阿霉素增強(qiáng)CIK細(xì)胞抗多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的機(jī)制研究

姚陽，周民，盧緒章，姜玉，岑嶺，張修文，楊建和

(1.泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.常州市第三人民醫(yī)院，江蘇 常州 213000；3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院 江蘇 常州 213000)

·論 著·

阿霉素增強(qiáng)CIK細(xì)胞抗多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的機(jī)制研究

姚陽1，周民2，盧緒章3，姜玉3，岑嶺3，張修文3，楊建和3

(1.泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.常州市第三人民醫(yī)院，江蘇 常州 213000；3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院 江蘇 常州 213000)

目的：探討阿霉素增強(qiáng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性(CIK)細(xì)胞抗多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的機(jī)制。方法：用阿霉素處理骨髓瘤細(xì)胞株U266以及患者骨髓瘤細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞表面NKG2D配體(MICA/B和ULBPs)表達(dá)的變化及CIK細(xì)胞對U266細(xì)胞殺傷作用的變化。結(jié)果：阿霉素處理后U266細(xì)胞表面MICA/B表達(dá)明顯升高(P=0.002)，而ULBPs的表達(dá)無明顯變化。阿霉素亦能夠誘導(dǎo)患者骨髓瘤細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)增加。CIK細(xì)胞對阿霉素處理過的U266細(xì)胞殺傷作用明顯增加(P=0.01)，這種殺傷作用可以被抗NKG2D抗體部分抑制(P=0.03)。結(jié)論：化療藥物誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞表面MICA/B表達(dá)的增加，從而增強(qiáng)CIK細(xì)胞對骨髓瘤細(xì)胞的殺傷作用。

NKG2D配體；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性細(xì)胞；骨髓瘤細(xì)胞

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷性(cytokine-induced killer，CIK)細(xì)胞對多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，并在臨床得到廣泛的應(yīng)用[1-2]。增強(qiáng)CIK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷力是CIK細(xì)胞治療的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，CIK細(xì)胞表達(dá)較高水平的NKG2D受體，它能夠識別腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)的NKG2D配體，從而對腫瘤細(xì)胞實施殺傷作用[3-5]。NKG2D的配體包括MHC Ⅰ類分子(MICA/B)和ULBPs，它在正常的細(xì)胞或者組織不表達(dá)，但是在腫瘤細(xì)胞或者病毒感染的細(xì)胞表面表達(dá)增加。放射線、化學(xué)藥物等因素可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表面NKG2D配體的表達(dá)，從而增強(qiáng)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[6-7]。蒽環(huán)類化療藥物阿霉素為細(xì)胞周期非特異性藥物，是臨床上治療多發(fā)性骨髓瘤的常用藥。我們利用阿霉素誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞表面NKG2D配體的表達(dá)增加，探討阿霉素增強(qiáng)CIK細(xì)胞抗多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

骨髓瘤細(xì)胞株U266由上海長征醫(yī)院血液科侯健教授惠贈，細(xì)胞置含10%滅活胎小牛血清(FBS)、100U·ml-1青霉素和100μg·ml-1鏈霉素的PRMI1640培養(yǎng)液，于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。阿霉素(浙江海正藥業(yè))；流式細(xì)胞抗體包括抗CD138-FITC抗體購于BD公司，抗MICA/B-PE、ULBP-1-PE、ULBP2-PE和ULBP3-PE抗體購于R&D公司。流式細(xì)胞儀(FCM)為BD公司產(chǎn)品。

1.2 標(biāo)本的來源

研究對象為來自常州市第二人民醫(yī)院血液科初診為多發(fā)性骨髓瘤的13例患者，其中男5例，女8例，中位年齡52歲(30～77歲)。診斷均符合中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南(2011)。根據(jù)ISS分期，Ⅰ期1例、Ⅱ期8例、Ⅲ4例。

