阿霉素增強CIK細胞抗多發性骨髓瘤細胞的機制研究

姚陽，周民，盧緒章，姜玉，岑嶺，張修文，楊建和

(1.泰州職業技術學院，江蘇 泰州 225300；2.常州市第三人民醫院，江蘇 常州 213000；3.南京醫科大學附屬常州第二人民醫院 江蘇 常州 213000)

·論 著·

阿霉素增強CIK細胞抗多發性骨髓瘤細胞的機制研究

姚陽1，周民2，盧緒章3，姜玉3，岑嶺3，張修文3，楊建和3

(1.泰州職業技術學院，江蘇 泰州 225300；2.常州市第三人民醫院，江蘇 常州 213000；3.南京醫科大學附屬常州第二人民醫院 江蘇 常州 213000)

目的：探討阿霉素增強細胞因子誘導的殺傷性(CIK)細胞抗多發性骨髓瘤細胞的機制。方法：用阿霉素處理骨髓瘤細胞株U266以及患者骨髓瘤細胞，流式細胞儀(FCM)檢測細胞表面NKG2D配體(MICA/B和ULBPs)表達的變化及CIK細胞對U266細胞殺傷作用的變化。結果：阿霉素處理后U266細胞表面MICA/B表達明顯升高(P=0.002)，而ULBPs的表達無明顯變化。阿霉素亦能夠誘導患者骨髓瘤細胞表面MICA/B的表達增加。CIK細胞對阿霉素處理過的U266細胞殺傷作用明顯增加(P=0.01)，這種殺傷作用可以被抗NKG2D抗體部分抑制(P=0.03)。結論：化療藥物誘導骨髓瘤細胞表面MICA/B表達的增加，從而增強CIK細胞對骨髓瘤細胞的殺傷作用。

NKG2D配體；細胞因子誘導的殺傷性細胞；骨髓瘤細胞

細胞因子誘導的殺傷性(cytokine-induced killer，CIK)細胞對多種腫瘤細胞具有殺傷作用，并在臨床得到廣泛的應用[1-2]。增強CIK細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷力是CIK細胞治療的關鍵。研究發現，CIK細胞表達較高水平的NKG2D受體，它能夠識別腫瘤細胞表面相應的NKG2D配體，從而對腫瘤細胞實施殺傷作用[3-5]。NKG2D的配體包括MHC Ⅰ類分子(MICA/B)和ULBPs，它在正常的細胞或者組織不表達，但是在腫瘤細胞或者病毒感染的細胞表面表達增加。放射線、化學藥物等因素可以誘導腫瘤細胞表面NKG2D配體的表達，從而增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用[6-7]。蒽環類化療藥物阿霉素為細胞周期非特異性藥物，是臨床上治療多發性骨髓瘤的常用藥。我們利用阿霉素誘導骨髓瘤細胞表面NKG2D配體的表達增加，探討阿霉素增強CIK細胞抗多發性骨髓瘤細胞的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

骨髓瘤細胞株U266由上海長征醫院血液科侯健教授惠贈，細胞置含10%滅活胎小牛血清(FBS)、100U·ml-1青霉素和100μg·ml-1鏈霉素的PRMI1640培養液，于5%CO2、37℃條件下培養。阿霉素(浙江海正藥業)；流式細胞抗體包括抗CD138-FITC抗體購于BD公司，抗MICA/B-PE、ULBP-1-PE、ULBP2-PE和ULBP3-PE抗體購于R&D公司。流式細胞儀(FCM)為BD公司產品。

1.2 標本的來源

研究對象為來自常州市第二人民醫院血液科初診為多發性骨髓瘤的13例患者，其中男5例，女8例，中位年齡52歲(30～77歲)。診斷均符合中國多發性骨髓瘤診治指南(2011)。根據ISS分期，Ⅰ期1例、Ⅱ期8例、Ⅲ4例。

