綿羊肺炎支原體多表位融合基因 MO-meAg1的構(gòu)建、表達(dá)及重組蛋白免疫原性分析

田路路，孟慶玲，喬 軍，陳 誠(chéng)，劉田莉，盧海亭，張星星，貢莎莎，才學(xué)鵬 ，陳創(chuàng)夫

(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,新疆石河子 832003; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所,蘭州 730046)

綿羊肺炎支原體多表位融合基因 MO-meAg1的構(gòu)建、表達(dá)及重組蛋白免疫原性分析

田路路1，孟慶玲1，喬 軍1，陳 誠(chéng)1，劉田莉1，盧海亭1，張星星1，貢莎莎1，才學(xué)鵬2，陳創(chuàng)夫1

(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,新疆石河子 832003; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所,蘭州 730046)

為獲得具有良好免疫原性的綿羊肺炎支原體(MO)重組蛋白，利用ABCpred等軟件預(yù)測(cè)分析MO EF-P、PDHA、P97相似蛋白和EF-Ts蛋白的優(yōu)勢(shì)線性抗原表位，構(gòu)建多表位融合基因 MO-meAg1，合成后將其亞克隆至表達(dá)載體pET-32a(+)，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a(+)- MO-meAg1。將pET-32a(+)- MO-meAg1轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后檢測(cè)重組蛋白反應(yīng)原性和免疫原性。SDS-PAGE結(jié)果顯示，MO-meAg1重組蛋白分子質(zhì)量約34.5 ku；Western blot分析結(jié)果顯示，該重組蛋白可被MO陽(yáng)性血清特異性識(shí)別，具有良好的反應(yīng)原性。小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，重組蛋白MO-meAg1具有較強(qiáng)的免疫原性，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗血清其間接血凝效價(jià)可達(dá)1∶128以上。獲得的多表位融合蛋白MO-meAg1為綿羊支原體肺炎的免疫學(xué)診斷及新型疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

綿羊肺炎支原體；抗原表位；多表位融合基因；表達(dá)

支原體是迄今為止已知的一類缺少細(xì)胞壁并能夠自我復(fù)制的最小原核微生物。中國(guó)目前流行的羊支原體肺炎主要是由綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae,MO)引起的，綿羊或山羊均有易感性，其主要感染1～3月齡羔羊。支原體感染可引起綿羊或山羊出現(xiàn)胸膜肺炎，臨床癥狀主要表現(xiàn)為流鼻涕、咳嗽、呼吸困難、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、漸進(jìn)性消瘦等[1-2]，感染MO的羊主要出現(xiàn)肺間質(zhì)增生性肺炎[3]。該病在全球均有分布，給世界養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。

支原體缺乏細(xì)胞壁，MO主要抗原成分存在于細(xì)胞膜上，主要為蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)MO的抗原特性進(jìn)行探索，初步證實(shí)P97、P113、延伸因子Tu (EF-Tu)、丙酮酸脫氧酶E1-α亞單位(PDHA)等蛋白均具有一定的免疫原性[6-9]，然而由于支原體的抗原成分比較復(fù)雜，至今尚未鑒定出MO保護(hù)性抗原。為獲得具有強(qiáng)免疫原性的MO抗原蛋白，本研究在構(gòu)建MO基因組表達(dá)文庫(kù)的基礎(chǔ)上，利用篩選出的MO免疫相關(guān)抗原基因，通過(guò)預(yù)測(cè)優(yōu)勢(shì)抗原表位構(gòu)建多表位融合基因 MO-meAg1，制備重組蛋白MO-meAg1，證實(shí)該重組蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性和反應(yīng)原性，為MO診斷試劑和新型疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及試劑

E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)和pET-32a(+) 質(zhì)粒由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存。DNA Marker、核酸限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、T4DNA Ligase和蛋白Marker購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自諾維森(北京)生物科技有限公司；MO正向間接血凝診斷試劑盒由中國(guó)農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所提供。丙烯酰胺(Acrylamide)、硝酸纖維素膜購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG購(gòu)自中彬金橋公司； Western blot膜封閉液、增強(qiáng)型HRB-DAB底物顯色試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；昆明系雌鼠由石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供。

1.2 MO蛋白優(yōu)勢(shì)線性抗原表位的預(yù)測(cè)

運(yùn)用在線軟件ABCpred(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)、BepiPred 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred)、Immunomedicine Group(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)及DNAStar-Protean[10]分析綿羊肺炎支原體SC01株基因序列(登錄號(hào)：NZ_AFHO00000000)的EF-P、PDHA、P97相似蛋白和EF-Ts蛋白的抗原表位，預(yù)測(cè)篩選優(yōu)勢(shì)抗原表位，選取排列組合得分較高的1組，用于構(gòu)建多表位融合基因。

