過表達(dá)miR-7對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖及侵襲的影響

巨少龍，吳迪，張瑩，竇駿

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，江蘇 南京 210009)

·論 著·

過表達(dá)miR-7對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖及侵襲的影響

巨少龍1，吳迪2，張瑩1，竇駿2

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)與免疫學(xué)系，江蘇 南京 210009)

目的：探討miRNA-7(miR-7)過表達(dá)對(duì)上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響。方法：從人類基因組中擴(kuò)增出帶有酶切位點(diǎn)的miR-7目的基因，將其連接到pIRES質(zhì)粒構(gòu)成重組質(zhì)粒并予以鑒定。將pIRES-miR-7重組質(zhì)粒及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SKOV3細(xì)胞，用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞miR-7的表達(dá)。極限稀釋法篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的pIRES-miR-7 SKOV3及pIRES SKOV3細(xì)胞克隆。利用CCK8法測(cè)定過表達(dá)miR-7 SKOV3的增殖能力，Transwell小室法測(cè)定過表達(dá)miR-7 SKOV3的侵襲能力。結(jié)果與結(jié)論：成功構(gòu)建了pIRES-miR-7重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pIRES-miR-7 的SKOV3細(xì)胞克隆，其表達(dá)的miR-7水平顯著高于pIRES SKOV3組(P<0.01)及野生型SKOV3組(P<0.001)，且細(xì)胞增殖及侵襲能力pIRES-miR-7 SKOV3組比pIRES SKOV3組下降。

卵巢癌細(xì)胞；miR-7；過表達(dá)；增殖；侵襲

微小RNA(miRNA)是一組真核細(xì)胞中長(zhǎng)度大約為21～23個(gè)核苷酸序列的小分子RNA，為非編碼序列，參與轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)，在細(xì)胞的生物學(xué)行為中扮演著至關(guān)重要的角色。目前，有大量研究表明，miRNA表達(dá)水平的改變與人類惡性腫瘤的發(fā)病及進(jìn)展相關(guān)，如乳腺癌[1]、結(jié)腸癌[2]、肝癌[3]、結(jié)直腸癌[4]等。

卵巢癌正在損害著廣大女性的健康，并且其發(fā)病率在逐步升高，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，近年來(lái)對(duì)腫瘤標(biāo)志物的研究及早期篩查使得卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn)及診斷率有所提高，但近30年來(lái)卵巢癌生存率并未有明顯升高。由于卵巢的解剖位置較深，導(dǎo)致其在疾病早期表現(xiàn)往往不明顯，大部分患者在確診時(shí)已處于晚期階段，5年存活率較低，且死亡率很高[5]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過測(cè)定miRNA-7在卵巢癌SKOV3細(xì)胞系中的水平，探究其對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖與侵襲等行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人類卵巢癌SKOV3細(xì)胞系購(gòu)買于中科院上海生科院細(xì)胞庫(kù)，1640培養(yǎng)基購(gòu)買于南京市雨花臺(tái)區(qū)百伏生物技術(shù)研發(fā)中心，胰蛋白酶、無(wú)支原體胎牛血清采購(gòu)于南京賽凱公司，TRIzol Reagent及Lipofectamine 2000 Transfection Reagent購(gòu)買于蘇州睿捷生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)買于TaKaRa，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)試劑盒購(gòu)于優(yōu)寧維生物，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3用含有10%血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2，大約每3d換1次培養(yǎng)基。

1.2.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒并鑒定 從Pubmed上獲取miRNA-7的核苷酸順序，從人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中用TRIzol抽提基因組RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增并純化Pre-miR-7，利用CaCl2法將pIRES質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌，選取陽(yáng)性克隆菌擴(kuò)增培養(yǎng)，采用試劑盒提取pIRES空載質(zhì)粒并雙酶切(NotⅠ及XbaⅠ)鑒定Pre-miR-7及pIRES空載質(zhì)粒，割膠回收。目的基因及空載質(zhì)粒雙酶切后按照說(shuō)明書利用T4DNA酶連接，將重組質(zhì)粒利用CaCl2法轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)，挑單克隆進(jìn)行菌落PCR。提取陽(yáng)性DH5α大腸桿菌克隆的PIRES-miR-7質(zhì)粒后擴(kuò)增，再進(jìn)行雙酶切鑒定；同時(shí)對(duì)PIRES-miR-7測(cè)序檢測(cè)。

