人TRB3過表達載體的構建及檢測

李楊，胡斌，關亞萍，徐敏，孟祥軍，3

(1.南京醫科大學上海一院臨床醫學院 消化科，上海 200080；2.上海交通大學附屬第一人民醫院 消化科，上海 200080；3.上海交通大學附屬第九人民醫院 消化科，上海 200030)

·論 著·

人TRB3過表達載體的構建及檢測

李楊1，2，胡斌2，關亞萍2，徐敏1，2，孟祥軍2，3

(1.南京醫科大學上海一院臨床醫學院 消化科，上海 200080；2.上海交通大學附屬第一人民醫院 消化科，上海 200080；3.上海交通大學附屬第九人民醫院 消化科，上海 200030)

目的：構建TRB3真核表達重組質粒，并用肝癌細胞MHCC-97H檢測其表達。方法：從肝癌組織中提取并擴增TRB3基因的編碼區，將其克隆到真核表達載體pcdh-CMV-MCS-GFP中，酶切并檢定，將克隆成功的質粒轉染至MHCC-97H細胞中，用qPCR和Western Blot檢測TRB3的表達水平。結果與結論：成功擴增了TRB3的編碼區，并克隆至真核表達載體中；轉染后72、96h，MHCC-97H細胞的TRB3 mRNA和蛋白表達顯著增高；成功構建的TRB3過表達載體可用于后續實驗。

TRB3；過表達；肝細胞癌

肝癌是導致人類死亡的第6大惡性腫瘤，據統計，2012年全球有745500人死于肝癌，其中大約半數的病例來自于中國[1]。由于肝癌早期臨床癥狀不明顯，發現時常常處于終末期，手術切除難度大，藥物化療往往成為終末期肝癌患者的最佳選擇[2]。隨著肝癌分子生物學研究的不斷深入以及精準醫療的提出，人們發現了許多與肝癌診療相關的靶基因，TRB3(Tribbles pseudokinase 3)就是其中之一。TRB3最初發現于果蠅，其含有絲/蘇氨酸蛋白激酶樣結構，但缺乏ATP的結合位點，故沒有激酶活性，也被稱為假激酶[3]，其生理功能包括調節葡萄糖和脂類代謝、調節脂肪細胞分化、調控膠原表達、參與細胞應激和凋亡等[4-5]。近期研究發現，TRB3與肝癌的發生密切相關[6]，但其具體機制仍未被完全闡明。本實驗擬通過構建真核TRB3表達載體并使其在肝癌細胞MHCC-97H中穩定表達，為進一步研究TRB3對肝癌發生、發展的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌組織和細胞系MHCC-97H為上海交通大學胰腺病重點實驗室保存，載體pcdh-CMV-MCS-GFP、大腸桿菌感受態細胞DH5α購自上海吉瑪基因公司。DEME培養基、胎牛血清(FBS)購自Sigma公司。DNA限制性內切酶(NotI、NsiI、XhoI和NotI)、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶、dNTP、凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自Fermentas公司。基因測序由上海吉瑪基因公司完成。脂質體Lipofectamine 2000購于Invitrogen 公司；SYBR qPCR 試劑盒購于TaKaRa 公司。人TRB3引物F:GCTGCCAACAGTGGATTGA，R:GCTTCTGCCTTTCTCCCTTCT和HGAPDH引物F：ATGAGAAGTATGACAACAGCCT，R：AGTCCTTCCACGATACCAAAGT均由上海生工生物工程有限公司合成。TRB3多克隆鼠抗購于ABCLONAL公司，GAPDH多克隆鼠抗購于SIGMA公司，山羊抗小鼠HRP標記購于JIR公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因獲取和擴增 從人肝癌組織中提取總RNA，并逆轉錄為cDNA，然后以此為模板通過PCR方法擴增目的基因TRB3。PCR反應完成后利用瓊脂糖電泳并切膠回收TRB3基因片段[7]。

1.2.2 真核表達載體的構建 用NotI和NsiI對TRB3基因片段進行酶切，用XhoI和NotI對載體pcdh-CMV-MCS-GFP進行酶切。然后用DNA 凝膠回收試劑盒回收TRB3基因片段和載體pcdh-CMV-MCS-GFP，用T4 DNA 連接雙酶切得到TRB3基因片段和線性化的載體。將連接產物轉化感受態細胞，培養16h后選取1孔抽提質粒，將抽提好的質粒進行雙酶切鑒定并送測序。將測序結果與目的基因序列進行比對，正確無誤后，進行大量質粒抽提，得到足夠量的重組質粒[7]。

1.2.3 細胞培養與轉染 肝癌細胞MHCC-97H用含有10% FBS的DMEM 培養基，于37℃、5%CO2的環境中培養。收集處于對數生長期的細胞，鋪于6 孔板中，待細胞密度達到80%～90%時進行轉染。細胞分為3組：未處理組(B組，未進行轉染)、對照組(NC組，轉染空質粒)和實驗組(TRB3組，轉染重組質粒)，每組2孔。最后，按照脂質體轉染試劑盒說明書的操作步驟進行轉染，轉染4h后更換培養液，繼續培養72、96h后進行qPCR或Western Blot檢測[8]。

1.2.4 轉染后TRB3表達的檢測 分別使用qPCR和Western Blot檢測轉錄72、96h后肝癌細胞MHCC-97H的TRB3 mRNA和蛋白表達量[7]。

1.3 統計學處理

所有數據均使用SPSS19.0軟件進行統計分析，計量資料采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TRB3基因擴增

