鋅脅迫對土壤中微生物群落變化的影響

鄭 涵,田昕竹,王學東,劉 彬,孟 楠,何 俊,陳世寶*

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鋅脅迫對土壤中微生物群落變化的影響

鄭 涵1,田昕竹2,3,王學東2,劉 彬1,孟 楠1,何 俊2,陳世寶1*

(1.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所,農業部植物營養與肥料重點實驗室,北京 100081；2.首都師范大學資源環境與旅游學院,北京 100048；3.北京市環境影響評價評估中心,北京 100161)

采用多聚酶鏈式反應結合變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)測試方法,對我國5種典型鋅(Zn)污染土壤中的微生物進行了DGGE圖譜分析,并通過戴斯矩陣方法和B-C矩陣2種方法對不同處理土壤中微生物群落相似性進行了測定, 結合Vegan排序軸分析方法對Zn脅迫土壤中微生物結構及群落相似性與土壤性質間關系進行了研究.結果表明:Zn脅迫會引起土壤微生物數目和種類的降低,但并不是簡單的負相關.土壤中微生物的多樣性指數最大值出現在低濃度(200mg/kg處理)污染程度土壤中,說明Zn 在低污染脅迫下,一定程度上會促進微生物群落數量的增加,豐富了群落結構多樣性;高濃度(>800mg/kg)Zn脅迫對微生物群落結構有明顯抑制作用,不同處理土壤微生物Shannon指數下降范圍為5.14%(公主嶺黑土)~17.2%(杭州水稻土). 通過戴斯矩陣分析土壤中微生物群落相似性結果表明,隨著Zn濃度的增加,土壤中微生物群落相似性顯著下降,最大降低23.3%,說明土壤中Zn脅迫在一定程度上改變了土壤微生物的群落結構.對土壤中影響Zn脅迫與微生物群落結構變化影響因子的相關性分析結果表明,影響微生物群落結構的主要因子為pH值>OC>CEC.

鋅；PCR-DGGE；污染土壤；微生物群落結構；微生物多樣性

近年來我國農田土壤鋅(Zn)污染正以不同尺度的趨勢快速蔓延[1-5],資料顯示,我國Zn污染土壤超標率達0.9%.雖然我國最新頒布的食品安全標準中刪除了Zn的限量標準值[6],但由Zn污染產生的生態環境風險已引起廣泛關注.在土壤重金屬污染防治的研究中,利用植物作為生態物種而進行的毒性測定及其相關機理研究較多[7-12],而針對土壤微生物群落的研究相對較少.土壤微生物群落被認為是土壤生態系統變化的預警及敏感指標,土壤中微生物對重金屬污染脅迫產生的效應比同一環境中的植物和土壤動物更加敏感.Zn等重金屬在土壤中難以降解,一方面導致微生物生物量降低,使得微生物群落結構穩定性遭受破壞[13];另一方面降低微生物生物活性,甚至抑制微生物的生長和代謝[14].且土壤微生物多樣性會因其鋅含量超標而大幅度降低[15].目前,土壤中微生物毒性測試被認為是評價土壤環境質量非常有潛力的生態毒理學指標[16].隨著現代生物科技手段和分子技術水平的不斷發展,利用土壤環境中微生物的群落結構和多樣性變化作為受污染土壤毒理學測試指標已成為當前土壤環境科學研究的前沿領域之一[16-19].相對于傳統的微生物分離培養方法,直接從土壤中提取微生物總DNA,從分子水平上研究土壤微生物的種類和種群結構變化與環境質量變化間的耦合關系, 可以很好地避免傳統毒性測試方法在富集、培養、分離、研究的過程中造成微生物多樣性的丟失,能夠更全面、系統地認識土壤中微生物的多樣性與環境質量變化的關系[20-21].多聚酶鏈式反應結合變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)測試方法作為一種DNA指紋技術,其原理是使用一對特異性引物PCR,達到擴增微生物群體16S rDNA的目的,產生包含長度相同但序列有異的DNA片段混合物,再用DGGE技術分離產物混合物來進行微生物種群和結構變化的一種測試方法[19,21-23].目前,將PCR-DGGE技術應用于測定污染土壤中Zn毒性對微生物種類及種群結構變化的研究還鮮見報道.

