凍融循環對肝癌新鮮凍存組織RNA完整性的影響

張園，侯彥深，宋佳，董翔

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院 1.腫瘤防治研究所，2.麻醉科，新疆維吾爾自治區 烏魯木齊 830011)

·論 著·

凍融循環對肝癌新鮮凍存組織RNA完整性的影響

張園1，侯彥深2，宋佳1，董翔1

(新疆醫科大學附屬腫瘤醫院 1.腫瘤防治研究所，2.麻醉科，新疆維吾爾自治區 烏魯木齊 830011)

目的：評估新鮮凍存組織解凍后RNA降解動力學變化，探討反復凍融對肝癌組織樣本質量的影響。方法：將15例肝癌患者術后組織標本各分11份，其中1份用于組織形態學驗證，另外10份于-80℃保存，取4份標本分別在凍融0、1、3、6次后提取RNA，剩余6份標本分別在室溫下放置0min(T0)、5min(T5)、15min(T15)、30min(T30)、45min(T45)及1h(T60)后進行RNA提取，采用微芯片凝膠電泳技術分析RNA完整性。結果：切片中腫瘤組織面積均超過85%，壞死組織面積均小于15%，符合國際腫瘤基因組聯盟制定的標準，且與術后病理學結果符合率達100%。不同凍融次數組織RNA完整性(RNA integrity number，RIN值)比較，差異有統計學意義(P<0.001)，而且凍融次數越多，RIN值越低(凍融循環0、1、3、6次后RIN分別為8.27±0.42、6.38±0.61、5.08±0.61、4.32±0.62)。隨解凍后RNA提取時間的延長，RNA完整性也不斷降低(T0：RIN=8.33±0.52；T5：RIN=7.95±0.48；T15：RIN=7.09±0.40；T30：RIN=5.88±0.39；T45：RIN=5.06±0.39；T60：RIN=4.40±0.30)，與T0時提取RNA比較，解凍后T30、T45、T60后提取RNA的RIN平均值顯著下降，且差異有統計學意義(P<0.001)。結論：當研究對RNA質量要求比較高時，肝癌組織解凍不應超過3次，并且在30min內提取RNA，以保證RNA的完整性。

凍融；RNA提取時間；RNA完整性

生物樣本庫中的新鮮冰凍組織經常被用于PCR、基因芯片、比較基因組雜交等分子生物學實驗，因此凍存質量對研究的可靠性尤為重要[1]。組織細胞內RNA容易降解，因此RNA檢測成為組織樣本質量鑒定的重要指標。完整性和均一性是評價RNA質量的最關鍵標準，也是下游生物學分析尤其是基因組學研究的基礎和保障。

目前，關于不同保存條件對標本影響的研究主要集中在臨床樣本檢測結果的準確性上，有關標本庫采集、儲存體系角度對樣本存儲溫度變化及反復凍融對標本質量的影響鮮有報道。本研究旨在評估新鮮凍存肝癌組織解凍后RNA降解動力學變化，探討反復凍融對肝癌組織樣本質量的影響。

1 材料與方法

1.1 主要設備

-80℃超低溫冰箱(Thermo Fisher Forma995)，液氮儲存箱(Thermo Fisher CryoPlus3)，普通小型(3L)液氮罐，干式恒溫器，低溫高速離心機(貝克曼 Microfuge 22R)，安捷倫2100生物分析儀。

1.2 主要試劑

Trizol，氯仿，異丙醇，DEPC，乙醇，RNA6000 Nano 總RNA分析試劑盒。

1.3 標本采集與分組

1.3.1 組織標本的留取 組織標本來源于新疆維吾爾自治區腫瘤防治研究所腫瘤資源庫，15例肝癌患者術前未經過任何生物、化療及放療治療，所有標本均有留取標本知情同意書及倫理審查報告。組織離體后在不影響病理診斷的前提下切取腫瘤組織標本，所留取的標本避免了出血及壞死組織，每例組織標本切成直徑約0.8cm的組織塊11份(約50mg·個-1)，其中1份經福爾馬林固定用于組織病理學鑒定，其余分別裝入凍存管中，迅速放入液氮轉移罐，整個過程在20min內完成。標本在液氮轉移罐中速凍 30min后，轉移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.3.2 分組 標本放置于25℃干式恒溫器上5min解凍，之后放入液氮速凍20min為1次凍融過程。根據凍融次數分為4組：對每例組織樣本分別在凍融0、1、3、6次后提取RNA，以凍融0次做參考，探討凍融次數對RNA提取效率和RNA質量的影響。

根據標本RNA提取延長時間分為6組：同例患者的組織標本從-80℃超低溫冰箱取出后將其中1份標本立刻置于Trizol中進行RNA提取(T0)，剩余5份標本分別在室溫下放置5min(T5)、15min(T15)、30min(T30)、45min(T45)、1h(T60)后進行RNA提取。RNA提取效率和RNA質量以T0做參考。

