142例惡性胸水細胞蠟塊的免疫組化檢測及分子病理檢測

隋燕霞，柳 雨，蔣 娜，蔣伊娜，張冠軍

142例惡性胸水細胞蠟塊的免疫組化檢測及分子病理檢測

隋燕霞，柳 雨，蔣 娜，蔣伊娜，張冠軍

目的 探討細胞蠟塊結合免疫組化在惡性胸水的診斷及鑒別診斷中的作用，并分析胸水細胞蠟塊在肺腺癌分子病理檢測中的作用。方法 回顧性分析142例惡性胸水的液基細胞學、細胞蠟塊HE染色以及免疫組化EnVision兩步法染色，并結合細胞形態抗體的表達情況對惡性胸水進行腫瘤分類。采用ARMS-PCR法對其中40例經免疫組化EnVision染色確診為肺腺癌的胸水細胞蠟塊，進行表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變檢測。結果 142例胸水細胞蠟塊經免疫組化染色證實肺腺癌99例，肺小細胞癌4例，肺鱗狀細胞癌3例，乳腺癌13例，卵巢癌9例，胃癌 2例，甲狀腺癌1例，子宮內膜癌1例，間皮瘤5例，淋巴瘤3例，惡性黑色素瘤1例，滑膜肉瘤1例。40例肺腺癌中EGFR 基因突變20例，其中19del突變9例，L858R突變11例。結論 惡性胸水細胞蠟塊行免疫組化檢測不僅有助于腫瘤的明確診斷，更有助于對腫瘤進行分類并判斷腫瘤原發部位及幫助判斷預后。利用胸水細胞蠟塊可以對肺腺癌進行EGFR基因突變的檢測，為肺腺癌的基因檢測提供新型的標本來源。

胸水；細胞蠟塊；免疫組織化學；基因突變

胸水是許多疾病的常見臨床表現，其性質的判斷對臨床診斷及治療具有重要意義。胸水細胞學檢查具有損傷小、方法簡易等特點，目前傳統的細胞學檢查既無法對胸水樣本長期保存，也未能對臨床提供更多的有效信息[1]。本文現采用細胞蠟塊技術，探討細胞蠟塊結合免疫組化EnVision兩步法染色在胸水診斷中的應用。同時對經免疫組化EnVision兩步法確診為肺腺癌的部分病例進行表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變檢測，從而為臨床靶向藥物的篩選提供新型的標本來源。

1 材料與方法

1.1 材料 收集西安交通大學第一附屬醫院病理科2015年1月～2016年6月確診為惡性胸水142例，其中男性58例，女性84例，男女比為1 ∶1.45，年齡27～99歲，平均(60.98±12.12)歲。

1.2 方法

1.2.1 液基細胞學 使用廣州安必平液基細胞沉降式制片染色機，按試劑盒操作步驟進行制片，巴氏染色，閱片。

1.2.2 細胞蠟塊的制作 取液基制片后剩余胸水放入50 mL離心管中，離心機2 000 r/min，離心5 min，棄上清，如果沉淀物不夠可反復離心收集(血性標本先加入3%醋酸乙醇10 mL，振蕩均勻，2 000 r/min，離心5 min，去除血細胞干擾)；向沉淀物中加入10%中性福爾馬林5 mL，振蕩，2 000 r/min，離心5 min，棄上清；向沉淀物中加入95%乙醇10 mL，振蕩，2 000 r/min，離心10 min，棄上清液；底部沉淀鑷取至擦鏡紙上，包好，與常規組織一起行脫水處理，制成細胞蠟塊。

1.2.3 免疫組化 用細胞蠟塊制作3 μm厚切片，免疫組化采用EnVision兩步法，具體步驟按試劑盒說明書進行染色。一抗選用CK、vimentin、CEA、CK7、Napsin A、TTF-1、p40、CK5/6、p63、Calretinin、WT-1、MC、D2-40、CD56、CgA、Syn、CA125、Pax-8、p16、CK20、Villin、CDX2、GCDFP-15、Mammaglobin、ER、PR、HER-2、CD45、CD20、CD79a、CD3、CD43、HMB-45、Melan-A、S-100、CK19、Galectin-3、TG、EMA、desmin、p53、Ki-67等進行檢測；抗體及工作液均購自福州邁新公司。