1.3 方法

1.3.1 FCM檢測阿霉素骨髓瘤株U266 細胞表面NKG2D配體 取U266細胞1×105(100ml)-1，分別加入抗MICA/B-PE、ULBP-1-PE、ULBP2-PE和ULBP3-PE抗體4μl，4℃避光孵育30min后用PBS洗兩遍，用500ml PBS懸浮后上機檢測，每標本記錄細胞數為1×104個。在培養液中加入阿霉素(終濃度5μg·ml-1)與U266細胞共培養24h后用FCM分析其表面的NKG2D配體(MICA/B和ULBPs)的變化。利用FlowJO 軟件分析U266細胞表面NKG2D配體的表達水平，用平均免疫熒光強度(MFI)表示NKG2D配體的表達水平，MFI值小于10定義為陰性(-)。

1.3.2 FCM檢測患者骨髓瘤細胞表面NKG2D配體 利用密度梯度離心法分離骨髓瘤患者骨髓中的單個核細胞，取骨髓單個核細胞1×105(100ml)-1，分別加入抗CD138-FITC抗體和抗MICA/B-PE或ULBP-1-PE、ULBP2-PE和ULBP3-PE抗體各4μl，用FCM分析CD138陽性細胞(骨髓瘤細胞)表面NKG2D配體的表達水平。利用FlowJO 軟件進行數據分析。

1.3.3 FCM檢測CIK細胞對U266細胞殺傷作用 利用FCM檢測效應細胞對靶細胞的殺傷作用[8]，靶細胞(U266)預選用0.1mmol·L-1Calcein acetoxymethyl ester (CAM)孵育15min后，標定的靶細胞用PBS洗兩次，按照5×105孔-1放入圓底的U型管中，然后按照效∶靶比=10加入CIK細胞，在培養箱里共孵育10h后用PBS洗1次，再用結合緩沖液重新混懸細胞，然后用加入7-AAD抗體在常溫中孵育15min后用FCM檢測特異性殺傷率。特異性殺傷率=(CT-TE/CT)×100% (CT表示在對照孔中活細胞的所占的比率，TE表示測試管中活細胞所占的比率)。在抗體阻滯實驗中CIK細胞與10μg·ml-1抗-NKG2D抗體預先一起孵育30min，然后加入到靶細胞中。

1.4 統計學處理

采用SPSS13.0統計軟件進行分析，U266細胞表面NKG2D配體水平的變化、CIK細胞對多發性骨髓瘤細胞的殺傷作用比較用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 阿霉素對骨髓瘤細胞NKG2D配體的影響

阿霉素處理24h后，U266細胞表面的MICA/B表達明顯增加，ULBPs(包括ULBP1、2、3)水平無明顯變化(表1)，提示阿霉素誘導了U266細胞表面MICA/B的表達。

表1 阿霉素對骨髓瘤細胞株U266表面NKG2D配體表達的影響

組 別NKG2D配體表達MICA/BULBP1ULBP2ULBP3阿霉素處理前178±15.62.5±1.35.6±3.63.4±2.1阿霉素處理后286±21.65.6±3.66.3±4.23.1±1.6t值7.0211.4030.2190.854P值0.0020.2330.8370.854

2.2 患者骨髓瘤細胞表面NKG2D配體表達水平

大多數患者骨髓瘤細胞表面表達一定水平的NKG2D配體(表2)。用阿霉素處理其中2例患者骨髓瘤細胞后，其表面NKG2D配體的水平有一定增加(未展示)。

表2 患者骨髓瘤細胞表面NKG2D配體表達水平

患者編號NKG2D配體表達MICA/BULBP1ULBP2ULBP3116752653211102521253----4----576-632-6-18910892867589-2054-8275---9----10----11----12--634-13508---

2.3 CIK細胞對骨髓瘤細胞殺傷活性

當效∶靶比為10∶1時，CIK細胞對U266細胞特異性殺傷為(48.8±4.8)%，阿霉素處理U266細胞后，CIK細胞殺傷作用增加至(65.8±5.5)%，兩者差異有統計學意義(P=0.01)(圖1A)。我們用抗NKG2D抗體預先處理CIK細胞后其對U266細胞的殺傷作用下降了[(38.2±4.6)%]，差異有統計學意義(P=0.03)(圖1B)。