本研究選取我國5種具有代表性質的農田表層土壤,添加不同濃度的Zn,經過180d的培養老化后,利用基于16SrDNA的PCR-DGGE指紋圖譜分析技術,對土壤中微生物群落結構進行測定,同時對Zn污染脅迫與土壤微生物結構多樣性產生的影響、土壤微生物群落結構多樣性和相似性的變化及其影響因子進行研究,以期為不同性質Zn污染土壤的毒理學評價提供基礎數據,同時為鋅污染土壤的生態風險評價和環境質量標準修訂提供參考.

1 材料與方法

1.1 土壤采集及制備

依據我國土壤pH值及有機碳分布頻率的地帶性特征,采集了我國5個典型地點的耕作層土壤樣品,分別為公主嶺、廣州、杭州、石家莊和海口,所有土樣風干后過2mm的尼龍篩進行土壤基本理化性質的測定[24],見表1.

表1 供試土壤的基本性質

土壤采取外源添加Zn處理,添加方法如下:配置ZnCl2(分析純)溶液,添加6個不同濃度梯度的Zn(mg/kg烘干土).分別為0、200、400、800、1600、2400mg/kg,每個Zn濃度3次重復,充分攪拌均勻,保持每種土壤的70%最大田間持水量(MWHC)平衡180d后,風干過2mm尼龍篩備用.PCR測試中樣品編號信息見表2.

表2 樣本編號

1.2 土壤中微生物的DGGE分析

1.2.1 土壤中DNA的提取[21]將不同處理的10-1~10-7土壤稀釋度懸液涂布于R2A培養基,25 ℃培養10d后,將這些經過不同稀釋度處理的培養基上的菌落,使用無菌水洗脫,并混合均勻.取1.5mL混合菌懸液,采用CTAB法提取土壤中微生物基因組DNA,保存于-20℃備用,每個稀釋度3次重復.

1.2.2 土壤樣品微生物的16SrDNA片段的PCR擴增[25]以樣品基因組DNA為模板,采用細菌通用引物338F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCGC- GGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和518R(5’-GTATT- ACCGCGGCTGCTGG-3’)擴增樣品16SrDNA高變區序列.

PCR擴增體系(50μL)為:10×PCR buffer5μL; dNTP(2.5mmol/L)3.2μL; rTaq(5U/μL)0.4μL; GC- 338F(20mmol/L)1μL; 518R(20mmol/L)1μL;模板DNA 50ng;補ddH2O至50μL.

PCR擴增程序為:94℃預變性5min;94℃變性1min,55℃復性45s,72℃延伸1min,30個循環;最終72℃延伸10min.PCR產物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit純化回收.

PCR儀為Biometra公司生產的T-gradient,凝膠成像儀為Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統.

1.2.3 PCR產物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析 取10μL PCR的產物進行變形梯度凝膠電泳(DGGE)分析.采用變形梯度為35%~55%、濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠(化學變性劑為100%尿素7mol/L 和40%的丙烯酰胺)在1xTAE 緩沖液中150V 60℃下電泳5h.

變形梯度凝膠電泳(DGGE)完畢后、采用銀染法染色、步驟如下:a)固定液(乙醇50mL、冰醋酸2.5mL、定容500mL)固定15min;b) Milli-Q純水清洗、20s和2min各一次; c)銀染液(硝酸銀1g、37%甲醛0.75mL、定容500mL)染色15min;d) Milli-Q純水清洗、20s和2min各一次; e)顯色液(氫氧化鈉7.5g、37%甲醛2.5mL、定容500mL)顯色5~7min;最后用終止液(乙醇50mL、冰醋酸2.5mL、定容500mL)終止反應.

