空間位阻對溶解態甲基菲生物降解的影響

杜 蘭,張振軒,朱亞先,張 勇*

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空間位阻對溶解態甲基菲生物降解的影響

杜 蘭1,張振軒1,朱亞先2,張 勇1*

(1.廈門大學環境與生態學院,近海海洋環境科學國家重點實驗室,福建廈門 361102；2.廈門大學化學化工學院化學系,福建廈門361005)

以菲(Phe)和甲基菲(MP:1-MP、3-MP、4-MP、9-MP)為研究對象,運用同步熒光法研究微生物US6-1對5種溶解態多環芳烴(PAHs)的降解特性.結果顯示:MP在8×10-7,1.2×10-6mol/L2種濃度下,其生物降解過程符合零級動力學,降解速率均為:4-MP<9-MP<1-MP<3-MP;5種PAHs的最大生物降解速率同理論最大跨膜通量存在良好的線性關系;NaN3對Phe降解速率影響較小,但抑制MP降解且抑制程度與取代基位置有關.

甲基菲；同系物；生物降解；跨膜過程

菲(Phe)及其烷基取代物是石油中常見的有機污染物[1-2].烷基取代多環芳烴(A-PAHs)的毒性常常強于其母環PAHs,在環境中尤其是海洋溢油區,其含量顯著高于其母環化合物[3-4].因此研究水環境中A-PAHs的污染及其去除十分重要.生物降解是去除環境中PAHs最為有效的手段之一[5-6].研究表明細菌對PAHs的降解多屬于胞內反應,生物體內降解酶系是影響細菌降解PAHs的關鍵因素[7-8];PAHs進入細胞的途徑是影響其降解的重要因素;而底物的位阻效應會干擾其與降解酶和膜轉運蛋白的結合[9-10],進而影響底物的降解過程[11-12].取代基位阻效應對甲基萘生物降解影響已有報道[13-15].然而,目前關于溶解態A-PAHs尤其是3環及以上A-PAHs結構的差異對其生物降解影響的研究鮮見報道.

本文選取新鞘氨醇桿菌() US6-1為降解菌,以Phe及甲基菲(MP, 如1-MP、3-MP、4-MP和9-MP)為研究對象,運用同步熒光法研究上述目標物生物降解過程和跨膜機理,以期為評估PAHs在水環境中轉化,歸宿及風險性提供參考.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Phe、1-MP、3-MP、4-MP和9-MP(純度>98%,美國Sigma-Aldrich公司); (NH4)2SO4、Na2HPO4、K2HPO4、(NH4)6Mo7O24·4H2O、CaCl2·2H2O、NaOH、FeCl3·6H2O、MgSO4·7H2O (A.R.,國藥化學試劑有限公司);無水乙醇(A.R.,西隴化工股份有限公司);富營養培養基:2216E(青島海博生物技術有限公司),NaN3(純度>99%,天津福晨化學試劑廠). MSM液體培養基的配制參照文獻[16].

FLS 920型納秒時間分辨熒光光譜儀(Edinburgh Instrument公司,英國);752紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司);HV-50全自動電子滅菌器(Hiragama公司,日本);Universal 320R高速冷凍離心機(Hettich公司,德國); VS- 840K-U潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司); Sky 2102C恒溫振蕩器(上海蘇坤實業有限公司).

1.2 實驗材料

US6-1由韓國海洋研究與發展院提供,可降解芴, Phe,蒽和芘(Pyr)等PAHs[16].

1.3 實驗方法

1.3.1 Phe及MP同步熒光法波長差(Δ)的選取 熒光法具有快速、靈敏和非破壞性等特點,已被用于檢測生物降解過程中溶解態PAHs的濃度變化[17].分別稱取一定量Phe、1-MP、3-MP、4-MP和9-MP標準品溶于乙醇,配制成1.0×10-2mol/L的儲備液,置于4℃冰箱保存.取適量PAHs儲備液于10mL比色管中,氮吹至近干后用MSM溶液定容至10mL,混勻并超聲20min.分別掃描上述5種PAHs的熒光光譜,設置ex=220~340nm,em= 320~420nm;步距均為2nm;激發和發射狹縫均為2nm,確定5種PAHs的Δ和波長范圍[17-18].

