乳腺浸潤性導管癌不同分子分型中CD90的表達及其意義

楊海玉，劉 勇，戴艷枝，吳曉霞，黃 桃，袁 晟

乳腺浸潤性導管癌不同分子分型中CD90的表達及其意義

楊海玉1,2，劉 勇2，戴艷枝2，吳曉霞3，黃 桃2，袁 晟2

目的 探討CD90在乳腺浸潤性導管癌中的表達及其與臨床病理特征、分子分型的相關性。方法 構建80例乳腺浸潤性導管癌和20例乳腺良性病變的組織芯片，采用免疫組化MaxVision法檢測乳腺不同病變組織中CD90、ER、PR、Ki-67和HER-2的表達水平，并進一步分析其相關性。結果 CD90在乳腺浸潤性導管癌和乳腺良性病變中的陽性率分別為62.5%和20.0%，兩者差異有統計學意義(P<0.001)；CD90表達與乳腺浸潤性導管癌淋巴結轉移相關(P<0.05)，與患者年齡、腫瘤大小、TNM分期及組織學分級無關(P>0.05)；在乳腺浸潤性導管癌不同分子亞型中，CD90陽性率以Luminal A型最低(40.0%)、三陰型最高(82.4%)，各亞型之間差異有統計學意義(P<0.05)；CD90與ER(r=-0.342，P<0.05)、PR(r=-0.374，P<0.05)表達呈負相關，與Ki-67表達之間無相關性(r=0.084，P>0.05)。結論 CD90表達與乳腺癌分子分型有關，其高表達提示患者預后不良。

乳腺腫瘤；CD90；分子分型；轉移；免疫組織化學

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性的生命健康。目前依據ER、PR、HER-2及Ki-67的表達狀況對乳腺癌進行分子分型，可將其分為Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達型及三陰型，且證實乳腺癌不同分子亞型的預后及轉移風險亦各不相同[1-2]。CD90又稱Thy-1，是一種相對分子質量為(2.5～3.7)×104的細胞膜表面糖蛋白，其主要作用是參與細胞之間以及細胞與基質之間的相互作用，從而參與調控多種生理過程。最近，有學者從一些腫瘤組織中(如食管癌、乳腺癌、肝癌等)分離出CD90陽性細胞，并證實這些細胞可表現腫瘤干細胞的主要特性，認為CD90有望成為惡性腫瘤治療的新靶點[3-5]。有文獻報道[6-7]CD90參與腫瘤微環境的分子調控機制，其表達與腫瘤預后相關。目前，尚未有CD90在不同分子亞型乳腺癌組織中的表達及其臨床意義的相關報道。本實驗采用免疫組化MaxVision法檢測乳腺癌組織中CD90、ER、PR、Ki-67和HER-2的表達，進一步探討其相關性及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2014年1月～2016年1月江西省人民醫院病理科資料齊全、診斷明確的女性乳腺浸潤性導管癌石蠟標本80例。按WHO(2012)乳腺腫瘤分類進行組織學分級，其中Ⅰ級14例，Ⅱ級46例，Ⅲ級20例；TNM分期依據2010年美國癌癥聯合委員會(AJCC)乳腺癌分期(第7版)：Ⅰ期17例，Ⅱ期42例，Ⅲ期21例；有淋巴結轉移49例，無淋巴結轉移31例。另選同期乳腺良性病變組織20例(乳腺纖維腺瘤12例、乳腺增生8例)作為對照。患者年齡23～71歲，平均46.4歲，術前均未行放、化療及免疫治療。

1.2 乳腺癌組織芯片制作 (1)芯片設計：按不同疾病種類設計組織樣品的排列方式；(2)根據設計對受體蠟塊進行打孔，其孔徑大小與供體組織鉆取孔徑大小一致；(3)對供體組織HE切片作形態學觀察，并在供體蠟塊上準確標記所需靶點；(4)利用打孔儀鉆取靶點組織，并轉移至受體蠟塊相應的孔位上，制成所需的陣列蠟塊；(5)4 μm厚切片，裱于載玻片上備用。

1.3 免疫組化 兔抗人CD90單克隆抗體購自Abcam公司(1 ∶200稀釋)；兔抗人ER、PR、Ki-67及HER-2單克隆抗體、免疫組化MaxVision檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新公司。將乳腺癌組織芯片切成4 μm厚切片，烤片30 min，具體操作參照試劑盒說明書進行，所有實驗均設置陰、陽性對照。高倍顯微鏡下觀察10個視野，計算陽性細胞百分比。

