血管活性腸肽對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠腦組織IFN-γ、IL-4因子含量的影響

楊元，陶濤，郭曉燕，袁正洲，呂志宇，李曉紅，李作孝

(西南醫科大學附屬醫院 神經內科，四川 瀘州 646000)

·論 著·

血管活性腸肽對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠腦組織IFN-γ、IL-4因子含量的影響

楊元，陶濤，郭曉燕，袁正洲，呂志宇，李曉紅，李作孝

(西南醫科大學附屬醫院 神經內科，四川 瀘州 646000)

目的：探討血管活性腸肽(VIP)對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)大鼠腦組織IFN-γ、IL-4含量的影響。方法：將60只健康雌性Wistar大鼠隨機分成正常對照組，EAE對照組，VIP低劑量、高劑量干預組。利用髓鞘堿性蛋白(MBP)+完全福氏佐劑(CFA)建立EAE模型。自造模當日起，每隔1d分別對VIP低、高劑量干預組大鼠腹腔注射VIP 4nmol·kg-1(0.2ml)、16nmol·kg-1(0.8ml)，正常對照組及EAE對照組則給予生理鹽水 0.8ml，連續10d。觀察大鼠發病情況、腦組織中IFN-γ、IL-4因子含量及腦組織HE染色。結果：與EAE對照組比較，VIP各劑量干預組大鼠發病潛伏期延長、進展期時間縮短、發病高峰期神經功能障礙評分(NDS)降低；腦組織中IFN-γ含量降低、IL-4含量升高，且VIP高劑量干預組效果最明顯；腦組織HE染色顯示炎癥細胞浸潤程度下降。結論:VIP通過降低腦組織中IFN-γ、升高IL-4含量減輕腦組織炎癥細胞浸潤，發揮對EAE的免疫調節作用。

血管活性腸肽；實驗性自身免疫性腦脊髓炎；IFN-γ；IL-4

多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經系統的自身免疫性疾病。Th1細胞免疫應答增強和Th2細胞免疫應答減弱是MS發病的重要機制[1]。由28個氨基酸殘基組成的血管活性腸肽(VIP)是一種非膽堿能非腎上腺能神經遞質。研究[2]表明，VIP通過與其受體結合，誘導免疫細胞增殖、分化、活化及遷移，促進Th2型抗炎因子(IL-4)的生成、抑制Th1型炎癥因子(IFN-γ)的合成及分泌，從而發揮免疫調節的作用。國內外有將VIP用于自身免疫性疾病如類風濕關節炎(RA)的治療報道[3]，但未闡明VIP在MS發病中對各種免疫細胞因子的具體作用。本實驗探討了VIP對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)大鼠腦組織IFN-γ、IL-4含量及腦組織炎癥細胞浸潤程度的影響，為臨床應用VIP治療MS提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要藥物及試劑

健康雌性Wistar大鼠60只(200～250 g·只-1、6～8周齡)、健康豚鼠10只(250～300g·只-1)，均購于西南醫科大學實驗動物中心；VIP (北京博奧森生物公司產品)；完全弗氏佐劑CFA(美國Sigma公司產品)；IFN-γ ELISA、IL-4 ELISA免疫試劑盒(雅怡生物科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫抗原的制備 斷頸處死10只豚鼠后，在無菌條件下迅速分離出脊髓，與等量的0℃生理鹽水混合后研磨成50%的全脊髓勻漿(WSCH)。將CFA與WSCH等體積混合制備抗原。

1.2.2 實驗動物分組、制模及藥物干預 將60只雌性Wistar大鼠隨機分為4組(每組15只)，將抗原注入EAE對照組，VIP低、高劑量干預組大鼠雙側后肢足掌皮下進行主動免疫，正常對照組給予等量生理鹽水(NS)。自造模當日起，VIP低、高劑量干預組每隔1d分別腹腔注射VIP4nmol·kg-1(0.2ml)、16nmol·kg-1(0.8ml)，正常對照組及EAE對照組腹腔注射0.8mlNS，連續10d。

1.2.3 實驗動物的動態觀察 自造模日起，每日上午10時由同一觀察者采用Kono′s評分標準對大鼠進行神經功能障礙評分(NDS)。

1.2.4 檢測腦組織勻漿中IFN-γ、IL-4含量 采用雙抗體夾心(ABC-ELISA)法檢測腦組織勻漿中IFN-γ、IL-4含量。

1.2.5 檢測腦組織中炎癥細胞浸潤情況 將大鼠腦組織行HE染色，觀察CNS中炎癥細胞浸潤程度。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠的發病情況

