金屬元素，過量的砷會在人體中蓄積，破壞人體免疫系統，導致腎功能損傷，造成神經病變，甚至影響胚胎發育[7]。砷對人體的毒性與其價態密切相關，以砷化合物的半致死量(LD50)計，其毒性依次為H3As＞AsO33－＞AsO43－＞MMA(一甲基砷酸)＞DMA(二甲基砷酸)＞TMAO(三甲基砷氧)＞AsC(砷膽堿)＞AsB(砷甜菜堿)[8]。因此，要全面評價中藥中砷的毒性，單純考察總砷的量是不夠的，還應考察其各價態砷的含量，特別是無機砷的含量。本試驗中采用離子色譜－電感耦合等離子質譜(IC－ICP－MS)技術同時、快速地分析蟲草中可吸收砷的價態，為相關殘留量的檢測及限度的制訂奠定了基礎。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ICS1100型離子色譜儀（Thermo Fisher公司）；iCAP Q型 ICP－MS（Thermo公司）；MARS6微波消解儀（美國CEM公司）；EHD－16型趕酸板（東航科儀公司）；METTLER XS－205型電子天平(賽恩斯公司)；KH－300DE數控超聲波清洗器(昆山禾創公司)；ST－16型高速離心機（Thermo公司）；Milli－Q超純水機（Millipore公司）。

1.2 試藥

砷單元素溶液標準物質、AsC溶液標準物質、MMA溶液標準物質、DMA溶液標準物質、AsO33－溶液標準物質、AsO43－溶液標準物質均購于中國計量科學研究院；金單元素標準溶液購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心；Ba，Bi，Ce，Co，In，li，U調諧液(質量濃度為1.0μg／L)購于Thermo Scientific；水為超純水。

Y1～Y4（冬蟲夏草，Cordyceps sinensis，產地為西藏）；Y5（冬蟲夏草，Cordyceps sinensis，產地為四川）；Y6（安徽蟲草，CordycepshawkesiiGray，產地為安徽）；Y7～Y10（古尼蟲草，Cordycepsgunnii，購于貴州）；Y11（涼山蟲草，Cordyceps liangshanensis Zang，Liu et Hu，產地為四川）；Y12（北蟲草，Cordycepsmilitaris，產地為上海）；Y13～Y15（金水寶膠囊，藥品，由菌絲體 Paecilomyceshepia－lihen etDai制成）；Y16（寧心寶膠囊，藥品，由菌絲體 Cephalospovium sinens is Chen.sp.nov制成）；Y17（蟲草膠囊，保健食品，由蟲草菌絲體制成）；Y18（蟲草膠囊，保健食品，由冬蟲夏草、麥綠素制成）；Y19（蟲草清肺膠囊，藥品，處方含量為1 000粒含1.4 g）；Y20（利肺片，藥品，處方含量為1 000片含4 g）。

2 方法與結果

2.1 IC及ICP－M S條件

2.1.1 IC條件

色譜柱：DionexIonPacAs19柱(250 mm×4 mm，4μm)；流動相：含10 mmol／L乙酸鈉、3 mmol／L硝酸鉀、10mmol／L磷酸二氫鉀、0.2mmol／L乙二胺四乙酸二鈉的緩沖液（氨水調節pH為10）－無水乙醇（99∶1）；流速：1.0mL／min；進樣體積：25μL；柱溫：30℃。

2.1.2 ICP－MS條件

KED模式；檢測質量數 m／z＝75(As)；霧化室溫度：2℃；載氣：高純氬；碰撞氣體：高純氦。

2.2 標準品溶液的配制及線性關系考察

砷標準溶液：精密吸取砷單元素標準溶液，用10%硝酸稀釋至0，5，10，50，100，200μg／L的系列質量濃度溶液，作為砷總量測定的標準曲線。以質量濃度為橫坐標（C）、信號強度（cps）為縱坐標繪制標準曲線，線性方程為 A＝1 150.332 7C＋475.103 5，r＝0.999 5（n＝6）。結果表明，砷單元素質量濃度線性范圍是0～200μg／L。