1.4 結果判讀及分子分型 CD90以細胞膜及細胞質呈棕黃色顆粒為陽性細胞，以陽性細胞所占百分比為判定標準[3]：無陽性細胞或陽性細胞<10%為(-)，10%～25%為(+)，26%～50%為()，>50%為()。ER和PR以細胞核呈棕黃色顆粒為陽性細胞，采用二級計分法[8]判讀。按陽性細胞數記分：陽性細胞<1%為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；按細胞染色強度記分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，黃色或深黃色為2分，黃褐色或棕褐色為3分；兩項積分相乘0分為(-)，1～3分為(+)，4～6分為()，7分及以上為()(<1分為陰性，≥1分為陽性)。Ki-67以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性細胞，根據2011年乳腺癌St．Gallen共識[9]，將Ki-67<14%定為陰性，Ki-67≥14%定為陽性。HER-2蛋白呈細胞膜著色，根據2014版乳腺癌HER-2檢測指南[10]分為4級(0～3+)：0～1+判為HER-2陰性，3+判為HER-2陽性；HER-2檢測2+者另行FISH檢測，HER-2基因擴增判為HER-2陽性，否則為HER-2陰性。免疫組化結果判定由兩名高年資病理醫師共同審核。

乳腺癌分子分型依據2011年St．Gallen乳腺癌國際會議專家共識[9]，分為：(1)Luminal A型：ER和(或)PR陽性、HER-2陰性以及Ki-67≤14%；(2)Luminal B型：ER和(或)PR陽性、HER-2陽性或HER-2陰性，但Ki-67>14%；(3)HER-2過表達型：ER陰性、PR陰性、HER-2陽性；(4)三陰型：ER、PR和HER-2均陰性。

1.5 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，各組間CD90的陽性差異及其與乳腺癌臨床病理特征之間的關系采用χ2檢驗，CD90與ER、PR、Ki-67表達的相關性采用Spearman秩相關檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD90在不同乳腺病變組織中的表達 CD90陽性細胞主要表達于乳腺癌間質組織中，且多圍繞腫瘤細胞排列(圖1、2)。CD90在乳腺浸潤性導管癌中的陽性率為62.5%，明顯高于乳腺良性病變組織(20.0%，其中乳腺纖維腺瘤陽性3例、乳腺增生陽性1例)，兩者之間差異有統計學意義(P<0.001，表1)。

①②

圖1 CD90在乳腺良性病變(乳腺纖維腺瘤)中的表達，MaxVision法

圖2 CD90在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達，MaxVision法

表1 CD90在不同乳腺病變組織中的表達

2.2 CD90表達與乳腺癌臨床病理特征的關系 乳腺癌淋巴結轉移組中CD90表達明顯高于無淋巴結轉移組(77.4%vs53.1%)，其差異有統計學意義(P<0.05)；CD90表達水平與患者年齡、腫瘤直徑均無相關性(P>0.05)。另外，晚期病例(Ⅲ期)中CD90陽性率高于早期病例(Ⅰ+Ⅱ期)，高級別病例(Ⅲ級)中CD90陽性率明顯高于低級別病例(Ⅰ+Ⅱ級)，但差異均無統計學意義(P>0.05，表2)。

2.3 CD90在乳腺浸潤性導管癌不同分子亞型中的表達 在乳腺浸潤性導管癌不同分子亞型中，CD90陽性率以Luminal A型最低(40.0%)、三陰型最高(82.4%)，各亞型之間的表達差異有統計學意義(P<0.05)。進一步分析證實，CD90表達在Luminal A型與Luminal B型(HER-2陰性)之間差異無統計學意義(P>0.05)；在Luminal B型中，HER-2陽性組CD90表達明顯高于HER-2陰性組(71.4%vs43.5%)，其差異有統計學意義(P<0.05)；CD90在Luminal B型(HER-2陽性)、HER-2過表達型及三陰型中的表達明顯高于Luminal A型和Luminal B型(HER-2陰性)，但前三者之間差異無統計學意義(P>0.05，表3)。

表2 CD90表達與乳腺浸潤性導管癌臨床病理特征的關系

表3 CD90在乳腺浸潤性導管癌不同分子亞型中的表達

2.4 CD90與ER、PR、Ki-67表達的相關性 Spearman相關分析顯示，CD90與ER、PR表達之間呈明顯負相關(P<0.05)，但與Ki-67表達無相關性(P>0.05，表4)。

3 討論

腫瘤干細胞是一組具有自我更新、增殖及分化能力的腫瘤細胞。越來越多的研究證實，腫瘤干細胞在乳腺癌的發生、發展及轉移過程中起關鍵作用。研究表明CD90是腫瘤干細胞的主要標志物，并且涉及多種腫瘤的發生、發展過程[7]。Lobba等[11]分別檢測4株乳腺癌細胞(MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435和Hs578-T)及1株正常乳腺細胞表面標志物的表達，證實CD90在惡性細胞株中高表達，并且與乳腺癌細胞株表現不同程度的侵襲和轉移潛能相關。本組實驗證實CD90蛋白在乳腺浸潤性導管癌中的表達高于乳腺良性病變，提示CD90可能在乳腺癌發生過程中起一定的作用。研究進一步證實，CD90表達與乳腺癌發生淋巴結轉移明顯相關，且其在晚期及高級別病例中的表達高于早期及低級別病例，提示CD90高表達可能是預測乳腺癌高轉移風險或預后不良的重要指標。本實驗還發現CD90陽性細胞主要表達于乳腺癌間質組織中，且多圍繞腫瘤細胞排列，該結果與Zhu等[12]在胰腺癌中的發現一致[12]，由此推測CD90可能涉及腫瘤細胞與間質之間的相互作用，進而參與腫瘤的發生、發展過程。