1.3 多表位融合基因的構(gòu)建策略

將篩選出的MO抗原蛋白優(yōu)勢(shì)表位根據(jù)不同表位(氨基酸序列)對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，通過(guò)與柔性肽編碼序列按照一定順序進(jìn)行連接，運(yùn)用在線軟件Racc(http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/)[11]對(duì)多表位融合基因中的大腸桿菌稀有密碼子預(yù)測(cè)分析，將稀有密碼子優(yōu)化為大腸桿菌偏愛(ài)密碼子后，得到含有MO多表位的融合抗原基因(命名為MO-meAg1)，送至華大基因生物公司進(jìn)行基因合成。

1.4 多表位融合基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

利用Primer 5.0軟件對(duì)合成的多表位融合基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引入EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)，用于擴(kuò)增多表位融合基因 MO-meAg1，引物由華大基因生物公司合成。上游引物MO-meAg1-E-F：5′-CCGGAATTCATGA ATTTTGAAAAGAAACCTG-3′；下游引物MO-meAg1-X-R：5′-CCGCTCGAGTTATTCTGTTGTCTCAGCATCT-3′ (下劃線處分別為EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，斜體為保護(hù)性堿基)。PCR采用20 μL反應(yīng)體系：ddH2O 7 μL，2×PCR Mix 10 μL，模板2 μL，上、下游引物各0.5 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性94 ℃ 40 s，退火60 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 50 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，對(duì)PCR回收產(chǎn)物與pET-32a(+) 質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切，分別回收目的片段和載體片段，4 ℃過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α,培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定。取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-32a(+)- MO-meAg1。

1.5 多表位融合基因重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及免疫印跡分析

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-32a(+)- MO-meAg1轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中，次日挑取單個(gè)菌落37 ℃搖菌過(guò)夜，取 200 μL菌液接種于20 mL含Amp抗性的液體LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600 nm達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加20 μL 1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo) 2、4、6和8 h，各收1 mL菌液，同時(shí)設(shè)置空載體和未加IPTG誘導(dǎo)的重組菌做陰性對(duì)照，12 000 r/min離心1 min，留菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析；以綿羊MO陽(yáng)性血清為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG為二抗，進(jìn)行Western blot 分析。

1.6 多表位融合基因重組蛋白的免疫原性分析

將10只25日齡的昆明系小鼠分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，試驗(yàn)組： MO-meAg1重組蛋白溶液與弗氏完全佐劑按體積比1∶1乳化；對(duì)照組：PBS緩沖液與弗氏完全佐劑按體積比1∶1乳化。采用皮下多點(diǎn)注射方式進(jìn)行首次免疫，免疫劑量為200 μL。首次免疫后14 d采用同樣免疫方式進(jìn)行二免，佐劑換成弗氏不完全佐劑。二免后7 d采血，分離血清，參照MO間接血凝診斷試劑盒，測(cè)定小鼠血清抗體效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原表位預(yù)測(cè)及多表位融合基因的合成

運(yùn)用在線軟件ABCpred、BepiPred 1.0 Server、Immunomedicine Group和DNAStar-Protean預(yù)測(cè)EF-P、PDHA、P97相似蛋白和EF-Ts蛋白的抗原表位，篩選出優(yōu)勢(shì)抗原表位(表1)。按一定順序進(jìn)行連接，選擇各項(xiàng)比分較高的1組，得到多表位融合基因 MO-meAg1(圖1)，將其稀有密碼子替換為大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，送至華大基因生物公司進(jìn)行基因合成。

2.2 多表位融合基因重組表達(dá)載體的鑒定

用特異性引物成功擴(kuò)增得到396 bp的 MO-meAg1基因，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)目的片段與pET-32a(+)質(zhì)粒于37 ℃分別雙酶切，分別回收，用T4DNA連接酶過(guò)夜連接，將鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中，通過(guò)菌液PCR篩選出陽(yáng)性重組菌(圖2)。雙酶切得到目的片段和pET-32a(+)片段(圖3)，表明重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)- MO-meAg1構(gòu)建成功。