砷價態標準溶液：精密吸取 AsB，MMA，DMA，AsO33－，AsO43－對照品溶液適量，加0.02mol／L乙二胺四乙酸二鈉溶液配制混合標準溶液。其中AsB，MMA，DMA質量濃度為1，2，5，10，20μg／L，AsO33－，AsO43－質量濃度為 1，5，10，25，50μg／L（分別以 AsB，MMA，DMA，AsO33－，AsO43－計）。以質量濃度為橫坐標（C）、信號強度（cps）為縱坐標，5種價態砷在擬訂色譜條件下分離狀態較好(見圖1)，且在相應質量濃度范圍內線性關系良好，見表1。

2.3 總砷含量測定

2.3.1 方法學考察

精密度試驗：取質量濃度為200μg／L的砷標準溶液連續進樣6次。結果的 RSD為3.40%（n＝6），表明儀器精密度好。

重復性試驗：取樣品Y3約0.2 g，共6份，分別按供試品溶液的制備方法操作，進行測定，計算砷的含量。結果的 RSD為3.41%（n＝6），表明方法重復性好。

加樣回收試驗：取冬蟲夏草樣品Y3約0.1 g，精密稱定，加入10μg／m L的砷標準溶液0.125m L，按供試品溶液制備方法制備溶液，平行測定6份，計算回收率。結果見表2。

圖1 5種不同價態砷的分離效果圖

表1 5種不同價態砷的線性回歸方程

表2 冬蟲夏草總砷加樣回收試驗結果（n＝6）

檢出限確定：取超純水連續進樣11次，導出質量濃度 SD值，SD值的3倍和10倍分別為儀器檢出限和定量限。結果儀器檢出限為0.094μg／L（n＝11），定量限為0.313μg／L（n＝11）。

穩定性試驗：選取1份4℃冰箱保存的供試品溶液，分別于 1，2，3 d進樣測定。結果總砷的 RSD為6.98%（n＝3），表明供試品溶液于 3 d內穩定性良好。

2.3.2 樣品總砷含量測定

將樣品置烘箱中60℃干燥3 h，打粉，過2號篩，備用。取粉末0.2 g，精密稱定，置消解罐中，加5 mL濃硝酸，置趕酸板上120℃預消解30min，冷卻，將消解罐置微波消解儀中180℃消解30min，將消解后樣品轉移至50mL聚四氟乙烯容量瓶中，加入1μg／mL的金單元素標準溶液200μL，用超純水定容至刻度線。4 000 r／min離心15 min，取上清，用ICP－MS測定總砷的含量。除不加金單元素標準溶液外，其余同法制備試劑空白溶液。結果見圖2。

圖2 20批樣品總砷測定結果（n＝3）

2.4 人體可吸收砷含量測定

2.4.1 方法學考察

精密度試驗：用含AsB，MMA，DMA，AsO33－，AsO43－各5μg／L的混合標準溶液連續進樣6次。結果的 RSD分別為2.14%，4.04%，3.20%，2.40%，3.98%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品Y3約0.2 g，精密稱定，共6份，分別按供試品溶液的制備方法操作，并進行測定。結果AsB，AsO33－，AsO43－的 RSD分別為 4.13%，4.17%，2.89%（n＝6），表明方法重復性好。

加樣回收試驗：取樣品Y3約0.1 g，精密稱定，加入含 AsB，MMA，DMA，AsO33－，AsO43－各0.2，2.0，2.0，4.0，2.0μg／m L不同價態砷標準混合溶液25μL，依法制備供試品溶液，平行測定6份，計算回收率。結果見表3。