1.2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞克隆篩選以及miR-7水平測(cè)定 利用脂質(zhì)體Lipo2000分別將pIRES-miR-7重組質(zhì)粒及pIRES空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SKOV3細(xì)胞，A液：10μl質(zhì)粒+無(wú)血清1640培養(yǎng)基50μl，B液：Lipo 2000 10μl+無(wú)血清1640培養(yǎng)基50μl，將A液和B液室溫靜置5min后混合，再室溫靜置20～30min，在混合液內(nèi)加入400μl無(wú)血清的1640培養(yǎng)基后室溫靜置5min，用無(wú)血清1640培養(yǎng)基或PBS清洗培養(yǎng)有卵巢癌SKOV3細(xì)胞的6孔板后分別加入混合液(其中兩孔含pIRES-miR-7重組質(zhì)粒，兩孔含pIRES空載質(zhì)粒，兩孔加相同量的無(wú)血清1640培養(yǎng)液)，4～6h后洗去無(wú)血清1640，每孔添加2ml含有10%血清的1640培養(yǎng)基，1～2d后添加G418進(jìn)行2周的篩選，將得到的細(xì)胞利用極限稀釋法傳至96孔板中，每孔約1個(gè)，并添加適當(dāng)量G418，至其長(zhǎng)出單個(gè)克隆。選出生長(zhǎng)狀態(tài)最好的細(xì)胞克隆集落進(jìn)行培養(yǎng)，并連續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)建立細(xì)胞系。利用qRT-PCR法檢測(cè)miR-7在pIRES-miR-7 SKOV3組、pIRES SKOV3組及野生型SKOV3組細(xì)胞中的表達(dá)水平。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pIRES-miR-7重組質(zhì)粒組及pIRES空載質(zhì)粒組卵巢癌SKOV3細(xì)胞，以3000個(gè)·孔-1接種于96孔板中，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，于第4天及第7天分別添加10μlCCK8，并在培養(yǎng)箱中孵育3h，于酶標(biāo)儀上檢測(cè)不同孔的吸光度值。根據(jù)所測(cè)得的吸光度值畫出生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 在接種細(xì)胞前，分別在上室加入200μl、下室加入500μl無(wú)血清培養(yǎng)基水化小室基底膜，將鋪有基質(zhì)膠的膜放在上室和下室中間，有基質(zhì)膠的一面朝上，并將趨化因子加入下室，將Transwell小室重新置于細(xì)胞板中，將無(wú)血清培養(yǎng)基預(yù)先加溫后在上室添加大約300μl，并再靜置約半個(gè)小時(shí)，然后吸走剩下的培養(yǎng)液。pIRES-miR-7 SKOV3組及pIRES SKOV3組消化計(jì)數(shù)，上室200μl種入細(xì)胞105個(gè)，下室加入500μl完全培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)16h(Transwell小室)后取出，乙醛固定后用0.1%的結(jié)晶紫進(jìn)行染色，并擦除上室的細(xì)胞后在顯微鏡下鏡檢、計(jì)數(shù)并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用graphpad prism6軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 pIRES-miR-7重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

設(shè)計(jì)miRNA-7的引物序列及酶切位點(diǎn)(NotⅠ及XbaⅠ)、miR-7、pIRES空載及pIRES-miR-7雙酶切鑒定結(jié)果顯示pIRES-miR-7構(gòu)建成功。pIRES-miR-7測(cè)序顯示目的基因插入理論值與擴(kuò)增相符。見圖1。

1、2.miR-7及pIRES空載質(zhì)粒雙酶切鑒定電泳圖；3～6.重組質(zhì)粒雙酶切鑒定電泳圖；M1.DL10000；M2.DL2000

圖1 pIRES-miR-7重組質(zhì)粒酶切鑒定

Fig 1 Identification of recombinant pIRES-miR-7 digested by enzymes

2.2 細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后miR-7表達(dá)水平

以野生型SKOV3組為對(duì)照，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-7在pIRES-miR-7 SKOV3組中表達(dá)水平顯著高于SKOV3(P<0.001)和pIRES-SKOV3(P<0.01)對(duì)照組。見圖2。

圖2 miR-7在不同細(xì)胞表達(dá)水平

Fig 2 miR-7 expression in different cells

2.3 miR-7對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響

從酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果可見，pIRES-miR-7 SKOV3組細(xì)胞的增殖速度明顯低于pIRES SKOV3組，在第4天時(shí)兩組細(xì)胞增殖速度即可見微小差異，且在逐步增大，至第7天兩組結(jié)果差異明顯。見圖3。提示miRNA-7能夠抑制SKOV3細(xì)胞的增殖能力。

圖3 miR-7對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響

Fig 3 Effect of miR-7 on SKOV3 cell proliferation

2.4 miR-7對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲能力的影響

pIRES-miR-7 SKOV3細(xì)胞的侵襲能力明顯低于pIRES SKOV3及SKOV3細(xì)胞組。見圖4，鏡下圖像見圖5。說(shuō)明過表達(dá)miRNA-7能夠降低SKOV3細(xì)胞的侵襲能力。