正常對照組大鼠未發病。在免疫后第14～17天，除正常對照組外各組大鼠出現典型癥狀：雙側后肢無力拖地、行走畫圈、爬行困難、精神極度衰弱、抽搐。大鼠發病潛伏期、進展期時間及高峰期NDS見表1。

2.2 各組大鼠腦組織中IFN-γ、IL-4含量變化

與正常對照組比較，EAE對照組，VIP低、高劑量干預組大鼠腦組織勻漿中IFN-γ水平升高、IL-4水平降低；與EAE對照組比較，VIP低、高劑量干預組大鼠腦組織勻漿中IFN-γ含量降低、IL-4含量升高，且高劑量組變化更明顯。見表2。

2.3 各組大鼠腦組織病理變化

正常對照組大鼠腦組織中未見EAE基本病理改變；EAE對照組及VIP各劑量干預組大鼠腦組織則出現了不同程度的炎癥細胞浸潤：炎癥細胞浸潤在小血管周圍，部分區域呈“袖套”狀改變。見表3、圖1。

組 別潛伏期/d進展期/dNDS/分EAE對照組 10.34±2.137.85±1.654.16±0.77VIP低劑量干預組14.17±1.67a6.20±1.97b3.75±0.98cVIP高劑量干預組20.73±1.98ad3.99±1.57ae2.59±0.58adF值37.4828.5418.95P值<0.01<0.05<0.01

與EAE對照組比較，aP<0.01，bP<0.05，cP>0.05；與VIP低劑量干預組比較，dP<0.01，eP<0.05

A.正常對照組；B.EAE對照組；C.VIP低劑量干預組；D.VIP高劑量干預組

組 別nIFN-γ/ng·ml-1IL-4/pg·ml-1正常對照組1511.21±0.8721.50±1.21EAE對照組1516.31±0.98a10.65±1.10aVIP低劑量干預組1513.84±0.80ab14.47±0.91acVIP高劑量干預組1512.90±0.76acd18.55±1.04aceF值88.1676.53P值<0.01<0.01

與正常對照組比較，aP<0.01；與EAE對照組比較，bP<0.05，cP<0.01；與VIP低劑量干預組比較，dP<0.05，eP<0.01

組 別nHE染色病理評分EAE對照組152.75±0.46VIP低劑量干預組152.05±0.56aVIP高劑量干預組150.84±0.51abF值21.38P值<0.01

與EAE對照組比較，aP<0.01；與VIP低劑量干預組比較，bP<0.01

2.4 相關性分析

Pearson 直線相關分析結果顯示，各組發病大鼠神經功能障礙評分與腦組織勻漿中IFN-γ因子含量呈正相關(r=0.912，P<0.01)，與IL-4因子含量呈負相關(r=-0.940，P<0.01)。各組發病大鼠腦組織病理HE染色理評分與腦組織勻漿中IFN-γ因子含量呈正相關(r=0.896，P<0.01)，與IL-4含量呈負相關(r=-0.887，P<0.01)。

3 討 論

作為Th1細胞分泌的特征性細胞因子，IFN-γ可促進Th0細胞向Th1細胞分化，增強Th1細胞免疫功能。相關體外研究[4]發現，VIP通過抑制樹突狀細胞(DC)產生IL-12、IFN-γ，誘導CD4+T細胞向Th2細胞分化，減少Th1細胞因子如IFN-γ的釋放，使得初始T淋巴細胞優先向Th2型細胞分化。

本實驗研究發現：EAE對照組，VIP低、高劑量干預組大鼠腦組織勻漿中IFN-γ的含量均較正常對照組明顯升高(P<0.01、P<0.05)；發病大鼠腦組織勻漿中IFN-γ因子含量與大鼠發病高峰期NDS及腦組織病理變化呈正相關，表明在本實驗過程中，Th1型細胞因子IFN-γ水平的升高促進了EAE疾病發生發展。同時本研究還發現：與EAE對照組比較，VIP低、高劑量干預組大鼠腦組織勻漿中IFN-γ含量明顯下降，且高劑量干預組效果最明顯。說明在EAE模型中，VIP可通過降低IFN-γ含量來抑制EAE的發病。