1.3.2 PAHs的生物降解實驗 為考察US6-1對MP降解規律及其與濃度的關系,對5種PAHs在2種濃度條件下的降解過程展開研究.第1組PAHs濃度均為0.8×10-6mol/L,第2組PAHs濃度均為1.2×10-6mol/L.取適量上述PAHs儲備液于125mL錐形瓶中,氮吹至近干后加入100mL MSM溶液.接種菌后于搖床中避光震蕩培養(25℃, 150r/min)[16].適當時間后以1.3.1節方法直接測定降解體系中PAHs熒光強度.實驗設3組平行.通過預實驗發現,當降解菌初始生物量OD600=0.001時,降解PAHs效率高且實驗現象明顯,其余具體實驗方法同1.3.1節.實驗所用容器及培養液均經過高溫高壓滅菌20min.

1.3.3 最大生物降解速率 Phe濃度為5.0× 10-6mol/L,MP在濃度為1.2×10-6mol/L實驗見1.3.2節.取降解菌初始生物量OD600=0.001,其余具體實驗方法同1.3.1節.

1.3.4 PAHs跨膜方式的研究方法 為使5種PAHs在較短時間內降解明顯,對照組和實驗組中Phe和3-MP濃度為8×10-7mol/L,1-MP濃度為7×10-7mol/L, 4-MP濃度為3×10-7mol/L, 9MP濃度為5×10-7mol/L.取適量NaN3配置成5mol/L儲備液,實驗時取600mL儲備液加入實驗組降解體系,使其最終濃度為30mmol/L,OD600= 0.001.其余實驗過程參考1.3.1節.

2 結果與討論

2.1 Phe及MP同步熒光波長差的選取及其工作曲線

表1 同步熒光光譜法的分析特性參數

運用同步熒光技術,每隔1nm,分別考察Δ=45~65nm時Phe和MP的同步熒光光譜.結果表明Phe、1-MP、3-MP、4-MP和9-MP的最佳測定波長差分別為54,52,53,55,55nm.在各自最優條件下,分別掃描梯度濃度PAHs溶液的同步熒光,并以各自最大熒光峰處強度()對其濃度(,mol/L)作圖.結果表明,一定濃度范圍內5種PAHs的濃度(mmol/L)和熒光信號值呈良好的線性關系,其分析特性見表1.

2.2 空間位阻對MP生物降解影響

已有文獻報道US6-1可降解苯并[a]芘[19]、Phe[20]、Pyr[20]等,關于其對MP降解未見相關報道.本實驗結果顯示(圖1),US6-1不僅可降解Phe,還可有效降解MP.

對實驗數據進行動力學擬合(表2).結果表明在0.8×10-6和1.2×10-6mol/L 2種濃度條件下,Phe及MP降解過程均符合零級動力學方程(230.9738),且其降解速率隨濃度增大而增大.5種PAHs降解速率大小順序為4-MP(位)<9-MP(位)<1-MP(位)<3-MP(位)≈Phe,其中3-MP的降解速率常數分別是1-MP、4-MP、9-MP的1.24、3.68、1.75倍,可見位取代的MP降解要明顯慢于位取代的MP. Malmquist等[21]研究指出A-PAHs生物降解速率受烷基取代基位置的影響.俞頔等[22]分析了非溶解態烷基萘各異構體生物降解過程,證實了烷基萘在石油介質中的降解受控于異構體萘環上取代基位置.Wammer和Peters[23]研究了對溶解態甲基萘(MN) 異構體生物降解過程中發現類似的現象.結合本研究結果可知,a位取代的A-PAHs降解要慢于b位取代的A-PAHs.其原因可能是甲基取代基的空間位阻效應阻礙了MP與酶結合[10,24-25],致使其降解速率的減小.