用cDNA作為模板進行PCR擴增，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現單一條帶，大小與TRB3實際擴增的大小相符(圖1A)。將雙酶切得到的TRB3片段與線性化的載體用DNA連接酶連接，將載體接入感受態細胞培養，抽提質粒并進行雙酶切電泳，可見目的基因片段(圖1B)；而后將抽提的質粒送公司測序，測序結果與GenBank中的序列一致，證實TRB3過表達載體構建成功。

A.泳道1、2、3、4為人TRB3 PCR擴增產物(如箭頭所示)；B.泳道1為質粒酶切后產物，如箭頭所示。M為Fermeatas SM0331標記物

A.Lane 1，2，3 and 4 are PCR amplified products of human TRB3(as the arrow showed)；B.Lane 1 is PCR amplified product after double enzymatic digestion(as the arrow showed).M is Fermeatas SM0331 marker

圖1 TRB3目的片段PCR電泳圖

Fig 1 Telectrophresis of TRB3 target fragment

2.2 轉染細胞株TRB3基因mRNA的相對表達量

TRB3過表達質粒轉染肝癌細胞MHCC-97H，4h后更換培養液，繼續培養72、96h后對細胞進行qPCR檢測。培養72h后，TRB3組的TRB3 mRNA相對表達量高于NC組 (圖2A)；培養96h后，TRB3組的TRB3 mRNA相對表達量同樣高于NC組(圖2B)。

圖2 轉染后qPCR檢測TRB3 mRNA的表達

Fig 2 Expression of TRB3 mRNA by qPCR after transfected

2.3 轉染細胞株TRB3蛋白的相對表達量

對轉染后的細胞繼續培養72、96h，進行Western Blot檢測，可見過表達轉染組細胞內的TRB3蛋白表達水平均顯著增高，說明篩選得到的細胞株為成功轉染重組質粒并穩定表達TRB3的肝癌細胞MHCC-97H(圖3)。

圖3 轉染后TRB3蛋白的表達Fig 3 Expression of TRB3 protein by Western Blot after transfect

3 討 論

多項研究結果已證實，TRB3在包括肝癌、結直腸癌、舌鱗癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞和人類腫瘤組織中高表達[9]。對TRB3調控腫瘤的機制研究主要集中在3條信號通路：第一，TRB3可抑制MAPK的激活，從而抑制Ras/Raf以及下游的ERK(extracellular regulated kinase)，改變細胞內基因表達狀態，參與調控細胞代謝[10]；第二，TRB3可抑制AKT磷酸化，通過調節AKT-mTOR通路進而調控腫瘤細胞的凋亡和自噬[11]；第三，TRB3與內質網應激(ERS)信號途徑相關，在誘導腫瘤細胞凋亡過程中起著重要作用。其中TRB3與ERS是近年的研究熱點。當腫瘤細胞不斷生長時，腫瘤周圍代謝產物蓄積，誘導ERS產生，從而使內質網折疊和轉運蛋白功能下降甚至消失[12]。TRB3作為ERS通路中ATF4-CHOP下游的信號分子，最終介導了細胞的死亡[13]。許多抗腫瘤代謝藥物，例如鹽霉素即可通過調節TRB3引起細胞凋亡，說明TRB3可作為某些化療藥物的靶點[14]。

為了進一步探討TRB3在肝癌發生、發展中的作用，深入研究TRB3介導肝癌細胞凋亡的作用機制以及TRB3對肝癌治療的意義，我們成功地構建了TRB3過表達真核載體，并檢測轉染細胞后其蛋白和mRNA表達情況，為后續的研究提供了有利工具。

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Construction and identification of human TRB3 gene overexpression vector

LI Yang1，2，HU Bin2，GUAN Ya-ping2，XU min2，MENG Xiang-jun2，3

(1.DepartmentofGastroenterology，ShanghaiFirstPeople′sHospitalofNanjingMedicalUniversity，Shanghai200080，China；2.DepartmentofGastroenterology，ShanghaiFirstPeople′sHospitalofShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200080，China；3.DepartmentofGastroenterology，ShanghaiNinthPeople′sHospitalofShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200080，China)

Objective: To construct human TRB3 gene overexpression vector and identify its expression in hepatocellular carcinoma cells MHCC-97H.Methods: TRB3 gene was extracted from liver cancer tissue of human and amplified it by reverse transcription.Then it was cloned into pcdh-CMV-MCS-GFP vector for constructing eukaryotic expression vector.The successful cloned vector was transfected into hepatocellular carcinoma cells MHCC-97H，and TRB3 expression was determined by qPCR and Western blot.Results and Conclusion：The coding region of human TRB3 gene is successfully amplified，and cloned into the vector；the expression of TRB3 mRNA and protein are upregulated in MHCC-97H cells after transfected；TRB3 overexpression vector is successfully constructed，which could be used into the post-study.

TRB3；overexpression；hepatocellular carcinoma

2016-06-18

2016-08-30

國家自然科學基金面上項目(81072007)；江蘇省研究生培養創新工程項目(SJLX15_0433)

李楊(1990-)，男，安徽滁州人，在讀碩士研究生。 E-mail：ayly0550@163.com

孟祥軍 E-mail：xiangjunmeng@aliyun.com

李楊，胡斌，關亞萍，等.人TRB3過表達載體的構建及檢測[J].東南大學學報:醫學版，2017，36(1)：17-20.

R734.7

A

1671-6264(2017)01-0017-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.005