酒石酸布托啡諾預處理對小鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其機制

劉錦源，司林杰

(1.南京醫科大學第一附屬醫院 胸心外科，江蘇 南京 210029；2.鹽城市第一人民醫院 重癥醫學科，江蘇 鹽城 224000)

·論 著·

酒石酸布托啡諾預處理對小鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其機制

劉錦源1，司林杰2

(1.南京醫科大學第一附屬醫院 胸心外科，江蘇 南京 210029；2.鹽城市第一人民醫院 重癥醫學科，江蘇 鹽城 224000)

目的：探討酒石酸布托啡諾預處理對小鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其機制。方法：取雄性C57BL/6小鼠30只，隨機分為3組，每組10只。缺血再灌注組 (I/R組)結扎左冠狀動脈前降支(LAD)30min，再灌注6h；布托啡諾預處理組(B+I/R組) 在缺血前30min經后肢肌肉注射酒石酸布托啡諾40μg·kg-1，余處理同I/R組；假手術組 (Sham組)開胸暴露心臟，僅LAD穿線但不結扎。Sham組和I/R組小鼠在缺血前30min肌肉注射等體積生理鹽水。再灌注6h后，采集腹主動脈血樣，酶聯免疫吸附法測定血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌鈣蛋白Ⅰ(CTnⅠ)的濃度；Western blot法測定心肌組織Cleaved caspase 8、Cleaved caspase 3、p-JNK和JNK的表達；凝膠電泳遷移率(EMSA)法測定心肌組織核因子-κB(NF-κB)結合活性。結果：與Sham組比較，I/R組血清CK-MB、CTnI和TNF-α水平顯著升高 (均P<0.05)，心肌組織Cleaved caspase 8和Cleaved caspase 3蛋白表達水平、JNK磷酸化水平以及NF-κB結合活性顯著升高 (均P<0.05)；與I/R組比較，B+I/R組血清CK-MB、CTnI和TNF-α水平顯著下降 (均P<0.05)，心肌組織Cleaved caspase 8和Cleaved caspase 3蛋白表達、JNK磷酸化水平和NF-κB結合活性顯著下降 (均P<0.05)。結論：酒石酸布托啡諾預處理對小鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用，可顯著抑制I/R所致的炎癥反應和心肌細胞凋亡，其機制與阻滯JNK/NF-κB信號通路相關。

酒石酸布托啡諾；心肌再灌注損傷；阿片受體；凋亡；小鼠

心肌缺血再灌注損傷是多種心血管疾病共同的病理生理過程，在這一過程中炎癥因子和細胞凋亡起著重要作用[1]。研究表明，阿片受體激動劑嗎啡可以減輕心肌缺血再灌注損傷[2]。酒石酸布托啡諾是一種新型的阿片受體激動-拮抗劑，主要激動κ受體，部分激動δ受體，對μ受體具有激動和拮抗雙重作用，此外，還具有良好的鎮痛、鎮靜作用，但是目前國內外關于布托啡諾對心肌缺血再灌注損傷的研究較少。因此，本研究擬通過建立小鼠心肌缺血再灌注損傷模型，探討布托啡諾對心肌缺血再灌注損傷的影響及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要藥品及試劑

酒石酸布托啡諾注射液(江蘇恒瑞醫藥有限公司)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測試劑盒、肌酸激酶同工酶(CK-MB)檢測試劑盒和肌鈣蛋白I(CTnI)檢測試劑盒(南京建成生物工程公司)，Cleaved caspase 8、Cleaved caspase 3、p-JNK和JNK抗體以及NF-κB探針(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 實驗分組與動物模型制備

取雄性C57BL/6小鼠30只，清潔級，體重20～25g，8～10周齡，由南京醫科大學動物實驗中心提供[合格證號：SCXK(蘇)2002-0031]。小鼠腹腔注射5%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉，背位固定，行氣管插管并連接動物呼吸機進行機械通氣，呼吸頻率130次·min-1，潮氣量1～2ml。將30只小鼠隨機分為3組，每組10只。于小鼠胸骨左緣第3～4肋間開胸，鈍性分離肌肉及筋膜，暴露心臟。缺血再灌注組 (I/R組)在距左心耳下方約1mm處穿線(8-0 prolene絲線)結扎冠狀動脈左前降支(LAD)，持續30min后松開，然后缺血心肌再灌注6h；假手術組 (Sham組) 開胸暴露心臟，LAD僅穿線但不結扎；布托啡諾預處理組 (B+I/R組)在缺血前30min經后肢肌肉注射布托啡諾40μg·kg-1，然后結扎LAD 30min，松開絲線再灌注6h。Sham組和I/R組小鼠在結扎LAD前30min肌肉注射等體積生理鹽水。