表2 5種PAHs生物降解動力學參數

注:為PAHs降解時間(h);為MSM溶液中PAHs的濃度(mol/L).

2.3 空間位阻對跨膜過程的影響

芳香化合物如PAHs主要通過自由擴散進入細胞[11].近年來,研究發現革蘭氏陰性細菌細胞膜上存在一些胞外蛋白參與調節吸收芳香化合物[14].Dimitriou-Cristidis等[15]指出,較于母環PAHs, A-PAHs生物降解速率下降是由于烷基取代基的空間位阻不僅影響基質與酶結合,還影響其跨膜過程. Bressler等[13]通過最大生物降解速率(max)與理論最大跨膜通量(max)的關系研究了16種溶解態有機污染物的跨膜過程與生物降解速率之間的關系.因此,為研究上述5種PAHs降解過程中跨膜作用,對表3中max和max進行線性擬合.

由圖2可知,上述PAHs的max與max存在一定的相關性,表明跨膜過程是PAHs生物降解過程中的限速步驟[13,15].由于max是由與濃度梯度相關的公式推導得到,因此這5種PAHs進入US6-1屬于被動擴散[15].另外,3-MP和4-MP偏離這條趨勢線.根據已有研究指出位于回歸線上的PAHs生物降解速率受跨膜通量影響,可認為回歸線以上的3-MP跨膜方式不僅包括自由擴散還涉及其他過程,而位于線性回歸以下的4-MP的降解不僅受跨膜的限制,還受酶轉化的影響[13].

表3 5種PAHs生物動力學參數

注 :MP的max為表2中濃度為1.2×10-6mol/L時降解速率;max是根據文獻Bressler[13]公式max=0.003×ow××WM-1/2計算得到; logow值由EPI Suite得到.

30mmol/L NaN3能抑制膜蛋白,短期內不會對酶活性產生影響[11,14].為進一步探究Phe及MP進入US6-1的方式,即烷基取代基的位阻效應是否改變了MP跨膜過程,分別考察了NaN3對Phe和MP生物降解過程的影響(圖3).

由圖3可知,前3h NaN3未影響Phe降解: 3h以內,Phe濃度相差±0.23×10-7mol/L;3.5h時,未添加NaN3Phe的剩余濃度為1.33×10-7mol/L,添加NaN3組則為1.77×10-7mol/L.因此,比較3h內NaN3存在和不存在條件下MP的降解狀況[14],結果表明較于Phe, NaN3存在下MP降解受到抑制.可能原因是當NaN3存在時,膜蛋白被抑制,而MP進入細菌體內需膜蛋白參與,因此MP跨膜轉運減少,導致MP降解速率減弱;Phe跨膜過程主要是自由擴散,不受膜蛋白影響,短期內降解不受NaN3影響[15].因此甲基取代基改變了PAHs跨膜方式:Phe主要是自由擴散,MP則需膜蛋白參與.MP受抑制程度與取代基位置有關:4-MP (19.0%)>9-MP(11.1%)>3-MP(5.52%)>1-MP(8.78%),結合2.2節MP各異構體降解快慢趨勢,發現MP受NaN3抑制程度與其生物降解過程存在相關性.有類似研究報道烴的跨膜傳輸具有選擇性且選擇的次序與細胞對底物降解的偏好性相符[26].但通過現有的技術手段無法判斷不同MP的膜上轉運蛋白性質,相關研究有待進一步開展.