1.3 方法

1.3.1 FCM檢測阿霉素骨髓瘤株U266 細(xì)胞表面NKG2D配體 取U266細(xì)胞1×105(100ml)-1，分別加入抗MICA/B-PE、ULBP-1-PE、ULBP2-PE和ULBP3-PE抗體4μl，4℃避光孵育30min后用PBS洗兩遍，用500ml PBS懸浮后上機(jī)檢測，每標(biāo)本記錄細(xì)胞數(shù)為1×104個。在培養(yǎng)液中加入阿霉素(終濃度5μg·ml-1)與U266細(xì)胞共培養(yǎng)24h后用FCM分析其表面的NKG2D配體(MICA/B和ULBPs)的變化。利用FlowJO 軟件分析U266細(xì)胞表面NKG2D配體的表達(dá)水平，用平均免疫熒光強(qiáng)度(MFI)表示NKG2D配體的表達(dá)水平，MFI值小于10定義為陰性(-)。

1.3.2 FCM檢測患者骨髓瘤細(xì)胞表面NKG2D配體 利用密度梯度離心法分離骨髓瘤患者骨髓中的單個核細(xì)胞，取骨髓單個核細(xì)胞1×105(100ml)-1，分別加入抗CD138-FITC抗體和抗MICA/B-PE或ULBP-1-PE、ULBP2-PE和ULBP3-PE抗體各4μl，用FCM分析CD138陽性細(xì)胞(骨髓瘤細(xì)胞)表面NKG2D配體的表達(dá)水平。利用FlowJO 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.3 FCM檢測CIK細(xì)胞對U266細(xì)胞殺傷作用 利用FCM檢測效應(yīng)細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷作用[8]，靶細(xì)胞(U266)預(yù)選用0.1mmol·L-1Calcein acetoxymethyl ester (CAM)孵育15min后，標(biāo)定的靶細(xì)胞用PBS洗兩次，按照5×105孔-1放入圓底的U型管中，然后按照效∶靶比=10加入CIK細(xì)胞，在培養(yǎng)箱里共孵育10h后用PBS洗1次，再用結(jié)合緩沖液重新混懸細(xì)胞，然后用加入7-AAD抗體在常溫中孵育15min后用FCM檢測特異性殺傷率。特異性殺傷率=(CT-TE/CT)×100% (CT表示在對照孔中活細(xì)胞的所占的比率，TE表示測試管中活細(xì)胞所占的比率)。在抗體阻滯實驗中CIK細(xì)胞與10μg·ml-1抗-NKG2D抗體預(yù)先一起孵育30min，然后加入到靶細(xì)胞中。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，U266細(xì)胞表面NKG2D配體水平的變化、CIK細(xì)胞對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的殺傷作用比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 阿霉素對骨髓瘤細(xì)胞NKG2D配體的影響

阿霉素處理24h后，U266細(xì)胞表面的MICA/B表達(dá)明顯增加，ULBPs(包括ULBP1、2、3)水平無明顯變化(表1)，提示阿霉素誘導(dǎo)了U266細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)。

表1 阿霉素對骨髓瘤細(xì)胞株U266表面NKG2D配體表達(dá)的影響

組 別NKG2D配體表達(dá)MICA/BULBP1ULBP2ULBP3阿霉素處理前178±15.62.5±1.35.6±3.63.4±2.1阿霉素處理后286±21.65.6±3.66.3±4.23.1±1.6t值7.0211.4030.2190.854P值0.0020.2330.8370.854

2.2 患者骨髓瘤細(xì)胞表面NKG2D配體表達(dá)水平

大多數(shù)患者骨髓瘤細(xì)胞表面表達(dá)一定水平的NKG2D配體(表2)。用阿霉素處理其中2例患者骨髓瘤細(xì)胞后，其表面NKG2D配體的水平有一定增加(未展示)。

表2 患者骨髓瘤細(xì)胞表面NKG2D配體表達(dá)水平

患者編號NKG2D配體表達(dá)MICA/BULBP1ULBP2ULBP3116752653211102521253----4----576-632-6-18910892867589-2054-8275---9----10----11----12--634-13508---

2.3 CIK細(xì)胞對骨髓瘤細(xì)胞殺傷活性

當(dāng)效∶靶比為10∶1時，CIK細(xì)胞對U266細(xì)胞特異性殺傷為(48.8±4.8)%，阿霉素處理U266細(xì)胞后，CIK細(xì)胞殺傷作用增加至(65.8±5.5)%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01)(圖1A)。我們用抗NKG2D抗體預(yù)先處理CIK細(xì)胞后其對U266細(xì)胞的殺傷作用下降了[(38.2±4.6)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.03)(圖1B)。