表1 抗原蛋白的優(yōu)勢(shì)線性表位序列

從上至下每3行為一組，在同一組中第1行為氨基酸序列，第2行為優(yōu)化后的核苷酸序列，第3行為原始核苷酸序列 From top to bottom each of three line is a group, in the same group the first line is amino acid sequence, the second line is optimized nucleotide sequence, and the nucleotide sequence of the third line is original nucleotide sequence；柔性氨基酸序列(字符邊框) Flexible amino acid sequence(Character border); 大腸桿菌稀有密碼子(紅色字體) E.coli rare codon(Red font); 優(yōu)化后的核苷酸序列(雙畫(huà)線) Optimized nucleotide sequence (Double line)

M.Marker DL2000;1～3.PCR產(chǎn)物 PCR products

M.Marker DL 5000; 1～3.pET-32a(+)- MO-meAg1雙酶切產(chǎn)物 The products from pET-32a(+)-MO-meAg1 by double enzyme digestion

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和Western blot分析

重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)- MO-meAg1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，篩選陽(yáng)性菌株，pET-32a(+)- MO-meAg1重組菌在IPTG誘導(dǎo)后8 h時(shí)目的蛋白表達(dá)量達(dá)最高，重組蛋白分子質(zhì)量為35.4 ku，主要以包涵體形式存在，且表達(dá)量較高。Western blot結(jié)果表明重組蛋白可被MO陽(yáng)性血清識(shí)別，說(shuō)明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的反應(yīng)原性(圖4)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Protein Marker; 1～4.pET-32a(+)- MO-meAg1重組菌IPTG誘導(dǎo)8 h、6 h、4 h、2 h的表達(dá)產(chǎn)物 pET-32a(+)- MO-meAg1 plasmid induced 8，6，4，2 h by IPTG; 5.空白對(duì)照 Negative control; 6.pET-32a(+)質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物 pET-32a(+)plasmid induced by IPTG; 7.純化的重組蛋白的Western blot分析結(jié)果 Western blotting of the purified recombinant using antiserum of M.ovipneumoniae

2.4 重組蛋白的小鼠免疫試驗(yàn)

將純化的MO-meAg1重組蛋白與弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，采取皮下多點(diǎn)注射，對(duì)25日齡的昆明系雌鼠進(jìn)行第1次免疫接種；14 d后，將重組蛋白與弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，對(duì)小鼠第2次免疫，二免后7 d采集血液，分離血清，經(jīng)MO間接血凝檢測(cè)，MO-meAg1能刺激機(jī)體產(chǎn)生相對(duì)很強(qiáng)的免疫反應(yīng)，抗體效價(jià)高于1∶128(圖5)。

(-).陰性對(duì)照 Negative control; ( + ).陽(yáng)性對(duì)照 Positive control;MO-meAg1.重組蛋白免疫后小鼠的血清 Serum of mice immunized with recombinant protein; 20～2-7.血清滴度 Serum titer

3 討 論

MO感染可降低綿羊的免疫力，繼發(fā)其他病原菌感染，造成較高的死亡率。因此，開(kāi)展綿羊支原體肺炎的防控研究具有重要意義。近年來(lái)，盡管國(guó)內(nèi)外一直致力于MO疫苗的研究工作，但尚未取得突破性進(jìn)展。裴艷濤[12]通過(guò)SDS-PAGE和蛋白雙向電泳技術(shù)分析MO Y-98和HD-1株的菌體蛋白，結(jié)果顯示菌體蛋白的分子質(zhì)量為14～100 ku，主要由9～10種蛋白質(zhì)組成；蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳結(jié)果顯示，有 21個(gè)蛋白為Y-98和HD-1株共同蛋白；免疫印跡試驗(yàn)初步確定，分子質(zhì)量為74.2、53.6、40.5和26.5 ku的蛋白質(zhì)具有抗原性，可能為Y-98的主要抗原蛋白。許健等[13]利用雙向電泳及免疫印跡的方法對(duì)MO MoGH3-3株抗原蛋白進(jìn)行篩選，篩選到延伸因子Tu (Elongation factor Tu,EF-Tu)、丙酮酸脫氧酶E1-a亞單位(PDHA)2個(gè)抗原蛋白；將PDHA蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，并利用綿羊肺炎支原體高免血清進(jìn)行免疫印跡，結(jié)果證實(shí)該重組蛋白PDHA具有較好的免疫學(xué)活性。許健等[8]將PDHA基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，對(duì)全基因合成并首次成功克隆表達(dá)MOPDHA基因，重組蛋白免疫小鼠發(fā)現(xiàn)血清抗體顯著升高，證明重組 PDHA 蛋白具有較好的免疫學(xué)活性。

