長鏈非編碼RNA CCAT1對前列腺癌PC-3細胞增殖、遷移及凋亡的影響

韓勖，凌志新，葛增樂，胡強，許斌，陳明

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009；2.東南大學附屬中大醫院 泌尿外科，江蘇 南京 210009)

·論 著·

長鏈非編碼RNA CCAT1對前列腺癌PC-3細胞增殖、遷移及凋亡的影響

韓勖1，凌志新1，葛增樂1，胡強1，許斌2，陳明2

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009；2.東南大學附屬中大醫院 泌尿外科，江蘇 南京 210009)

目的：探討長鏈非編碼RNA結腸癌相關轉錄因子1(CCAT1)對前列腺癌PC-3細胞增殖、遷移及凋亡的影響。方法：采用熒光定量PCR檢測CCAT1 siRNA在PC-3細胞中的敲低效率；通過CCK-8法、transwell遷移實驗、流式細胞儀(FACS)檢測低表達CCAT1對PC-3細胞增殖、遷移及凋亡的影響。結果：PC-3細胞轉染CCAT1 siRNA后，qPCR檢測細胞中CCAT1表達量明顯降低；低表達CCAT1能顯著抑制細胞增殖，減弱遷移能力，促進細胞凋亡。結論：CCAT1可能通過對細胞增殖、遷移及凋亡的調控促進前列腺癌發生、發展。

結腸癌相關轉錄因子1；前列腺癌；增殖；遷移；凋亡

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是泌尿系統常見的惡性腫瘤。在美國，前列腺癌已成為男性發病率最高的惡性腫瘤，2015年美國約有220 800新發病例，同時約有27 540人死于前列腺癌[1]。在歐洲，前列腺癌引發的死亡人數居男性腫瘤死亡人數的第3位[2]。2015年歐洲約有72 600人死于前列腺癌[3]。在中國，前列腺癌發病率略低于發達國家，據陳萬青統計，我國每年前列腺癌新發病例數約5.7萬，總發病率為8.14/10萬，呈逐年上升趨勢，且增長較發達國家更為迅速[4]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉錄本長度大于200 nt的ncRNA分子，通常由RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ)轉錄生成[5]。我們課題組在前期工作中發現，lncRNA結腸癌相關轉錄因子1(CCAT1)在前列腺癌組織中表達水平明顯高于癌旁組織。本研究進一步明確CCAT1在前列腺癌PC-3細胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人前列腺癌細胞株PC-3購自上海細胞庫，CCAT1 siRNA及negative siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，逆轉錄試劑盒(諾唯贊公司)，熒光定量PCR所需SYBR Green染料(Roche公司)，CCK-8試劑盒(凱基公司)，1640培養基、opti-MEM和胎牛血清(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，LipofectamineTM2000、TRIzol (Invitrogen公司)，6、24、96孔細胞培養板、transwell小室(Corning公司)。

1.2 細胞培養與轉染

在37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中用含1%雙抗和10%胎牛血清的1640培養基培養PC-3細胞。當日用不含雙抗的培養基將細胞接種于6孔板中，次日當細胞匯合度約60%時每孔加入500μl配制好的含有LipofectamineTM2000和siRNA的轉染培養基opti-MEM(實驗組和對照組細胞分別轉染CCAT1 siRNA和negative siRNA)，水平十字晃勻，在培養箱中孵育6h后吸去舊培養基，每孔加入2ml完全培養基。CCAT1 siRNA序列：5′-UGUGGUAGGAAAGAGAAAUGAAUGG-3′；negative siRNA序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUG AAUGG-3′。

1.3 熒光定量PCR檢測轉染后PC-3細胞中CCAT1相對表達量

用TRIzol提取PC-3細胞的總mRNA，逆轉錄為cDNA，逆轉錄反應條件：25 ℃ 10min，50℃ 30min，85℃ 5min，用熒光定量PCR試劑盒進行檢測。CCAT1上游引物：5′-GCCGTGTTAAGCATTGCGAA-3′，下游引物：5′-AGAGTAGTGCCTGGCCTAGA-3′；內參基因：GAPDH上游引物：5′-GAAATCCCATCACCACTTCCAGG-3′，下游引物：5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3′。熒光定量PCR反應條件：95℃ 5min，95℃ 15s，60℃ 1min，40個循環。溶解曲線溫度設定為60～95℃，每個樣品設置3個復孔；應用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測特異性。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖

轉染siRNA 48h后收集細胞，調整細胞懸液濃度鋪至96孔板，細胞密度為3 000個·孔-1。實驗組和對照組各設4行，每行設5個復孔，由當日開始加CCK-8試劑，每天兩組各加1行，連續加4d。每孔加入10μlCCK-8試劑后，于培養箱中孵育2h后上機檢測。在無細胞孔中加入完全培養基作為調零孔，在酶標儀上讀數，吸收波長為450nm，繪制細胞生長曲線。

1.5 Transwell遷移實驗檢測細胞遷移

轉染siRNA 48h后收集細胞，用無血清培養基重懸細胞，并調整懸液濃度為1×106個·ml-1。取100μl加入上室，下室所在24孔板每孔加入600μl完全培養基，培養箱中孵育8h，用PBS清洗transwell小室后放入24孔板，每孔加入 600μl 95%甲醇室溫固定 20min。24孔板中每孔加入 600μl 0.2%結晶紫染液，室溫染色20min。PBS輕洗后顯微鏡下計數穿過濾膜的細胞。小室的細胞數以顯微鏡下5個視野的細胞平均數為準。