1.2.4 ARMS-PCR法 細胞蠟塊標本切片10 μm厚，數量≥10 張，將切片用鑷子轉移至潔凈的1.5 mL離心管中。應用廈門艾德公司的石蠟包埋組織樣品DNA提取試劑盒，按試劑盒說明書進行DNA提取，DNA樣本經Nano Drop 2000分光光度計(美國Thermo Scientific 公司)定量，并調節終濃度為2 ng/μL。應用ARMS法對提取的DNA進行EGFR基因突變檢測，具體步驟按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 惡性胸水的腫瘤細胞來源及肺腺癌的基因突變 142例胸水細胞蠟塊經免疫組化EnVision兩步法染色證實肺腺癌99例，肺小細胞癌4例，肺鱗狀細胞癌3例，乳腺癌13例，卵巢癌9例，胃癌 2例，甲狀腺癌1例，子宮內膜癌1例，間皮瘤5例，淋巴瘤3例，惡性黑色素瘤1例，滑膜肉瘤1例(表1)。40例肺腺癌中EGFR 基因突變20例，其中19del突變9例，L858R突變11例。

表1 胸水細胞蠟塊免疫組化的分型診斷結果(n=142)

2.2 液基制片觀察 液基細胞巴氏染色結果以腺癌多見，其中最常見的是肺腺癌，癌細胞常聚集成團，分化差時可散在分布，核質比增大，核異形，核仁明顯，胞質內可見黏液空泡(圖1A)；另外較常見的腺癌有乳腺癌和卵巢癌，乳腺癌細胞黏附性強，常形成大小不同的圓形、卵圓形三維細胞團，團內細胞可相互重疊，大小較一致(圖1B)；卵巢癌常形成大量的細胞團，三維立體感強，可有黏液空泡。少見腫瘤有肺小細胞癌、肺鱗狀細胞癌、胃癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌、間皮瘤、淋巴瘤以及其他軟組織腫瘤。小細胞癌細胞體積小，可成堆或成團排列，鑲嵌特征明顯，并常見單個細胞呈列兵式排列，胞質稀少或缺如，核形不規則深染，核分裂象易見；鱗狀細胞癌細胞異形性明顯，散在分布，胞質豐富，核異形明顯，可見巨核細胞，核染色質粗糙、深染；胃癌、甲狀腺癌、子宮內膜癌液基細胞學均為不同分化程度的腺癌特點，即常聚集成團，核質比增大，核異形，核仁明顯，胞質內可見黏液空泡；間皮瘤細胞由一系列的間皮細胞構成，細胞可呈團排列，細胞團邊緣呈桑葚狀或結節狀，細胞較腺癌異形性小，核居中，胞質核周濃染，邊緣較淡；淋巴瘤細胞小而一致，呈圓形或卵圓形，胞質稀少，核染色質顆粒狀；惡性黑色素瘤細胞呈圓形、卵圓形及不規則形，細胞異形性明顯，核不規則，可見八字形細胞核，核仁明顯，細胞質內可見黑色素顆粒；滑膜肉瘤細胞大小形態多樣，可見梭形細胞，異形明顯，核染色質粗糙，核分裂象多見。

2.3 細胞蠟塊切片觀察 細胞蠟塊切片HE染色鏡下觀察，切片背景干凈，染色對比清晰，細胞數明顯增多。腺癌的細胞蠟塊切片不僅具有癌細胞的形態學特點，還可以觀察類似組織學的排列方式及結構，如腺狀、乳頭狀、梁索狀、巢團狀結構等(圖2)。肺小細胞癌、鱗狀細胞癌、間皮瘤、淋巴瘤及其他軟組織腫瘤形態上與相應的組織學相似。

2.4 細胞蠟塊結合免疫組化進行分型診斷 142例胸水細胞蠟塊經免疫組化染色證實肺腺癌99例，免疫組化通常CK7、Napsin A(圖3A)和TTF-1均呈陽性；乳腺癌13例，免疫組化標記CK7、GCDFP-15、Mammaglobin均呈陽性，不同程度表達ER (圖3B)、PR、HER-2；卵巢癌9例，免疫組化標記CK7、CA125、Pax-8、WT-1均呈陽性，不同程度表達ER、PR、p16；肺小細胞癌4例，免疫組化標記TTF-1、CD56、Syn、CgA均呈陽性；肺鱗狀細胞癌3例，免疫組化標記CK、p40、CK5/6、p63均呈陽性；胃癌2例，免疫組化標記CK20、Villin、CDX2均呈陽性；甲狀腺癌1例，免疫組化標記CK19、Galectin-3、TG、TTF-1均呈陽性；子宮內膜癌1例，免疫組化標記CK7、ER、PR均呈陽性；間皮瘤5例，免疫組化標記CK5/6、WT-1、D2-40、CR、MC、EMA、p53均呈陽性；B細胞淋巴瘤3例，免疫組化標記vimentin、CD45、CD20、CD79a均呈陽性；惡性黑色素瘤1例，免疫組化標記vimentin、HMB-45、Melan-A、S-100均呈陽性；滑膜肉瘤1例，免疫組化標記CK、EMA、vimentin、Calretinin不同程度陽性表達。