3 討 論

NKG2D配體在正常組織中很少表達(dá)，但是在腫瘤細(xì)胞表面可以檢測到高水平的NKG2D配體[6，9，10-11]。免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷與其表面NKG2D配體的表達(dá)水平相關(guān)[6，12]。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表面的NKG2D配體表達(dá)可以增強(qiáng)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

A.CIK對阿霉素處理前后的U266細(xì)胞殺傷作用；

B.抗NKG2D抗體阻斷后CIK對U266細(xì)胞殺傷作用

圖1 CIK細(xì)胞對骨髓瘤細(xì)胞株U266殺傷作用

本研究結(jié)果顯示：低濃度的阿霉素處理后骨髓瘤細(xì)胞株表面的MICA/B明顯增高，用阿霉素處理的兩例患者骨髓瘤細(xì)胞亦得到類似的結(jié)果；CIK細(xì)胞對阿霉素處理后U266細(xì)胞的殺傷作用明顯提高，說明化療藥物可以增強(qiáng)CIK細(xì)胞對骨髓瘤細(xì)胞的殺傷作用；用抗NKG2D抗體可以明顯阻滯CIK細(xì)胞對U266殺傷作用，說明CIK細(xì)胞對U266殺傷作用部分是由NKG2D受體與配體相互作用介導(dǎo)的，阿霉素增強(qiáng)CIK細(xì)胞抗骨髓瘤細(xì)胞可能是通過誘導(dǎo)NKG2D配體表達(dá)增加來實現(xiàn)的。

綜上所述，低濃度的化療藥物可以增強(qiáng)CIK細(xì)胞對骨髓瘤細(xì)胞的殺傷作用，通過刺激骨髓瘤細(xì)胞表面NKG2D配體的表達(dá)增加而增強(qiáng)CIK細(xì)胞對骨髓瘤細(xì)胞的識別和殺傷作用。

因此，我們可以通過化療聯(lián)合CIK細(xì)胞治療腫瘤，增加CIK細(xì)胞的治療效果，為臨床治療腫瘤提供新的策略。

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Mechanism of adriamycin enhanced CIK cells cytotoxicity against multiple myeloma cells

YAO Yang1，ZHOU Min2，LU Xu-zhang3，JIANG Yu3，CEN Ling3，ZHANG Xiu-wen3，YANG Jian-he3

(1.TaizhouPolytechnicCollege，Taizhou225300，China；2.ChangzhouNo.3People′sHospital，Changzhou213000，China；3.theAffiliatedChangzhouNo.2People′sHospital，NanjingMedicalUniversity，Changzhou213000，China)

Objective: To explore the mechanism of adriamycin enhanced CIK cells cytotoxicity against multiple myeloma cells.Methods: Multiple myeloma cell line U266 and the cells from patients with multiple myeloma were treated with adriamycin，the expression of NKG2D ligands (MICA/B and ULBPs) were analyzed by flow cytometry (FCM).The cytotoxicity of CIK cells against U266 cell was detected by flow cytometry.Results: The expression of MICA/B on multiple myeloma cell line U266 was up-regulated after treated with adriamycin (P=0.002)，however expression of ULBPs had no changed.The expression of MICA/B on primary plasma cells was also up-regulated after treated with adrimycin.The cytotoxicity of CIK cell against U266 was significantly increased by treated with adriamycin (P=0.01)，and the enhancing cytotoxicity was partly blocked by anti-NKG2D Abs (P=0.03).Conclusion:The cytotoxicity of CIK cells against multiple myeloma an enhance by treated with adriamycin through Up-regulating of MICA/B.

doxorubicin；cytokine-induced killer cells；multiple myeloma cell

2016-05-13

2016-08-22

2014年泰州市科技支撐社會發(fā)展計劃(指導(dǎo)性)項目(201433)；常州市衛(wèi)生局青年科技項目(QN201203)；常州市衛(wèi)生局重大項目(ZD201311)

姚陽(1969-)，男，重慶市人，副教授。E-mail:13961018417@163.com

周民 E-mail：zhoumin@medmail.com

姚陽，周民，盧緒章，等.阿霉素增強(qiáng)CIK細(xì)胞抗多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的機(jī)制研究[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2017，36(1)：20-23.

R329.2

A

1671-6264(2017)01-0020-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.006