檢出限確定：將1μg／L的不同價態砷標準混合溶液進樣，計算各峰信噪比，并將信噪比轉換為3∶1作為各價態砷的檢測限。結果AsB，MMA，DMA，AsO43－的檢測限約為0.25μg／L，AsO33－的檢測限約為0.15μg／L。

表3 冬蟲夏草人體可吸收砷回收試驗結果（n＝6）

表4 冬蟲夏草中人體可吸收砷的含量測定結果（mg／kg，n＝3）

2.4.2 樣品不同價態砷含量測定

取樣品0.2 g，精密稱定，置15m L塑料離心管中，精密加入人工腸液10m L，37℃水浴超聲1 h，搖勻，靜置24 h，4 000 r／min離心15min，上清液用0.45μm濾膜濾過，搖勻，按同一方法作空白試驗。采用IC－ICP－MS測定10批樣品各價態砷的含量，結果見表4。樣品中不同價態砷含量與其總砷量進行比較，結果見圖3。

圖3 不同價態砷（以砷計）占樣品總砷百分比

3 討論

控制冬蟲夏草中重金屬的含量，對于提高藥材質量、保證安全用藥具有重要的意義[9－12]。本試驗中采用ICP－MS法對20批蟲草及有關制品中的總砷量進行檢測，結果表明：除1批涼山蟲草外，5批藏蟲草、1批四川蟲草、1批安徽蟲草和4批古尼蟲草總砷含量均超出2015年版《中國藥典（一部）》[1]及2004年版《藥用植物及制劑外貿綠色行業標準》[13]中規定的“As≤2mg／kg”。蟲草花、蟲草菌絲體、保健食品及中成藥中總砷的含量遠遠低于規定限量；正品蟲草、偽蟲草及地方習用蟲草總砷的含量未發現明顯差異。

有報道稱，大部分真菌對生長環境中的重金屬元素具有較好富集能力[14]，因此蟲草中總砷含量遠遠高于人工培養的蟲草花及蟲草菌絲體，甚至超出規定限量，很可能是由于生長環境中砷元素含量較高引起的。另外，蟲草采挖時泥土未清理干凈也可能是導致其總砷含量超標的另一個原因。中成藥和保健品中含有冬蟲夏草，但含量較低，未發現總砷超標現象。

為進一步確定蟲草中人體可吸收的砷的量及其毒性，本研究中采用人工腸液對有關樣品進行消化并采用IC－ICP－MS法對4批藏蟲草、1批四川蟲草、1批安徽蟲草、4批古尼蟲草中砷的價態進行了測定。結果表明，人體可吸收的砷的量占總砷的6.80%～16.83%，且含量以無機砷為主，占人體可吸收砷總量的90%以上，有機砷僅AsB有所檢出。冬蟲夏草中AsO33－占人體可吸收砷的比重要大于偽冬蟲夏草及其混淆品。不同產地間，藏蟲草AsO33－的量占可吸收砷的比重達到63%以上，遠遠高于其他產地蟲草。世界衛生組織（WHO）建議，每人無機砷的安全攝入量為129μg／d，而我國一般人群攝入量為 75.45～88.58μg／d[15]。按 Y10無機砷含量計算，每人可服用的冬蟲夏草的限量為29.25 g／d，而2015年版《中國藥典（一部）》建議用量為3～9 g／d。因此，就食用蟲草而言，每日無機砷總攝入量是不至于超過允許限量的。由于冬蟲夏草價格昂貴，收集的實驗樣品有限，有關結果尚需進一步試驗驗證。

綜上所述，本研究中建立了測定冬蟲夏草砷價態的IC－ICP－MS法，重現性好，回收率高，基本能夠滿足蟲草砷形態的定量分析，可為相關有害元素檢測提供一定依據。

[1]中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：115.

[2]王 征，劉建利.冬蟲夏草化學成分研究進展[J].中草藥，2009，40（4）：1157－1160.

[3]郭宏春，高繼全，習欠云，等.冬蟲夏草研究進展[J].微生物學雜志，2003，23（1）：50－55.