1.4 組織形態學檢測

將未發生凍融的1份冷凍組織標本室溫解凍，常規脫水、石蠟包埋、4～6μm切片，進行HE染色。由病理科主任醫師對切片進行病理學檢查，確認取材部位與病理學診斷的符合情況，并檢測樣本的代表性，按照國際腫瘤基因組聯盟(ICGC)腫瘤組織樣本病理質量標準評判標本質量，即腫瘤部分占80%以上，壞死細胞少于20%為合格標本。

1.5 總RNA提取在2mlEP管中放入組織標本(約50mg)，加入1ml預冷Trizol，冰上機械制成勻漿，每使用 1ml Trizol加入0.2ml氯仿，離心后取上清，加入上清液等體積的異丙醇沉淀總RNA后，用75%乙醇洗滌并用RNase-free H2O溶解總RNA。

1.6 RNA濃度和純度檢測取2μl未稀釋的RNA樣本在NanoDrop2000分光光度計上檢測260nm/280nm RNA的濃度，判斷RNA純度標準是OD260/OD280值在1.9～2.0(比值<1.8表明有DNA、蛋白質的污染，比值>2.1表明RNA降解或有異硫氰酸肌等物質的污染)。

1.7 RNA完整性檢測參照RNA 6000 Nano Labchip Kit 說明書取50～100ng RNA與1μlRNA 6000 ladder在Agilent 2100生物分析儀上進行分析，采用毛細管電泳法對28S和18S rRNA通過軟件進行量化，得到RNA完整性(RIN)的值。RIN值在10(最佳質量)～0(完全降解)之間[2]。根據文獻[3]報道，本研究將RIN≥7的樣本RNA質量評價為“優”，4≤RIN<7的樣本RNA質量評價為“中”，RIN<4的樣本RNA質量評價為“差”。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 病理質控結果

15例肝癌組織樣本，經常規切片HE染色閱片，結果顯示，所選取的組織腫瘤細胞形態良好，符合肝細胞癌典型的病理特征(圖1)。切片中腫瘤組織面積均超過85%，壞死組織面積均小于15%，符合ICGC標準，且與術后病理學結果符合率達100%。

圖1 肝癌組織樣本 HE×200

Fig1 Liver tumor tissue sample HE×200

2.2 RNA濃度和純度檢測

在NanoDrop2000分光光度計上檢測RNA的濃度，結果顯示，RNA濃度范圍在185.0～1913.8ng·μl-1之間，RNA純度A260/A280值在1.94～2.06之間。

2.3 反復凍融對RNA樣本質量的影響

不同凍融次數組織RIN值差異有統計學意義(P<0.001)，而且凍融次數越多，RIN值越低，見表1。凍融0、1、3、6次后RNA質量見表2。

表1 不同凍融循環次數肝癌組織樣本RIN值均數比較

Tab 1 Comparison the RIN value of HCC tissue sample after different freeze-thaw cycles

凍融次數nRIN值(x±s)0158.27±0.421156.38±0.613155.08±0.616154.32±0.62F值107.319P值0.000

表2 不同凍融循環次數肝癌組織樣本RNA質量評價結果

Tab 2 Assessment the RNA quality of HCC tissue sample after different freeze-thaw cycles

凍融次數RNA質量評價優中差合計0150015141101530150156010515合計1936560

2.4 新鮮凍存肝癌組織解凍后RNA降解動力學變化

檢測了15個肝癌組織樣本中6份標本的RIN值，新鮮凍存組織解凍后RNA降解動力學變化見表3。T0、T5、T15時標本RIN值平均值均大于7，T0時與T30、T45、T60時相比，RIN平均值顯著下降，差異有統計學意義(P<0.001)。

表3 新鮮凍存肝癌組織解凍后RNA降解動力學變化
Tab 3 Kinetics of RNA degradation in fresh frozen HCC tissue samples after thawing

RNA提取時間nRIN值(x±s)T0158.33±0.52T5157.95±0.48T15157.09±0.40T30155.88±0.39T45155.06±0.39T60154.40±0.30F值153.387P值0.000

圖2 經過反復凍融后樣本RIN變化趨勢圖(RIN值4和7為分界點)

Fig 2 The RIN of all tissue-samples after repetitive freezingand thawing(The RIN of 7 and 4 are chosen as the value cutoff)

3 討 論

RNA的完整性和均一性是評價RNA質量的主要標準和進行后續研究的必要前提。使用生物分析儀測量RIN值是替代傳統的凝膠評價RNA質量快速而簡單的方法，這種方法可以更好地反映RNA電泳圖中的特征，可以同時對RNA樣品進行定量及質量評估[2]。有研究顯示，組織RIN≥7的標本可用于大部分傳統分子生物學實驗，包括對標本質量要求比較高的基因序列分析，4≤RIN<7的標本可用于RT-PCR實驗，而RIN<4的標本質量會嚴重影響分子生物學的實驗結果[2，4]。