1.3 主要電泳條帶的回收與測序

用滅菌的手術刀切下待回收DGGE條帶,采用OMEGA公司Poly-Gel DNA ExtractionKit回收目的條帶.以2μL回收產物為模板,338F/518R 為引物進行PCR擴增.

PCR 擴增體系(50μL)為:10×PCR buffer 5μL; dNTP(2.5mmol/L)3.2μL; rTaq(5U/μL)0.4μL; 338F (20mmol/L) 1μL;518R(20mmol/L)1μL;模板DNA 1μL;補ddH2O至50μL.PCR擴增程序為:94℃預變性4min;94℃變性30s,55℃復性30s,72℃延伸30s, 30個循環;最后,72℃延伸10min.

將重新擴增的DNA 片段切膠回收、純化后,連接到Pmd18-T載體上,并轉化至DH5α感受態細胞中,篩選陽性克隆,進行序列測定.

1.4 數據處理

細菌多樣性指數是研究群落物種數和個體數以及均勻度的綜合指標.根據電泳圖譜中樣品條帶數目及每個條帶的強度(灰度),對各樣品中細菌多樣性指數()、均勻度()和豐富度()等指標進行分析.DGGE 圖譜采用Quantityone軟件對每個樣品的電泳條帶數目、條帶密度進行數字化分析,香農指數()、豐度()和均衡指數()等指標被用來比較不同樣品的多樣性情況[25].其算法如下:

ln(1)

(2)

maxln(3)

式中:為樣品中單一條帶的強度在該樣品所有條帶總強度中所占的比率;為DGGE 圖譜單一泳道上所有條帶的豐度(%);為第條帶的豐度(%);是某樣品中所有條帶數目總和.

測序結果采用DNAstar和Cluster軟件進行序列分析,下載最相似的菌株序列作為系統發育樹的參考序列.采用MEGA 軟件,Neighbor-joining法構建系統發育樹,自展數(bootstrap)為1000.

主成分分析(PCA)采用Canoco軟件,根據DGGE條帶配對圖,在條帶出現的地方定義1,未出現的地方定義為0,得到二次矩陣并進行主成分分析.

Bray-Curtis矩陣計算由R語言Ecodist包完成.繪制熱圖(Heatmap)采用R語言pheatmap包完成.排序軸分析由R語言Vegan包完成.

2 結果與討論

2.1 土壤中Zn對微生物群落多樣性的影響

以GC-338F和518R為引物擴增16S rDNA序列、得到約200bp的DNA片段用于DGGE分析.DGGE圖譜上的條帶數量和位置反映了土壤中菌群的多樣性.從土壤微生物16S rDNA PCR產物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析圖譜(圖1)中可以看出,不同性質土壤中的微生物多樣性有明顯的差別;同一種土壤隨著土壤中Zn濃度的增加,條帶強度呈現先增加后減弱的趨勢,帶型也有區別,可見Zn污染脅迫對微生物群落結構有比較顯著地影響.例如公主嶺土壤Sample-2相對于Sample-1而言,條帶數目減少,Sample-3相對于Sample-1、2出現了一些新的菌群,某些條帶的強度有所增加,顯示有一些微生物表現出了較高的耐性.據報道,土壤在受到Zn、Pb脅迫后,對某些菌類如固氮菌、木霉等菌類起抑制作用,但有些耐性較強的菌類如大豆根瘤菌反而會比無污染和污染較輕的土壤數量多.研究表明[17,20,26],在土壤微生物發生明顯變化以前,整個微生物區系已經發生質的變化,無法適應的微生物種群數量下降,可以適應的微生物數量增加.理論上會有2種或2種以上更具耐性的物種來填補,從而豐富微生物系統.

表3 不同土壤中微生物多樣性指數(H’)

注 :相同列的不同字母表示差異顯著(<0.05).Cd(200mg/kg)、Cd(400mg/kg)、Cd(800mg/kg)、Cd(1600mg/kg) Cd(2400mg/kg)分別為Zn的6個不同濃度梯度,分別為0,200,400,800,1600, 2400mg/kg.