[4]胡 敏，皮惠敏，鄭元梅.冬蟲夏草的化學成分及藥理作用[J].時珍國醫國藥，2008，19（11）：2804－2806.

[5]王鋼力，金紅宇，韓小萍，等.冬蟲夏草藥材的質量研究及存在問題[J].中草藥，2008，39（1）：115－118.

[6]劉 騰.冬蟲夏草重金屬危機[N].中國經營報，2012－10－22（A14）.

[7]李羨筠.砷的毒性及排砷研究進展[J].職業與健康，2012，28(6)：742－744.

[8]王 庚.ICP－MS用于海洋和中藥材中重金屬元素及其汞砷形態分析的研究[D].濟南：山東大學，2008.

[9]Chen YL，Li JT，Hu Q，et al.Detection of 21 Elements in CORDYCEPS Grown in Xinghai County by ICP－OES／ICP－MS[J].Medicinal Plant，2015，6（5－6）：21－22.

[10]陳 輝.微波消解ICP－MS測定冬蟲夏草中銅、鉛、砷和鎘的含量[J].光譜實驗室，2010，27（1）：309－311.

[11]汪 瓊，徐增萊，呂 曄 .微波消解ICP－MS法測定冬蟲夏草中30種無機元素的含量[J].江蘇農業科學，2013，41（2）：269－270.

[12]潘清靈，代安國，熊衛萍，等.微波消解ICP－MS法測定西藏冬蟲夏草中的微量元素[J].中國民族民間醫藥，2014，23（8）：33－35.

[13]WM－T2－2004.藥用植物及制劑外貿綠色行業標準[S].

[14]張曉檸，蘭 進.食藥用菌重金屬富集機理及應用研究進展[J].時珍國醫國藥，2006，17（12）：2593－2594.

[15]楊惠芬，梁春穗，董仕林，等.中國部分地區食品中無機砷的監測及其限量衛生標準[J].衛生研究，2002，31（6）：431－434.

Content Determ ination of Total and Absorbable Arsenic in Cordyceps Sinensis and Relevant Products by ICP－MS

Sun Pengfei1,2,Li Longnan2,Ding Qing2
(1.College of Pharmacy,Jiangnan University,Wuxi,Jiangsu,China 214000; 2.Wuxi Institute for Drug Control of Jiangsu Province,Wuxi,Jiangsu,China 214000)

Ob jective To investigate the detection and limit of arsenic residue in Cordyceps Sinensis and its products.M ethods The content of total and absorbable arsenic in Cordyceps Sinensis and relevant products were determined by ICP－MS,the valence of absorbable arsenic in the total arsenic excess sample by IC－ICP－MS.The total arsenic and the arsenic can be absorbed by human body in the sample were extracted by the microwave digestion method and artificial intestinal juice.Results In addition to a batch of Cordyceps Liangshanensis,the total arsenic content in all the Cordyceps Sinensis and its adulterants exceeded the standard of 2 mg／kg.The contents of Cordyceps Sinensis mycelium,Chinese patent medicine and health products are far below the limit.Conclusion The absorbable arsenic accounted for 6.80% －16.83% of the total arsenic,and most of the absorbable arsenic is inorganic arsenic.The content of different valence state of arsenic in different regions of Cordyceps Sinensis is different.The content of AsO33－in Tibetan Cordyceps Sinensis is significantly higher than the others.

IC－ICP－MS;Cordyceps Sinensis;arsenic;valence state;quality test

2016－10－01；

2017－01－20)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.07.009

孫鵬飛（1991－），男，在讀碩士研究生，研究方向為藥品質量標準研究，（電子信箱）947645776＠qq.com。

丁晴，女，主任藥師，研究方向為中藥鑒定與質量標準研究，（電子信箱）dqwx2007＠126.com。

R284.1；R282.71

A

1006－4931(2017)07－0027－05