結直腸癌中Survivin、Caspase 9和Ki-67表達的相關性及臨床意義

趙 巖，孫 健，吳 影，王志強

結直腸癌中Survivin、Caspase 9和Ki-67表達的相關性及臨床意義

趙 巖1，孫 健2，吳 影3，王志強1

目的 探討Survivin、Caspase 9和Ki-67三種腫瘤相關因子在結直腸癌中表達的相關性。方法 采用免疫組化EliVision法檢測50例結直腸癌、30例結直腸腺瘤和30例癌旁正常組織中Survivin、Caspase 9和Ki-67的表達，并分析三者與結直腸癌臨床病理特征的關系。結果 Survivin和Ki-67在結直腸癌組織中的陽性率高于結直腸腺瘤和癌旁正常組織；而Caspase 9陽性率低于結直腸腺瘤和癌旁正常組織。Survivin與Caspase 9的表達呈負相關，與Ki-67表達呈正相關；Caspase 9與Ki-67的表達呈負相關。Survivin、Ki-67、Caspase 9的表達與結直腸癌分化程度、淋巴結轉移及Dukes分期相關(P<0.05)。結論 Survivin可能通過抑制Caspase 9的激活，使細胞不能進行有效凋亡并異常增殖，從而促進結直腸癌的發生、發展。聯合檢測有助于了解結直腸腫瘤的生物學行為并對患者早期診斷、預后判斷及干預治療提供分子生物學支持。

結直腸腫瘤；Survivin；Caspase 9；Ki-67；免疫組織化學

結直腸癌是發生在結直腸黏膜上皮和腺體的惡性腫瘤，包括結腸癌和直腸癌。隨著動物高蛋白在人們飲食結構中的比重增加，我國結直腸癌患者數量逐年遞增。現代醫學研究證明，惡性腫瘤的發生、發展與腫瘤細胞異常增殖、異常分化及細胞凋亡障礙密切相關，細胞凋亡機制異常是惡性腫瘤發生的重要原因之一，因此研究細胞凋亡與腫瘤的關系，已經成為腫瘤學研究的熱點。Survivin、Caspase 9的表達均與結直腸癌的發生、發展有關，且兩者在調控細胞凋亡方面存在關聯。Ki-67是反映細胞增殖的重要生物學指標。本文采用免疫組化法檢測Survivin、Caspase 9和Ki-67在結直腸癌組織中的表達并分析三者表達的相關性，希望從分子水平更深入了解結直腸癌的生物學發生機制，探討它們與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、分化程度和Dukes分期等臨床病理因素的關系，為患者早期診斷、干預治療和判斷預后提供分子生物學支持。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2014年9月～2016年7月牡丹江醫學院紅旗醫院病理科存檔的結直腸癌手術切除標本50例，所有標本相關臨床資料完整，患者術前均未接受任何抗腫瘤治療。其中男性32例，女性18例，年齡29～84歲，平均61.98歲，中位年齡61歲；高分化腺癌11例，中分化腺癌26例，低分化腺癌13例；根據Dukes分期：A+B期27例，C+D期23例；有淋巴結轉移者23例，無淋巴結轉移者27例。取同時期30例結直腸腺瘤手術存檔蠟塊和30例癌旁>5 cm正常結直腸組織病理蠟塊作為對照。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗人Survivin多克隆抗體和鼠抗人Ki-67核抗原單克隆抗體均購自福州邁新公司。兔抗人Caspase 9多克隆抗體購自美國Abcam公司。DAB顯色試劑盒和免疫組化EliVision Super/HRP檢測試劑盒購自福州邁新公司。使用儀器有顯微鏡、切片機、烤箱、染色缸、孵育盒、高壓鍋。