1.6 流式細胞儀(FACS)檢測細胞凋亡

轉染siRNA 48h后收集細胞。用PBS輕洗細胞2次，加入500μl 1×binding buffer重懸細胞。細胞懸液中加入5μl Annexin V-FITC 試劑，混勻后室溫避光孵育15min后加入10μl PI試劑，輕輕混勻，室溫避光孵育5min，1h內送檢。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 轉染CCAT1 siRNA后PC-3細胞中CCAT1相對表達量

qPCR檢測兩組細胞中CCAT1相對表達量，每組設3個復孔，2—△△Ct為縱坐標。結果顯示，實驗組細胞中CCAT1表達水平較對照組明顯降低(圖1)，說明CCAT1 siRNA能夠有效降低CCAT1表達量。

圖1 qPCR檢測細胞中CCAT1表達水平的敲低效果

2.2 轉染CCAT1 siRNA對細胞增殖的影響

CCK-8法連續72h檢測各組細胞的增殖能力，以時間為橫軸、450nm吸光值為縱軸繪制生長曲線。結果顯示，實驗組吸光值較對照組明顯降低(圖2)，檢測48、72h差異有統計學意義(P<0.05)，說明低表達CCAT1抑制細胞增殖。

圖2 CCAT1敲低后實驗組與對照組細胞增殖比較(aP<0.05)

2.3 轉染CCAT1 siRNA對細胞遷移的影響

Transwell遷移實驗結果顯示，穿過濾膜的細胞數實驗組較對照組明顯減少(P<0.05，圖3)，說明低表達CCAT1阻礙細胞遷移。

2.4 轉染CCAT1 siRNA對細胞凋亡的影響

FACS檢測細胞凋亡結果顯示，總凋亡率實驗組細胞較對照組明顯增高(P<0.05，圖4)，說明低表達CCAT1促進細胞凋亡。

A.遷移染色圖；B.統計分析圖

圖3 CCAT1敲低后實驗組與對照組細胞遷移比較(aP<0.05)

A.凋亡流式圖；B.統計分析圖

圖4 CCAT1敲低后實驗組與對照組細胞總凋亡率比較(aP<0.05)

3 討 論

無論在歐美發達國家還是在中國，前列腺癌均已成為威脅男性健康的主要疾病之一。長鏈非編碼RNA最初被認為是基因組的“轉錄噪音”，不具備生物學功能[6]。但最新研究[7-9]發現，IncRNA可從表觀遺傳、轉錄水平、轉錄后參與調控基因表達。

CCAT1是一個擁有2628nt的非編碼RNA分子，最早在結腸癌中被發現，位于8q24.21、轉錄因子c-Myc附近，研究表明這是基因突變的高發區[10]。c-Myc可結合CCAT1上游的順式作用元件E-box，從而促使CCAT1在細胞中高表達[11]；c-Myc還能夠促進DNA合成與轉錄，加速細胞由G1期進入S期，促進細胞無限增殖，同時抑制細胞程序性死亡[12]。目前有關CCAT1與前列腺癌的相關性還未見報道。本實驗通過siRNA敲低CCAT1表達后發現，前列腺癌PC-3細胞增殖及遷移受到明顯抑制，細胞凋亡顯著增加。我們猜想CCAT1可能通過對c-Myc的調控促進前列腺癌進展。而在本實驗的基礎上進一步探索CCAT1在前列腺癌中的分子作用機制，對于進一步揭示前列腺癌的發生發展具有重要意義。

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Effection of lncRNA CCAT1 on the proliferation，migration and apoptosis of prostate cancer cell PC-3

HAN Xu1，LING Zhi-xin1，GE Zeng-le1，HU Qiang1，XU Bin2，CHEN Ming2

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China；2.DepartmentofUrologySurgery，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective:To explore the effect of IncRNA colon cancer associated transcript 1(CCAT1) on the proliferation，migration and apoptosis of prostate cancer PC-3 cells.Methods:qPCR assay was performed to confirm the low expression level of CCAT1 after the transfection of CCAT1 siRNA.CCK-8 assay，transwell migration assay and flow cytometry (FACS) were used to observe on its role in cell proliferation，migration and apoptosis.Results: The expression level of CCAT1 was efficiently knocked down with the transfection of CCAT1 siRNA.And knockdown CCAT1 could significantly suppress the ability of proliferation，migration and promote apoptosis.Conclusion:CCAT1 may promote the carcinogenesis of prostate cancer through regulation of cell proliferation，migration and apoptosis.

colon cancer associated transcript 1；prostate cancer；proliferation；migration；apoptosis

2016-08-05

2016-08-28

國家自然科學基金資助項目(81572517、81370849、81300472)

韓勖(1991-)，男，江蘇南京人，在讀碩士研究生。E-mail：hanxuseu@163.com

陳明 E-mail：mingchenseu@126.com

韓勖，凌志新，胡強，等.長鏈非編碼RNA CCAT1對前列腺癌PC-3細胞增殖、遷移及凋亡的影響 [J].東南大學學報：醫學版，2017，36(1)：1-4.

R737.25

A

1671-6264(2017)01-0001-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2016.01.001