在本研究中，未經過凍融循環處理，立刻置于Trizol中進行RNA提取的標本，RIN值均大于7，RIN平均值可達8.27±0.42，標本質量最佳，也證明了本研究中標本在采集、存儲及RNA提取的實驗技術不存在問題。但是經過1次凍融肝癌組織RIN平均值降到6.38±0.61，3次凍融組織RIN平均值降到5.08±0.61，6次凍融組織RIN平均值降到4.32±0.62。說明反復凍融可影響標本RNA質量，隨著凍融次數的增多，RNA完整性越差，對后續研究的影響也越大。若后續研究對RNA樣本質量要求比較嚴格，例如miRNA芯片或miRNA定量PCR檢測，應選取未經凍融的標本作相關研究。本研究還提示，對肝癌組織標本經過3次凍融仍有使用價值，可用于RT-PCR實驗，但應避免凍融次數的繼續增多。李維凱等[5]從大鼠海馬組織提取總RNA后，測定了不同時間和溫度下保存，以及3次循環凍融后RNA完整性變化，結果表明，不同條件下保存及凍融3次后RNA完整性較首次均有所降低，本研究結果與其一致。

新鮮凍存組織在解凍后的幾分鐘甚至幾秒鐘就啟動降解程序。本研究顯示，新鮮凍存組織解凍后立即提取的RNA質量最佳，隨著解凍后時間的延長，RNA的完整性也不斷降低，但解凍15min后提取RNA的RIN均值為7.50±1.00，仍可滿足對標本質量要求較高的實驗研究。當新鮮凍存組織解凍30、45、60min后，提取RNA的RIN值下降，與解凍后5min及立即提取相比具差異有顯著性，解凍60min后的樣本RNA出現嚴重降解。因此，要避免新鮮凍存組織RNA的降解，應在解凍后15min內提取RNA。

[1] SHABIHKHANI M，LUVEY G M，WEI B，et al.The procurement，storage，and quality assurance of frozen blood and tissuebiospecimens in pathology，biorepository，and biobanksettings[J].Clin Biochem，2014，47(4-5)：258-266.

[2] SCHROEDER A，MUELLER O，STOCKER S，et al.The RIN：an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements[J].BMC Mol Biol，2006，7：3.

[3] ELLIOTT P，PEAKMAN T C，UK BIOBANK.The UK Biobank sample handling and storage protocol for the collection，processing and archiving of human blood and urine[J].Int J Epidemiol，2008，37(2)：234-244.

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[5] 李維凱，霍韜光，暢蓓，等.保存條件對大鼠海馬組織總RNA質量的影響[J].化學研究，2012，23(5)：93-96.

Effects of freeze-thawing cycles on RNA integrity in fresh frozen liver tumor tissue

ZHANG Yuan1，HOU Yan-shen2，SONG Jia1，DONG Xiang1

(1.InstituteofCancerResearch；2.DepartmentofAnesthesiology，CancerAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China)

Objective：To evaluate the kinetics of RNA degradation and the effect of quality after thawing in fresh frozen liver cancer tissue.Methods： Fifteen specimens were from the patients of liver cancer.Each specimen was divided into 11 parts，1 of them was used for histomorphological verification，the others 10 were preserved in -80℃.Four parts of the specimen underwent 0 time，1 time，3 times，6 times repetitive freezing and thawing cycles before RNA extraction.The other 6 parts were thawed at room temperature for 0min(T0)，5min(T5)，30min(T30)，45min(T45)，1h(T60) before RNA extraction.RNA integrity was analyzed by microchip gel electrophoresis.Results： The tumor tissue area in detected specimens was over 85%，necrotic tissue area was less than 15%，which meet ICGC standard.The recombination rate of postoperative pathological diagnosis was 100%.The liver tissue RIN value was significant different after different freeze-thawing cycles，and the RIN value was decreased with increasing freeze-thawing times.The RINs were 8.27±0.42，6.38±0.61，5.08±0.61，4.32±0.62 at 0，1，3 and 6 times freeze-thawing cycles，respectively.The RNA integrity was decreased with increasing delayed RNA extraction time(T0：RIN=8.33±0.52；T5：RIN=7.95±0.48；T15：RIN=7.09±0.40；T30：RIN=5.88±0.39；T45：RIN=5.06±0.39；T60：RIN=4.40±0.30).The RIN value at T0 was significantly higher than those that at T30，T45 and T60 (P<0.001).Conclusion： According to the RIN results，we recommend that liver cancer tissue should not be thawed more than 3 times for studies requiring RNA of high quality and within 30 minutes for RNA extraction.

freeze-thawing；RNA extraction time；RNA integrity

2016-06-13

2016-09-03

新疆醫科大學創新基金資助項目(XYDCX201472)

張園(1982-)，女，河北安國人，助理研究員。E-mail：18099606776@163.com

張園，侯彥深，宋佳，等.凍融循環對肝癌新鮮凍存組織RNA完整性的影響[J].東南大學學報：醫學版，2017，36(1)：58-61.

R34

A

1671-6264(2017)01-0058-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.014