2.5 應用細胞蠟塊進行肺腺癌EGFR基因突變檢測 40例肺腺癌胸水細胞蠟塊中EGFR基因突變20例(圖4)，其中19del突變9例，L858R突變11例，其余20例未見EGFR基因突變。

3 討論

胸水是許多疾病，尤其是惡性腫瘤的常見臨床表現。雖然胸水細胞學檢查具有快速、簡單、標本易于采集等優點，但傳統的細胞學涂片及胸水液基細胞學涂片檢查標本難以長期保存，對惡性胸水無法行進一步檢測等缺點，使傳統胸水細胞學診斷具有一定的局限性，診斷水平停留在“找見腫瘤細胞”或“未找見腫瘤細胞”。細胞蠟塊包埋技術在國外許多國家已成為細胞學常規診斷技術[2]，而在國內應用有限，僅在一些大型醫院的病理科開展。本文回顧性分析我院確診為惡性胸水細胞蠟塊142例，對液基細胞學巴氏染色與細胞蠟塊HE染色進行對比，發現細胞蠟塊的腫瘤細胞數量多，細胞結構清晰，并能保持一定的組織學結構和排列方式，HE染色也更接近組織學特點，有利于細胞學的診斷，從而提高細胞學診斷的靈敏度和準確性[3]。

①A①B②A②B③A③B

圖1 A.肺腺癌細胞聚集成團或散在分布，核質比增大，核異形，核仁明顯，胞質內可見黏液空泡，巴氏染色；B.乳腺癌癌細胞形成大小不等的圓形、卵圓形三維細胞團，細胞大小較一致，巴氏染色 圖2 A.肺腺癌細胞蠟塊切片可見腺樣及乳頭狀結構；B.乳腺癌細胞蠟塊切片癌細胞呈巢團狀結構，其內可見小的腺腔形成 圖3 A.肺腺癌Napsin A癌細胞胞質陽性，EnVision兩步法；B.乳腺癌ER癌細胞胞核陽性，EnVision兩步法

圖4 內控(A)、外控(B)信號均升起，表明檢測體系正常；可見EGFR基因突變信號

細胞蠟塊的最大優點是可以連續切片，并可以行免疫組化染色以滿足診斷需要，提高診斷的準確性，幫助判斷腫瘤細胞的原發部位[4-5]。隨著細胞學技術的迅速發展，免疫組化染色已逐步應用于細胞學的診斷中，但免疫組化標志物種類繁多，其敏感性和特異性各異，因此要求細胞學診斷醫師能夠熟練掌握各種腫瘤細胞與間皮細胞免疫標志物的表達特點，對胸水細胞學作出精確的診斷，確定腫瘤類型為臨床提供治療依據[6]。大量數據表明轉移性腺癌是胸水中最常見的惡性腫瘤，包括肺腺癌、乳腺癌、卵巢癌等，其中以肺腺癌最常見[7]。轉移性腺癌細胞和胸水中的反應性增生間皮細胞、間皮瘤細胞的形態也有不少相似之處，因此器官特異性抗體的應用為確定診斷以及判斷腫瘤的來源提供較大的幫助。Napsin A、TTF-1在肺腺癌細胞中表達，聯合兩者是肺腺癌較為可靠的標志物[8]；聯合應用p40、p63是鱗狀細胞癌較為可靠的標志物；聯合應用CD56、CgA、Syn是小細胞癌較為可靠的標志物；聯合應用Mammaglobin、ER、PR是乳腺癌較為可靠的標志物；CA125是卵巢癌較為可靠的標志物；聯合應用Calretinin、WT-1、MC、D2-40是間皮細胞較為可靠的標志物。然而具有異型性的間皮細胞是反應性增生還是惡性間皮瘤，需使用EMA、desmin、p53和Ki-67加以鑒別，惡性間皮瘤細胞EMA呈強陽性，而在反應性間皮細胞中為灶狀弱陽性，反應性增生的間皮細胞中desmin呈陽性，而在惡性間皮瘤細胞中呈陰性，p53陽性率大于50%，Ki-67大于20%提示惡性間皮瘤細胞[9]。少見腫瘤的免疫組化根據細胞學特點與特異性免疫組化標志物的表達情況進行確定。本組142例惡性胸水細胞蠟塊的免疫組化結果：肺腺癌99例，肺小細胞癌4例，肺鱗狀細胞癌3例，乳腺癌13例，卵巢癌9例，胃癌 2例，甲狀腺癌1例，子宮內膜癌1例，間皮瘤5例，淋巴瘤3例，惡性黑色素瘤1例，滑膜肉瘤1例；其結果與文獻報道一致。