研究[5]表明，作為Th2細胞分泌的特征性因子IL-4，在EAE急性期明顯低于正常水平，而在恢復期IL-4水平顯著上升，IL-4通過正反饋機制增強Th2細胞功能、抑制Th1細胞活化、減輕炎性細胞因子產生，從而緩解EAE癥狀。本研究結果顯示，EAE對照組，VIP低、高劑量干預組大鼠腦組織勻漿IL-4含量均較正常對照組明顯降低；發病大鼠腦組織勻漿中IL-4因子含量與大鼠發病高峰期神經功能障礙評分及腦組織病理評分呈負相關，表明IL-4在EAE大鼠發病過程中具有保護作用。體外研究[6]發現，VIP上調未成熟DC細胞表面共刺激分子B7.2(CD86)，可刺激產生Th2細胞因子如IL-4。本實驗發現：與EAE對照組比較，VIP低、高劑量干預組大鼠腦組織勻漿IL-4含量明顯升高，且高劑量干預組效果最明顯。表明在干預EAE進展時，VIP通過上調Th2細胞水平及其分泌IL-4功能，增強Th2細胞免疫，維持Th1/Th2免疫平衡，有效地緩解EAE疾病癥狀。

[1] JAGESSAR S A，HEIJMANS N，BLEZER E L，et al.Unravelling the T-cell-mediated autoimmune attack on CNS myelin in a new primate EAE model induced with MOG34-56 peptide in incomplete adjuvant[J].Eur J Immunol，2012，42(1):217-227.

[2] DELGODO M，ROBLEDO D，RUEDA B，et al.Genetic association of vasoctive intestinal peptide receptor with rheumatoid arthritis

[J].Arthritis Rheum，2008，58(4):1010-1019.

[3] JIMENO R，GOMARIZ RP，GARN M，et al.The pathogenic Th profile of human activated memory Th cells in early rheumatoid arthritis can be modulated by VIP[J].J Mol Med (Berl)，2015，93(4)：457-467.

[4] RAI PK，ZENG W，JACKSON DC，et al.Lipidated promiscuous peptide augments the expression of MHC-II molecules on dendritic cells and activates T cells[J].Indian J Med Res，2013，138(5):744-748.

[5] LUDVIKSSON B R，SEEGERS D，RESNICK A S，et al.The effect of TGF-betal on immune responses of naive versus memory CD4+ Thl/Th2 T cells[J].Eur J Immunol，2000，30(7)：2101-2111.

[6] DELGADO M，REDUTA A，SHARM A，et al.VIP/PACAP oppositely affects immature and mature dendritic cell expression of CD80/CD86 and the stimulatory activity for CD4(+) T cells[J].J Leukoc Biol，2004，75(6):1122-1130.

Effection of vasoactive intestinal peptide on content of IFN-γ，IL-4 in EAE rats′ brain tissue

YANG Yuan, TAO Tao, GUO Xiao-yan, YUAN Zheng-zhou, Lü Zhi-yu,LI Xiao-hong, LI Zuo-xiao

(DepartmentofNeurology，AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity，Luzhou646000，China)

Objective:To explore the effects of vasoactive intestinal peptide (VIP) on the content of IFN-γ、IL-4 in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) rats′ brain tissue.Methods:Sixty healthy female Wistar rats were randomly divided into normal control group，EAE control group，VIP low-dose intervention group and VIP high-dose intervention group.Myelin basic protein (MBP) and completely adjuvant (CFA) were used to establish EAE model.Since building on，the low and high-dose VIP intervention groups were injected intraperitoneally with VIP 4nmol·kg-1(0.2ml)，16nmol·kg-1(0.8ml) every other day respectively，normal control group and EAE control group were with 0.8ml saline，10 days in a row.The incubation period，progression period and the neurological dysfunction score changes in peak of period rats were recorded，and the levels of IFN-γ，IL-4 and the pathological changes in brain were observed.Results:The incubation period was extended，the progression period was shortened，and nerve dysfunction score in peak period was decreased.The brain tissue levels of IFN-γ was reduced and IL-4 was increased in VIP intervention group，and this effect was the most obvious in high dose intervention group.The degree of infiltration of inflammatory cells in the VIP intervention groups were significantly lower than that in the EAE group.Conclusion: VIP can inhibits the infiltration of inflammatory cell by lowering the content of IFN-γ，up-regulating IL-4 the content of in brain tissue，and plays a role of immune regulation in EAE.

vasoactive intestinal peptide；experimental autoimmune encephalomyelitis；IFN-γ；IL-4

2016-04-29

2016-08-30

楊元(1988-)，女，四川達州人，住院醫師。E-mail:lsh880801@163.com

李作孝 E-mail：lzx3235@sina.com

楊元，陶濤，郭曉燕，等.血管活性腸肽對實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠腦組織IFN-γ、IL-4因子含量的影響[J].東南大學學報:醫學版，2017，36(1)：67-70.

R741.05

A

1671-6264(2017)01-0067-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.016