1.3 血清指標測定

再灌注6h后，采集腹主動脈血樣，4℃下以2500r·min-1離心15min，取上清液，置冰箱內-20℃保存待測，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清TNF-α、CK-MB、CTnI的濃度。

1.4 Western blot檢測

再灌注6h采集血樣后處死小鼠，留取左心室組織，置于液氮保存備用。心肌組織總蛋白按照相應蛋白提取試劑盒 (南京凱基生物公司)說明書進行提取，用BCA法對蛋白進行定量檢測，30μg蛋白經電泳后，轉膜并封閉1h，洗膜后加一抗Cleaved caspase 8、Cleaved caspase 3、p-JNK和JNK，4℃孵育過夜。洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育1h。ECL化學發光顯色，Bio-Rad圖形分析處理系統掃描條帶及灰度檢測。

1.5 凝膠電泳遷移率檢測(EMSA)

心肌組織核蛋白按照相應蛋白提取試劑盒 (南京凱基生物公司) 說明書進行提取，用BCA法對蛋白進行定量檢測。細胞核蛋白、NF-κB探針以及EMSA結合緩沖液混勻后室溫靜置10min，行凝膠電泳及電轉膜后行紫外交聯，封閉液室溫封閉15min，洗膜后采用核酸化學發光法顯色NF-κB探針，Bio-Rad圖形分析處理系統掃描條帶及灰度檢測。

1.6 統計學處理

2 結 果

與Sham組比較，I/R組血清CK-MB、CTnI和TNF-α水平顯著升高 (均P<0.05)。與I/R組比較，B+I/R組血清CK-MB、CTnI和TNF-α水平顯著下降 (均P<0.05)。見表1。

與Sham組比較，I/R組心肌組織Cleaved caspase 8和Cleaved caspase 3蛋白表達顯著升高 (均P<0.05)。與I/R組比較，B+I/R組心肌組織Cleaved caspase 8和Cleaved caspase 3蛋白表達顯著下降 (均P<0.05)。見圖1。

組 別CK-MB/U·L-1CTnI/ng·ml-1TNF-α/ng·ml-1Sham組225±460.56±0.18183±34I/R組1109±87a2.33±0.61a796±91aB+I/R組563±49b0.98±0.24b334±65b

與Sham組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05

與Sham組比較，I/R組心肌組織JNK磷酸化水平和NF-κB結合活性顯著升高 (均P<0.05)。與I/R組比較，B+I/R組心肌組織JNK磷酸化水平和NF-κB結合活性顯著下降 (均P<0.05)。見圖2、3。

3 討 論

炎癥反應和細胞凋亡是導致心肌缺血再灌注損傷的重要病理生理機制，可引起心室重構、心力衰竭和猝死等嚴重不良事件[3]。因此，如何減輕炎癥反應、抑制心肌細胞凋亡進而保護心肌成為目前研究熱點。

研究表明，阿片類物質可與心肌細胞κ受體和δ受體結合，發揮顯著的心肌保護作用[4-5]。酒石酸布托啡諾是一種新型的阿片受體激動-拮抗劑，臨床上廣泛用于術后鎮痛、分娩鎮痛以及ICU患者鎮痛[6]，但是國內外關于布托啡諾對心肌缺血再灌注損傷的研究較少。CTnI是特異性存在于心肌細胞中的重要調節蛋白，其對診斷心肌損傷具有高度的特異性和敏感性。CK-MB也是診斷心肌損傷的指標。本研究中我們發現，I/R組小鼠血清CTnI和CK-MB水平顯著升高，表明心肌明顯受損。布托啡諾預處理可以顯著降低I/R組小鼠血清CTnI和CK-MB水平，表明布托啡諾具有心肌保護作用。

與Sham組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05

圖1 各組小鼠心肌組織Cleaved caspase 8和Cleaved caspase 3蛋白的表達

Fig 1 The expression of Cleaved caspase 8 and Cleaved caspase 3 in mouse myocardium