EGFR是跨細胞膜糖蛋白，屬于受體型酪氨酸激酶，其信號通路在細胞的生長、增殖和分化等過程中發揮重要的調節作用。EGFR基因在多種腫瘤中存在過表達或突變，從而調節腫瘤的生長、侵襲、轉移和血管生成[10]。EGFR被認為是最有效的肺腺癌治療靶點之一。目前，雖然肺腺癌的靶向治療已經進入規范化階段，新的靶向藥物不斷出現，但EGFR依然是靶向治療前的必檢基因[11-12]。臨床上用于EGFR檢測的標本大多來自于手術切除標本或活檢標本，但對于已經失去手術機會的晚期肺癌患者或者活檢標本不易獲取的肺癌患者，胸腔積液就成為進行EGFR檢測重要的標本來源。胸水細胞蠟塊中腫瘤細胞富集，是EGFR檢測的一種新型標本[13]。EGFR突變通常發生于18～21號外顯子，其中19del缺失及 L858R突變最常見。文獻報道在西方國家，非小細胞肺癌患者EGFR基因突變發生率為10%～15%，而亞洲國家發生率高達30%～40%。EGFR突變在年輕女性和不吸煙者患者中更為常見[14-15]。本組40例肺腺癌胸水細胞蠟塊中EGFR基因突變20例，其中19del突變9例，L858R突變11例，與文獻報道基本一致。

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Immunohistochemical detection and molecular pathological examination of 142 cases of malignant pleural effusion

SUI Yan-xia, LIU Yu, JIANG Na, JIANG Yi-na, ZHANG Guan-jun

(DepartmentsofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofxi’anJiaotongUniversity,xi’an710061,China)

Purpose To explore the role of cell blocks combined with immunohistochemical examination in the diagnosis and differential diagnosis of malignant pleural effusion, and to explore the role of pleural effusion cell blocks in lung adenocarcinoma molecular pathology examination. Methods 142 cases of malignant pleural effusion based cytology, cell blocks of HE staining and immunohistochemical staining by EnVision two-step were retrospectively analysed, the tumor classification was made through analyzing the characteristics of the cells combined with antibody expression. The detection of epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutation of 40 cases of lung adenocarcinoma diagnosed after immunohistochemical staining were used by ARMS-PCR method. Results Among 142 cases of malignant pleural effusion, there were 99 cases caused by lung adenocarcinoma, 4 cases of lung small cell carcinoma, 3 cases of lung squamous cell carcinoma, 13 cases of breast carcinoma, 9 cases of ovarian carcinoma, 2 cases of gastric carcinoma, 1 case of thyroid carcinoma, 1 case of endometrial carcinoma, 5 cases of mesothelioma, 3 cases of lymphoma, 1 case of malignant melanoma, 1 case of synovial sarcoma. In 40 cases of lung adenocarcinoma pleural effusion cell block, there were 20 cases with EGFR mutations, 9 cases of 19del mutations and 11 cases L858R mutations. Conclusion The pleural effusion cell blocks combined immunohistochemistry are useful to improve the accuracy of diagnosis of patients with pleural effusion, and helpful for the determination of classification and the primary site of tumor, assessment of prognosis. Pleural dffusion cell block may used to detect EGFR mutations of lung adenocarcinoma, which provide new source of specimen for the gene detection of lung adenocarcinoma.

pleural effusion；cell blocks；immunohistochemistry； mutation

時間：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.013.html

陜西省社會發展科技攻關(2016SF-174)

西安交通大學第一附屬醫院病理科，西安 710061

隋燕霞，女，碩士，主治醫師。E-mail: suiyanxi029@163.com

R 734.2

A

1001-7399(2017)03-0292-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.013

接受日期：2017-01-14