3 討 論

NKG2D配體在正常組織中很少表達，但是在腫瘤細胞表面可以檢測到高水平的NKG2D配體[6，9，10-11]。免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷與其表面NKG2D配體的表達水平相關[6，12]。因此，誘導腫瘤細胞表面的NKG2D配體表達可以增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。

A.CIK對阿霉素處理前后的U266細胞殺傷作用；

B.抗NKG2D抗體阻斷后CIK對U266細胞殺傷作用

圖1 CIK細胞對骨髓瘤細胞株U266殺傷作用

本研究結果顯示：低濃度的阿霉素處理后骨髓瘤細胞株表面的MICA/B明顯增高，用阿霉素處理的兩例患者骨髓瘤細胞亦得到類似的結果；CIK細胞對阿霉素處理后U266細胞的殺傷作用明顯提高，說明化療藥物可以增強CIK細胞對骨髓瘤細胞的殺傷作用；用抗NKG2D抗體可以明顯阻滯CIK細胞對U266殺傷作用，說明CIK細胞對U266殺傷作用部分是由NKG2D受體與配體相互作用介導的，阿霉素增強CIK細胞抗骨髓瘤細胞可能是通過誘導NKG2D配體表達增加來實現的。

綜上所述，低濃度的化療藥物可以增強CIK細胞對骨髓瘤細胞的殺傷作用，通過刺激骨髓瘤細胞表面NKG2D配體的表達增加而增強CIK細胞對骨髓瘤細胞的識別和殺傷作用。

因此，我們可以通過化療聯合CIK細胞治療腫瘤，增加CIK細胞的治療效果，為臨床治療腫瘤提供新的策略。

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Mechanism of adriamycin enhanced CIK cells cytotoxicity against multiple myeloma cells

YAO Yang1，ZHOU Min2，LU Xu-zhang3，JIANG Yu3，CEN Ling3，ZHANG Xiu-wen3，YANG Jian-he3

(1.TaizhouPolytechnicCollege，Taizhou225300，China；2.ChangzhouNo.3People′sHospital，Changzhou213000，China；3.theAffiliatedChangzhouNo.2People′sHospital，NanjingMedicalUniversity，Changzhou213000，China)

Objective: To explore the mechanism of adriamycin enhanced CIK cells cytotoxicity against multiple myeloma cells.Methods: Multiple myeloma cell line U266 and the cells from patients with multiple myeloma were treated with adriamycin，the expression of NKG2D ligands (MICA/B and ULBPs) were analyzed by flow cytometry (FCM).The cytotoxicity of CIK cells against U266 cell was detected by flow cytometry.Results: The expression of MICA/B on multiple myeloma cell line U266 was up-regulated after treated with adriamycin (P=0.002)，however expression of ULBPs had no changed.The expression of MICA/B on primary plasma cells was also up-regulated after treated with adrimycin.The cytotoxicity of CIK cell against U266 was significantly increased by treated with adriamycin (P=0.01)，and the enhancing cytotoxicity was partly blocked by anti-NKG2D Abs (P=0.03).Conclusion:The cytotoxicity of CIK cells against multiple myeloma an enhance by treated with adriamycin through Up-regulating of MICA/B.

doxorubicin；cytokine-induced killer cells；multiple myeloma cell

2016-05-13

2016-08-22

2014年泰州市科技支撐社會發展計劃(指導性)項目(201433)；常州市衛生局青年科技項目(QN201203)；常州市衛生局重大項目(ZD201311)

姚陽(1969-)，男，重慶市人，副教授。E-mail:13961018417@163.com

周民 E-mail：zhoumin@medmail.com

姚陽，周民，盧緒章，等.阿霉素增強CIK細胞抗多發性骨髓瘤細胞的機制研究[J].東南大學學報:醫學版，2017，36(1)：20-23.

R329.2

A

1671-6264(2017)01-0020-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.006