與Sham組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05

圖2 各組小鼠心肌組織p-JNK和JNK蛋白的表達。

Fig 2 The expression of p-JNK and JNK in mouse myocardium

與Sham組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05

圖3 各組小鼠心肌組織NF-κB結合活性

Fig 3 The NF-κB binding activity in mouse myocardium

氨基末端激酶(JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的重要成員[7]。心肌缺血再灌注損傷時JNK磷酸化水平升高，激活血管內皮核轉錄因子-κB(NF-κB)，引起一系列炎癥介質釋放[8]。其中TNF-α可促進白細胞與內皮細胞的黏附并相互作用，使中性粒細胞向心肌缺血再灌注區域的浸潤增加，導致炎癥介質進一步釋放，引起心肌損傷[9]。TNF-α既是一種重要的炎癥因子，也是一種重要的死亡信號，可誘導心肌細胞凋亡。TNF-α可以在細胞表面與其受體結合，通過一系列信號轉導，激活凋亡誘導蛋白Caspase 8，進一步活化Caspase 3，最終誘導心肌細胞凋亡[10]。本研究中我們發現，I/R組小鼠血清TNF-α水平顯著升高，同時心肌組織中Cleaved caspase 8和Cleaved caspase 3蛋白表達明顯增加，表明I/R小鼠存在明顯的炎癥反應和心肌細胞凋亡。布托啡諾預處理可以顯著降低I/R小鼠血清TNF-α水平，抑制心肌組織中Cleaved caspase 8和Cleaved caspase 3的表達，提示布托啡諾預處理可通過抑制炎癥反應和細胞凋亡發揮心肌保護作用。進一步研究顯示，I/R組心肌組織JNK磷酸化水平和NF-κB結合活性顯著升高，布托啡諾預處理顯著降低I/R組心肌組織JNK磷酸化水平和NF-κB結合活性。提示布托啡諾通過與其受體結合，抑制JNK/NF-κB信號活化，減少炎癥介質釋放，抑制心肌細胞凋亡，從而減輕心肌缺血再灌注損傷。

綜上所述，布托啡諾預處理對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用，可顯著抑制I/R所致的炎癥反應和心肌細胞凋亡，其機制與阻滯JNK/NF-κB信號通路相關。

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Effects of butorphanol pretreatment on myocardial ischemia-reperfusion injury and it′s mechanisms in mice

LIU Jin-yuan1，SI Lin-jie2

(1.DepartmentofThoracicandCardiovascularSurgery，theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity，Nanjing210029，China；2.DepartmentofIntensiveCareMedicine，theFirstPeople′sHospitalofYancheng，Yancheng224000，China)

Objective: To study the protective effects and it′s mechanisms of butorphanol on myocardial ischemia-reperfusion injury in mice.Methods:C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups (10 in each group).Myocardial I/R was induced by occlusion of left anterior descending (LAD) artery for 30min，followed by reperfusion for 6h in I/R and B+I/R groups.At 30min before ischemia，butorphanol 40μg·kg-1was injected via the hind limb muscle in group B+I/R.While the equal volume of normal saline was injected in group sham and I/R.Blood samples were taken from the abdominal aorta to determine the concentrations of serum TNF-α，CK-MB and CTnI by ELISA.The proteins expression of Cleaved caspase 8，Cleaved caspase 3，p-JNK and JNK were detected by Western blot.The NF-κB binding activity was detected by EMSA.Results：The levels of serum CK-MB，CTnI and TNF-α were significantly higher in group I/R than those in group sham(allP<0.05).The expression of Cleaved caspase 8，Cleaved caspase 3，p-JNK，and NF-κB binding activity were also significantly increased in group I/R(allP<0.05). The levels of serum CK-MB，CTnI and TNF-α in group B+I/R were significantly reduced(allP<0.05).The expression of Cleaved caspase 8，Cleaved caspase 3，p-JNK and NF-κB were also inhibited in group B+I/R(allP<0.05).Conclusion: Butorphanol pretreatment can protect the myocardium against I/R injury in mice.The protective mechanisms of butorphanol may be through inhibiting JNK/NF-κB signaling pathway.

butorphanol；myocardial reperfusion injury；opioid receptors；apoptosis；mice

2016-05-08

2016-09-03

劉錦源(1983-)，男，江蘇建湖人，主治醫師。E-mail：14118762@qq.com

司林杰 E-mail：silinjie001@163.com

劉錦源，司林杰.酒石酸布托啡諾預處理對小鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及其機制[J].東南大學學報:醫學版，2017，36(1)：74-77.

R452

A

1671-6264(2017)01-0074-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.018