通過對不同土壤中微生物多樣性指數(表3)分析發現,隨著Zn濃度的逐漸增加,土壤中微生物多樣性指數總體呈下降趨勢,如杭州土壤(Sample- 7~12)中微生物多樣性指數在最高Zn濃度時由對照的3.61下降到2.99,海口的土壤也由3.55下降到3.34,其他地區的土壤都呈現出相同的規律,表明Zn脅迫對土壤中微生物多樣性有較強抑制;而在低濃度的時候各地區土壤微生物多樣性指數均有升高的現象,比如廣州水稻土的微生物多樣性指數在Zn濃度為200mg/kg時(Sample-14),由對照(Sample-13)的3.55升到3.82.表明土壤中低濃度(200mg/kg)Zn會增加微生物群落多樣性. 研究資料表明,土壤中重金屬的脅迫會改變細胞代謝和微生物的功能,引起微生物生存力和競爭力的變化[27],從而導致種群大小的改變.因此,重金屬脅迫會對微生物種群結構產生一定影響,但如果從微生物進化的角度及Zn作為生命必需元素來看,適當濃度的重金屬反而對增加物種多樣性,提高微生物的抗性有一定的積極作用.

表4 序列比對分析結果

對DGGE圖譜中的15個主要差異條帶進行回收測序,測序結果與Gen Bank中的序列進行比對,得到條帶所代表的細菌類型.每個回收條帶取3個克隆進行了序列測定,結果如表4,系統進化樹見圖2.由測序結果可知,大部分菌群為Proteobacteria變形菌門.

同時對土壤樣品進行主成分分析,得到結果如圖3.主成分分析可將不同土壤和對照分開,并且顯示出不同樣品之間的差異性.圖中除石家莊褐土的Sample-19~24土壤處理外,同一土壤的微生物均較好的分布在一起.PCA-1和PCA-2代表總變量的29.8%,顯示出不同樣品之間有著較大的變異,如PCA-1可將杭州、廣州及?？诘臉悠访黠@地區分開,說明土壤中的微生物由于不同地域土壤性質的區別而有較大差異.

2.2 不同Zn處理土壤中微生物群落相似性分析

在計算不同Zn處理土壤的樣本菌落結果相似度聚類分析時,通過間戴斯系數,得到各樣本之間的相似性矩陣,利用UPGMA算法構建聚類分析圖(圖4),比較樣本間的差異程度.

從樣本相似性計算結果來看,在聚類圖中,不同地區來源的樣本基本可以較好聚在一起,說明微生物群落分布具有地域性差別.同時,在同一種土壤中,隨著Zn濃度的增加,樣本的相似性下降,根據聚類分析圖,例如在杭州水稻土,Sample-10與Sample-12的相似性為95%, Sample-10與Sample-11的相似性只有59%,說明土壤中Zn脅迫顯著改變了土壤中微生物的群落結構.

2.3 土壤理化性質對土壤微生物群落結構的影響

針對影響土壤中微生物群落結構變化的土壤性質,本研究采用Vegan包做了排序軸分析.結果表明,最大坐標長度為1.83<3~4(圖5),因此該排序軸使用線性模型(PCA)較為合適,從圖5看出,土壤pH、CEC、OC3種主要性質在二維排序軸貢獻率約為60%.即可解釋影響微生物分布差的約60%變量因素,且樣本間距離分布符合樣本相似性的計算結果.從各因子貢獻率來看(表5),對樣本微生物多樣性影響最大的為pH值(CaCl2測定方法結果的影響略高于H2O測定方法),相關系數達到0.564,其次為OC(相關系數2= 0.503),再次為CEC(相關系數2=0.350),最后為Clay(相關系數2=0.214).可見不同地域土壤的理化因子對土壤中微生物群落結構有顯著影響.