3 結論

3.1 Phe和MP同步熒光法線性范圍分別為(0.08~6.00),(0.08~1.20)×10-6mol/L,2>0.9912,能夠用于US6-1降解溶解態MP的過程研究.

3.2 菲環上不同位置的甲基取代基產生了不同空間位阻效應,進而影響MP異構體的生物降解,降解速率趨勢為:4-MP(位)<9-MP(位)<1-MP(位)< 3-MP(位),位取代MP降解速率慢于位取代MP.

3.3 甲基取代基產生的空間位阻效應改變A-PAHs跨膜方式,且與取代基位置相關,進而影響其生物降解過程.生物降解過程涉及如代謝物,酶蛋白及膜轉運蛋白等諸多因素,因此為更全面了解A-PAHs生物降解過程及機理,需進一步借助如蛋白質組學和代謝物組學進行研究.

[1] Billiard S M, Meyer J N, Wassenberg D M, et al. Nonadditive effects of PAHs on early vertebrate development: mechanisms and implications for risk assessment [J]. Toxicological Sciences, 2008,105(1):5-23.

[2] Hong W J, Jia H, Li Y F, et al. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and alkylated PAHs in the coastal seawater, surface sediment and oyster from Dalian, Northeast China [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2016,128:11-20.

[3] Mu J L, Wang J, Jin F, et al. Comparative embryotoxicity of phenanthrene and alkyl-phenanthrene to marine medaka () [J]. Marine Pollution Bulletin, 2014,85(2):505-515.

[4] 海婷婷,陳穎軍,王 艷,等.民用燃煤煙氣中甲基多環芳烴的排放特征 [J]. 中國環境科學, 2013,33(6):979-984.

[5] 杜麗娜,高大文.青頂擬多孔菌對單一和復合多環芳烴的降解特性[J]. 中國環境科學, 2011,31(2):277-282.

[6] 唐玉斌,王曉朝,陳芳艷,等.芴降解優勢菌的篩選鑒定及降解特性研究 [J]. 中國環境科學, 2010,30(8):1086-1090.

[7] 刁 碩,王紅旗,許 潔,等.低溫耐鹽芘降解菌的篩選鑒定及降解特性研究 [J]. 中國環境科學, 2017,37(2):677-685.

[8] 蒙小俊,李海波,盛宇星,等.焦化廢水活性污泥 PAH 雙加氧酶基因多樣性分析 [J]. 中國環境科學, 2017,37(1): 367-372.

[9] 解寶玥,金利群,鄭裕國,等.酰胺酶催化底物特異性的研究進展 [J]. 農藥, 2012,51(7):473-477.

[10] 高興軍,郭 明,李 兵,等.二價金屬離子與牛血清白蛋白的相互作用 [J]. 浙江農林大學學報, 2013,30(5):777-783.

[11] Bugg T, Foght J M, Pickard M A, et al. Uptake and active efflux of polycyclic aromatic hydrocarbons byLP6a [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000,66(12):5387-5392.

[12] Chen B, Wang Y, Hu D. Biosorption and biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in aqueous solutions by a consortium of white-rot fungi [J]. Journal of Hazardous Materials, 2010,179(1):845-851.

[13] Bressler D C, Gray M R. Transport and reaction processes in bioremediation of organic contaminants. 1. Review of bacterial degradation and transport [J]. International Journal of Chemical Reactor Engineering, 2003,1(1):1027-1043.

[14] Dimitriou-Christidis P. Modeling the biodegradability and physicochemical properties of polycyclic aromatic hydrocarbons [D]. Texas A&M University, 2005.

[15] Dimitriou-Christidis P, Autenrieth RL, McDonald TJ, et al. Measurement of biodegradability parameters for single unsubstituted and methylated polycyclic aromatic hydrocarbons in liquid bacterial suspensions [J]. Biotechnology and bioengineering, 2007,97(4):922-932.

[16] 吳 芳,朱亞先,張 勇,等.利用發光細菌測試方法評價菲和芘生物降解過程的毒性變化 [J]. 生態毒理學報, 2014,9(3):445-452.