圖4 miR-7對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲力影響

Fig 4 Effect of miR-7 on invasiveness of SKOV3 cell

圖5 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) miR-7對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲力影響 HE×100Fig 5 Effect of miR-7 on SKOV3 cell invasiveness detected by transwell assay HE×100

3 討 論

研究證實(shí)，micro RNA在腫瘤的的自然進(jìn)程中具有極其重要的功能，其主要與靶信使RNA的堿基結(jié)合從而在很多方面起作用[5]。Webster等[6]研究證明，miRNA-7可通過調(diào)節(jié)EGFR信號(hào)途徑來(lái)抑制數(shù)種人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展；Zhao等[7]研究表明，miRNA-7可抑制胃癌的轉(zhuǎn)移，但在卵巢癌中鮮有報(bào)道。在本研究中通過qRT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-7的表達(dá)在 pIRES-miR-7 SKOV3細(xì)胞中較野生型及僅轉(zhuǎn)入pIRES空載質(zhì)粒的細(xì)胞中表達(dá)水平更高，并且實(shí)驗(yàn)觀察到pIRES-miR-7 SKOV3生長(zhǎng)更緩慢，這啟發(fā)我們miRNA-7可能在卵巢癌中具有類似抑癌基因的功能。

目前，對(duì)于miR-7在腫瘤中的具體作用機(jī)制尚不確定，有大量的實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行探究。Zhang等[1，8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-7在乳腺癌中被lincRNA HOTAIR、SETDB1等抑制而表達(dá)水平下降，通過調(diào)節(jié)miR-7使其高表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Comamala等[9]證實(shí)，過表達(dá)miR-7通過靶向EGFR，阻礙 AKT 和 ERK1/2蛋白磷酸化，從而抑制卵巢癌的侵襲能力。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miRNA-7能夠明顯使SKOV3細(xì)胞的增殖及侵襲能力降低。

綜上所述，本研究表明，miRNA-7在卵巢癌SKOV3細(xì)胞系中低表達(dá)，迫使miRNA-7過表達(dá)可明顯使SKOV3細(xì)胞的增殖與侵襲等生物學(xué)特性受到抑制，然而miRNA-7在體內(nèi)對(duì)卵巢癌的效應(yīng)還需要更深入的探索。

[1] ZHANG H，CAI K，WANG J，et al.MiR-7，inhibited indirectly by lincRNA HOTAIR，directly inhibits SETDB1 and reverses the EMT of breast cancer stem cells by downregulating the STAT3 pathway [J].Stem Cells，2014，32(11)：2858-2868.

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Effects of miR-7 over expression on the abilities of proliferation and invasion of ovarian cancer SKOV3 cells

JU Shao-long1，WU Di2，ZHANG Ying1，DOU Jun2

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China；2.DepartmentofPathogenicBiologyandImmunologySchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective：To explore the effects of miR-7 over expression on the abilities of proliferation and invasion of ovarian cancer SKOV3 cells. Methods： The target gene miR-7 was amplified from human genome，digested and linked to the plasmid pIRES.The pIRES-miR-7 recombined plasmid and pIRTS plasmid were respectively transferred into SKOV3 ovarian cancer cells，and miR-7cellular expression was confirmed by qRT-PCR.CCK8 and Transwell assays were used to detect the abilities of proliferation and invasion in SKOV3 cells stably transfected with the recombinant pIRES-miR-7.Results and Conclusion： The recombinant pIRES-miR-7 is successfully constructed，and transfected into SKOV3 cells.The expression of miR-7 in SKOV3 cells stably transfected with pIRES-miR-7 is significantly higher than that in SKOV3 cells stably transfected with pIRES (P<0.01) and in wild type SKOV3 cells (P<0.001).In addition，the abilities of proliferation and migration in SKOV3 cells stably transfected with the recombinant pIRES-miR-7 is lower than that in pIRES SKOV3 and SKOV3 cells.The overexpression of miR-7 inhibits the abilities of proliferation and invasion in ovarian cancer SKOV3 cells.

ovarian cancer cells；miR-7；over expression；proliferation；invasion

2016-07-10

2016-08-31

2015年國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃 (1510286102)

巨少龍(1993-)，男，陜西寶雞人，在讀醫(yī)學(xué)專業(yè)四年級(jí)本科生。E-mail：269641430@qq.com

竇駿 E-mail：njdoujun@seu.edu.cn

巨少龍，吳迪，張瑩，等.過表達(dá)miR-7對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖及侵襲的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2017，36(1)：30-33.

R737.31

A

1671-6264(2017)01-0030-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.008