近年來，國內外學者對乳腺癌轉移與其分子分型的關系進行深入分析，證實不同分子亞型乳腺癌其轉移風險及預后各不相同。研究表明Luminal型乳腺癌是臨床最常見的乳腺癌分子亞型，占乳腺癌總數的65%～70%，其中ER和(或)PR陽性患者發生遠處轉移的風險低于陰性患者，其5～10年生存率也顯著高于后者[13-14]。另外，有研究證實三陰型乳腺癌發生遠處轉移的風險明顯高于其他亞型[1]，且預后較差。本組通過分析CD90表達與乳腺癌分子亞型的關系，證實CD90在三陰型乳腺癌中表達最高，而在Luminal A型中表達最低，其表達趨勢與不同分子亞型乳腺癌轉移風險的報道基本一致。有文獻[5,15]證實CD90通過與其細胞受體直接結合，進而調節腫瘤細胞與微環境之間的相互作用，并進一步活化Src和NF-κB信號通路，促進各種細胞因子分泌以維持腫瘤干細胞狀態。本組CD90陽性細胞主要表達于乳腺癌間質組織中，且多圍繞腫瘤細胞排列，提示CD90涉及腫瘤細胞與間質之間的相互作用過程。由此推測，不同分子亞型乳腺癌具有不同的轉移調控機制，而CD90可能是其中的關鍵調控分子。

表4 乳腺浸潤性導管癌中CD90與ER、PR及Ki-67表達的相關性

本實驗證實CD90表達與乳腺浸潤性導管癌的免疫表型存在相關性。首先，CD90與ER、PR表達呈明顯負相關，提示CD90表達越高，則ER、PR表達越低。ER、PR是判斷乳腺癌內分泌治療療效的重要指標，其表達水平越高，提示治療效果越好。由此推測，CD90高表達可能成為反映乳腺癌內分泌治療反應差的間接指標。近年來，針對HER-2陽性的乳腺癌分子靶向治療取得了重大進展，現已成為有效治療乳腺癌的重要手段。研究證實25%～30%的乳腺癌表現HER-2基因擴增和過表達，并且是判斷乳腺癌預后不良的重要指標。研究證實25%～30%的乳腺癌表現HER-2基因擴增和過表達，并且是判斷乳腺癌預后不良的重要指標[16]。本組結果顯示CD90在HER-2過表達型以及Luminal B型(HER-2陽性)乳腺浸潤性導管癌中高表達，提示CD90可能成為乳腺癌分子靶向治療的有效標志之一，但仍需要進一步的臨床數據驗證，CD90與HER-2之間的關系也有待探討。

綜上所述，CD90在乳腺癌發生、發展過程中可能發揮重要作用，其高表達提示預后不良。檢測CD90的表達狀況，對乳腺癌的診斷和治療有重要的臨床參考價值，同時也為探索乳腺癌發病機制及尋找新的治療靶點提供實驗依據。

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Expression of CD90 and its clinical significance in different molecular subtypes of breast invasive ductal carcinoma

YANG Hai-yu1,2, LIU Yong2, DAI Yan-zhi2, WU Xiao-xia3, HUANG Tao2, YUAN Sheng2

(1InstituteofClinicalMedicialSciences,2DepartmentofPathology,3DepartmentofPhysicalExamination,JiangxiProvincePeople’sHospital,Nanchang330006,China)

Purpose To detect the expression of CD90 in invasive ductal breast carcinoma w ith different molecular subtypes and to explore its clinical significance. Methods The expression of CD90, ER, PR, Ki-67 and HER-2 were detected in 80 cases of invasive ductal breast carcinoma tissue and 20 cases of breast benign lesion with immunohistochemical method. The relationship between CD90 and clinicopathological parameters were analyzed. Results The positive expression rate of CD90 in invasive ductal breast carcinoma and breast benign lesion tissues were 62.5% and 20.0%, respectively (P<0.001). The expression of CD90 in invasive ductal breast carcinoma was correlated with lymph node metastasis (P<0.05), but not with age, tumor size, TNM staging and histological grade (P>0.05). Among different molecular subtypes, CD90 expression level in Luminal A type was the lowest (40.0%), and the level in triple negative type was the highest (82.4%) (P<0.05). CD90 expression level was negatively correlated with ER (r=-0.342,P<0.05) or PR (r=-0.374,P<0.05) expression level, but not with Ki-67 (r=0.084,P>0.05). Conclusion The over-expression of CD90 is related with molecular subtypes of breast carcinoma, and its high expression suggests a poor prognosis.

breast neoplasm； CD90； molecular subtyping； metastasis； immunohistochemistry

時間：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.003.html

江西省衛生廳科技計劃(20143006)

江西省人民醫院1臨床醫學研究所、2病理科、3體檢科，南昌 330006

楊海玉，女，博士，副主任醫師。E-mail: yanghaiyu@yahoo.com 劉 勇，男，主任醫師，通訊作者。E-mail: jxpathology@126.com

R 737.9

A

1001-7399(2017)03-0245-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.003

接受日期：2017-01-09