[17] Zhang Z X, Zhu Y X, Zhang Y. Simultaneous determination of 9-ethylphenanthrene, pyrene and 1-hydroxypyrene in an aqueous solution by synchronous fluorimetry using the double scans method and hydroxyl-propyl beta-cyclodextrin as a sensitizer [J]. Talanta, 2015,144:836-843.

[18] 張 勇,朱亞先,權改勁,等.同步熒光法檢測芘的微生物降解 [J]. 中國環境科學, 2002,22(4):289-292.

[19] Luo Y R, Kang S G, Kim S G, et al. Genome sequence of benzo (a)pyrene-degrading bacteriumUS6-1 [J], Journal of bacteriology, 2012,194(4):907-907.

[20] Yun S H, Choi C W, Lee S Y, et al. Proteomic characterization of plasmid pLA1for biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in the marine bacterium,US6-1 [J]. PloS one, 2014,9(3):e90812.

[21] Malmquist L M V, Selck H, J?rgensen K B, et al. Polycyclic aromatic acids are primary metabolites of alkyl-PAHs-a case study with nereis diversicolor [J]. Environmental science & technology, 2015,49(9):5713-5721.

[22] 俞 頔,崔志松,沈冰芳,等.生物降解作用對烷基萘異構體分布的影響及其控制因素 [J]. 地球化學, 2014,43(2):149-156.

[23] Wammer K H, Peters C A. Polycyclic aromatic hydrocarbon biodegradation rates: a structure-based study [J]. Environmental Science & Technology, 2005,39(8):2571-2578.

[24] Zhong Y, Zou S, Lin L, et al. Effects of pyrene and fluoranthene on the degradation characteristics of phenanthrene in the cometabolism process bysp. strain PheB4isolated from mangrove sediments [J]. Marine Pollution Bulletin, 2010, 60(11):2043-2049.

[25] Luan T G, Kei S H, Zhong Y, et al. Study of metabolites from the degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by bacterial consortium enriched from mangrove sediments [J]. Chemosphere, 2006,65(11):2289-2296.

[26] 劉 曄,牟伯中,劉洪來.烴的選擇性跨膜傳輸 [J]. 微生物學通報, 2006,33(22):63-67.

Effect of steric hindrance on the biodegradation of dissolved methyl-phenanthrene.

DU Lan1, ZHANG Zhen-xuan1, ZHU Ya-xian2, ZHANG Yong1*

(1.State Key Laboratory of Marine Environmental Science of China, College of Environment and Ecology, Xiamen University, Xiamen 361102, China；2.Department of Chemistry, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen University, Xiamen 361005, China).

The biodegradation of dissolved phenanthrene (Phe) and methyl-phenanthrene (MP), including1-MP, 3-MP, 4-MP and 9-MP by the bacteriumUS6-1was individually studied using synchronous fluorescence spectrometry. The biodegradation of MP was adequately described by zero-order kinetics at two concentrations, i.e., 8×10-7mol/L and 1.2×10-6mol/L. The rates of biodegradation were generally in the following order: 4-MP<9-MP<1-MP<3-MP. There was a good linear relationship between the measured maximum biodegradation rates and the theoretical maximum transmembrane fluxes. The addition of NaN3exerted little effects on the biodegradation of Phe but inhibited that of MP, with the degree of inhibition dependent on the position of the methyl substituent.

methyl-phenanthrene；isomer；biodegradation；membrane transport

X127

A

1000-6923(2017)04-1375-05

2016-08-23

國家自然科學基金資助項目(21177102,21577110);國家海洋局海洋溢油鑒別與損害評估技術重點實驗室開放基金資助項目(201405);高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(20130121130005)

杜 蘭(1991-),女,安徽銅陵人,廈門大學碩士研究生,從事PAHs生物降解研究.

* 責任作者, 教授, yzhang@xmu.edu.cn

, 2017,37(4)：1375~1379