表5 土壤中微生物群落結構與土壤性質的相關分析

當重金屬等污染物進入土壤后使得土壤中對污染物有耐性響應的物種變多,且微生物多樣性降低,群落結構發生實質性變化.盡管現代微生物群落分析技術各有其局限性及偏差,但在一定程度上依然存在對群落結構因污染影響發生的變化進行很好地測定[28].本文采用PCR-DGGE指紋圖譜分析方法,有效地對土壤中Zn污染脅迫與微生物種群結構的相關性進行了研究,因此利用PCR-DGGE指紋圖譜分析方法對不同土壤樣品中微生物多樣性組成及其變化預測土壤生態系統風險具有一定的理論意義.

3 結論

3.1 通過對不同性質Zn污染土壤中的微生物PCR-DGGE圖譜分析,表明Zn污染脅迫會引起土壤中微生物的數目和多樣性的變化.總體來說,低濃度(<200mg/kg)Zn處理會一定程度促進微生物群落數量的增加,豐富了群落結構多樣性;隨著Zn濃度的升高,微生物多樣性呈下降趨勢,群落結構趨于簡單.

3.2 通過戴斯矩陣方法和B-C矩陣方法比較土壤中微生物群落相似性,結果均表明不同地區來源的微生物群落分布基本在一起,說明微生物分布具有地域性差別.土壤中Zn脅迫明顯改變了微生物的群落結構.

3.3 土壤中Zn脅迫對微生物群落結構變化的相關性分析結果表明,影響土壤微生物群落結構的主要因子為pH>OC>CEC.

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Effects of Zn pollution on soil microbial community in field soils and its main influence factors.

ZHENG Han1, TIAN Xin-zhu2,3, WANG Xue-dong2, LIU Bin1, MENG Nan1, HE Jun2, CHEN Shi-bao1*

(1.Key Laboratory of Plant Nutrition and Fertilizer, Ministry of Agriculture, Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China；2.College of Resource Environment and Tourism, Capital Normal University, Beijing 100048, China；3.Beijing Environmental Impact Assessment Center, Beijing 100161, China).

The soil microbial structure and community of five different kinds of contaminated soil were determined using PCR-DGGE test method, the soil microbial community and microbial similarity was measured and compared using Des matrix analy sis and B-C matrix analysis and the relationship between Zn toxicity to soil microbial structure and soil properties was also analysed by using Vegan Sorting Axis analysis. Zn pollution could decrease the number and type of microbial in soil, while it was not a simply negative correlation. The maximum value of soil microorganisms diversity indices were observed at low Zn addition level (200mg/kg) in soils, which implied that application of low concentration Zn in soils would contribute to the increased number of soil microbial community and enrich the community structure diversity, however, with the increment of Zn in soils, the microbial community structure were restrained at high Zn concentrations, the Shannon index decreased 5.14% to 17.2% among the treatments, the minimum value (5.14%) was observed in black soil from Gongzhuling and the greatest reduction was found in the paddy soil from Hangzhou. The soil microbial similarity as determined by Des matrix and B-C matrix analysis decreased significantly with Zn addition in high concentration (>800mg/kg) in soils, with the maximum reduction of 23.3%, soil microbial community structure could be damaged after long time Zn stress in soils. Correlation analysis between the influencing factors of Zn stress and microbial community structure change in soils showed that the microbial community structure would be influenced by pH, followed by the OC, CEC in soils.

Zinc；PCR-DGGE；polluted soil；microbial community structure；soil microbial diversity

X171,X172

A

1000-6923(2017)04-1458-08

2016-08-26

國家支撐計劃課題(2015BAD05B03);國家重點研發計劃課題(2016YFD0800707);國家自然科學基金資助項目(41271490, 21077131)

鄭 涵(1993-),女,山東濰坊人,中國農業科學院碩士研究生,主要從事農田重金屬污染機制與修復研究.

* 責任作者, 研究員, chenshibao@caas.cn

, 2017,37(4)：1458~1465