1.3 方法 免疫組化染色采用EliVision法，取存檔的組織蠟塊，行HE和免疫組化染色。用已知的陽性切片作為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判定 由兩位高年資病理醫師采用雙盲法分別獨立閱片。在光鏡下觀察陽性細胞呈棕褐色細顆粒狀。Caspase 9定位于細胞核和細胞質，Ki-67定位于細胞核，Survivin定位表達于細胞核或細胞質。根據國內常用標準，即腫瘤細胞的陽性數及其染色反應的強度進行判定。染色強度：無陽性著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。采用高倍視野隨機計數100個腫瘤細胞所占的比例，定位5級，未見陽性表達或陽性細胞數<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項得分結果相加：4～7分為陽性，0～3分為陰性。

1.5 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件分別對計數資料進行χ2檢驗；兩變量間關系采用Spearman相關性分析。檢驗水準α=0.05,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Survivin、Caspase 9和Ki-67在結直腸癌、結直腸腺瘤、正常結直腸組織中的表達(表1) Survivin蛋白定位于細胞質或細胞核(圖1)。Survivin在結直腸癌中的陽性率明顯高于結直腸腺瘤和正常結直腸組織，差異有統計學意義(P<0.05)。Caspase 9主要定位于細胞質，胞核也有表達，呈棕黃色灶性或彌漫性分布(圖2)。Caspase 9在結直腸癌中的陽性率低于結直腸腺瘤和正常結直腸組織，差異具有統計學意義(P<0.05)。Ki-67定位于細胞核(圖3)，Ki-67在結直腸癌中的陽性率高于結直腸腺瘤和正常結直腸組織，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2 結直腸癌中Survivin、Caspase 9和Ki-67表達的相關性 結直腸癌中Survivin和Caspase 9的表達呈負相關(r=-0.362，P=0.010，表2)。Survivin和Ki-67的表達呈正相關(r=0.398，P=0.004，表3)。Caspase 9與Ki-67的表達呈負相關(r=-0.400，P=0.004，表4)。

2.3 Survivin、Caspase 9和Ki-67蛋白表達與結直腸癌臨床病理因素的關系 Survivin、Caspase 9和Ki-67表達與結直腸癌患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小和浸潤深度無相關性(P>0.05)。Survivin、Caspase 9和Ki-67表達與結直腸癌分化程度、淋巴結轉移和Dukes分期具有相關性，差異有統計學意義(P<0.05，表5)。

表2 結直腸癌中Survivin和Caspase 9表達的相關性

r=-0.362,P=0.010

表3 結直腸癌中Survivin和Ki-67表達的相關性

r=0.398,P=0.004

表4 結直腸癌中Caspase 9和Ki-67表達的相關性

r=-0.400,P=0.004

表1 Survivin、Caspase 9、Ki-67在結直腸癌、結直腸腺瘤和癌旁正常結直腸組織中的表達

與結直腸腺瘤組相比，△P<0.05；與正常結直腸組相比，☆P<0.05；與結直腸癌組相比，*P<0.05

ABC

圖1 Survivin在結直腸癌(A)、結直腸腺瘤(B)和癌旁正常組織(C)中的表達，EliVision法

圖2 Caspase 9在結直腸癌(A)、結直腸腺瘤(B)和癌旁正常組織(C)中的表達，EliVision法 圖3 Ki-67在結直腸癌(A)、結直腸腺瘤(B)和癌旁正常組織(C)中的表達，EliVision法

表5 Survivin、Caspase 9、Ki-67表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

*P<0.05

3 討論

Survivin是近年來發現的凋亡抑制蛋白家族的重要成員，是一個凋亡抑制劑。Survivin的表達廣泛參與細胞凋亡、胚胎發育、血管生長，以及腫瘤免疫調節[1]。Survivin表達于各型胚胎組織，并在一些有高增殖活性的正常組織中表達，而在成熟的正常組織中幾乎不表達[2]。研究表明，在很多惡性腫瘤中，如胃癌、卵巢癌、結腸癌、胰腺癌和肺癌[3-7]均發現Survivin高表達。Survivin可通過多種途徑干擾多種因素誘導的細胞凋亡，其中就有干擾Caspase家族的誘導細胞凋亡通路。Caspase 9所在的Caspase家族通過蛋白酶級聯反應控制細胞凋亡的發生與發展。在級聯反應的上游Caspase 9等能在其它蛋白輔助下發生自我活化并識別和激活下游Caspase，作為凋亡執行者誘發細胞凋亡[8]。本組實驗結果顯示，Survivin在結直腸癌中的表達明顯高于結直腸腺瘤和癌旁正常組織(P<0.05)，這與張偉興等[9]的結果一致。Survivin表達與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑及浸潤深度無關(P>0.05)，與結直腸癌分化程度，淋巴結轉移和Dukes分期有關(P<0.05)。本組實驗中，Survivin在結直腸癌、腺瘤及正常組織中的表達是逐漸降低的，而在結直腸癌中，隨著腫瘤惡性程度和病情進展的加深，Survivin的表達逐漸升高，這表明Survivin的表達一定程度反映了結直腸癌的發生進展情況，因此，Survivin在臨床上具有潛在應用價值，可以作為一個分子標志物對結直腸癌進行診斷及判斷預后。Caspase 9在癌旁正常組織中的表達明顯高于結直腸腺瘤和結直腸癌中表達(P<0.05)，這與東星等[10]的研究結果一致。Caspase 9與結直腸癌分化程度、淋巴結轉移和Dukes分期有關(P<0.05)。其在高分化腸癌中的表達明顯強于中低分化的結直腸癌組織，隨著Caspase 9的表達降低，細胞凋亡受到抑制，組織分化程度越低，提示Caspase 9在一定程度上參與腫瘤組織的分化。通過Spearman相關性分析得出Survivin與Caspase 9存在相關性，驗證了Survivin可通過干擾Caspase 9的活化來實現抗細胞凋亡作用。Caspase 9亦可作為應用于臨床的生物分子指標評估結直腸癌的發生、發展。Ki-67是細胞增殖的抗原標志物，其增殖指數越高，說明細胞增生越旺盛。在臨床病理中，Ki-67常用來反映腫瘤的惡性程度，評估患者的預后及復發轉移狀況。Ki-67在本實驗中與Survivin表達呈正相關，與Caspase 9表達呈負相關(P<0.05)，結合之前Survivin與Caspase 9呈負相關，表明Survivin高表達的結直腸癌組織其細胞凋亡受抑制，細胞過度增殖，惡性程度高，預后差；Caspase 9高表達的結直腸癌組織其細胞大量凋亡，增殖活力弱，預后良好。Ki-67可能與Survivin在腫瘤的發生、發展中表現為協同關系，而與Caspase 9為拮抗關系，這還需要更多實驗進行驗證與研究。本實驗中Ki-67與腫瘤分化程度、淋巴結轉移及Dukes分期有關(P<0.05)。表明Ki-67表達越強，癌細胞增殖活力越旺盛，腫瘤惡性程度越高，越易發生侵襲轉移。Ki-67在評價腫瘤預后方面亦具有重要參考價值。

眾所周知，幾乎所有的癌癥均會有一個癌前病變過程，但并非所有癌前病變均會發展成癌，這也是尋找可靠腫瘤標志物的意義所在。隨著分子靶向治療的發展，尋找腫瘤新的靶點也是科研工作者研究的方向。聯合檢測Survivin、Caspase 9和Ki-67可提高對結直腸癌診斷及判斷預后的準確性，作為結直腸癌靶向治療的靶點，也會為結直腸癌的綜合治療翻開嶄新的篇章。

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1牡丹江醫學院紅旗醫院腫瘤科、3病理科，牡丹江 1570112牡丹江醫學院機能學教研室，牡丹江 157011

趙 巖，男，碩士研究生。E-mail: 373433006@qq.com 王志強，男，碩士生導師，主任醫師，通訊作者。E-mail: zqwang56@126.com

時間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.019.html

1001-7399(2017)04-0435-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.019

R 735.3

A

接受日期：2017-02-16