構(gòu)建多表位抗原被認(rèn)為是一種能增強(qiáng)蛋白抗原性的策略之一。該方法已經(jīng)用于多種病原的保護(hù)性抗原研究中[14-17]。采用人工合成的方法將多個(gè)不同優(yōu)勢(shì)抗原表位串聯(lián)起來(lái)，構(gòu)建具有多種表位肽的復(fù)合多價(jià)表位疫苗，該方法可以有效增強(qiáng)抗原多肽的免疫原性。多表位抗原可同時(shí)攜帶多個(gè)目標(biāo)抗原以及輔助型表位[18-19]，然而表位的預(yù)測(cè)、篩選方法以及表位的排列順序需優(yōu)化組合，才能達(dá)到預(yù)期的效果。吳紹強(qiáng)等[20]利用分子生物學(xué)軟件分析FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1～VP3上可能的抗原表位，并人工合成 8 條表位多肽，通過(guò)ELISA試驗(yàn)和合成肽免疫小鼠檢測(cè)，結(jié)果顯示其中 6 條多肽能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。張軒[21]對(duì)MO的EF-Tu基因進(jìn)行優(yōu)化、合成并進(jìn)行原核表達(dá)，Western blot 檢測(cè)和動(dòng)物免疫試驗(yàn)，證明其具有較好的免疫原性；將篩選出的MO EF-Tu、PDHA 和 HSP70 的優(yōu)勢(shì)表位串聯(lián)融合，制成多表位疫苗，該重組蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生很好的體液免疫，還能誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生細(xì)胞免疫。

本研究在構(gòu)建MO基因組表達(dá)文庫(kù)的基礎(chǔ)上，利用篩選出的MO免疫相關(guān)蛋白基因，選取分布于MO EF-P、PDHA、P97相似蛋白和EF-Ts上的優(yōu)勢(shì)表位，經(jīng)柔性氨基酸串聯(lián)融合，成功構(gòu)建多表位融合基因 MO-meAg1，并制備重組蛋白MO-meAg1。Western blot結(jié)果顯示，可被MO陽(yáng)性血清特異性識(shí)別，具有較強(qiáng)的反應(yīng)原性。小鼠免疫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該重組蛋白能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的特異性抗體，為MO診斷試劑和新型疫苗的研發(fā)奠定前期基礎(chǔ)。

Reference：

[1] WOUBIT S,LORENZON S,PEYRAUD A,etal.A specific PCR for the identification ofMycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae,the causative agent of contagious caprine pleuropneumonia (CCPP) [J].VeterinaryMicrobiology,2004,104(1/2):125-132.

[2] BOCKLISCH H,PFUTZNER H,ZEPEZAUER V.Natural and experimental infections of lambs withMycoplasmaovipneumoniae[J].ArchivfurexperimentelleVeterinarmedizin,1989,43(5):755-761.

[3] THIAUCOUYT F,BOISKE G.Contagious caprine pleuropneumonia and other pulmonary mycoplasmoses of sheep and goats [J].Revuescientifiqueettechnique(InternationalOfficeofEpizootics),1996,15(4):1397-1414.

[4] PARHAM K,CHURCHWARD C P,MCAULIFFE L,etal.A high level of strain variation within theMycoplasmaovipneumoniaepopulation of the UK has implications for disease diagnosis and management [J].VeterinaryMicrobiology,2006,118(1/2):83-90.

[5] MACKAY J M K,NISBET D I,FOGGIE A.Isolation of pleuropneumonia-like organisms (Genusmycoplasma) from case of sheep pulmonary adenomatosis (SPA) [J].VeterinaryRecord,1963,75(21):550-551.

[6] 楊發(fā)龍,張煥容,湯 承,等.綿羊肺炎支原體 p113基因的序列分析及功能預(yù)測(cè) [J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,34(1):117-121.

YANG F L,ZHANG H R,TANG CH,etal.Sequence analysis and functional prediction ofMycoplasmaovipneumoniaep113 gene [J].JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity,2013,34(1):117-121(in Chinese with English abstract).

[7] 尹正軍,岳 華,湯 承.綿羊肺炎支原體延伸因子Tu基因的分子特性分析 [J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015,46(2):288-294.

YIN ZH J,YUE H,TANG CH.Molecular characterization of the elongation factorTugene inMycoplasmaovipneumoniae[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica,2015,46(2):288-294(in Chinese with English abstract).

[8] 許 健,儲(chǔ)岳峰,高鵬程,等.綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae)丙酮酸脫氫酶E1-α亞單位基因(pdha)的克隆、表達(dá)及其免疫學(xué)活性測(cè)定 [J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2012,20(3):275-282.

XU J,CHU Y F,GAO P CH,etal.Cloning and expression of Pyruvate Dehydrogenase E1-α Subunit gene(pdha) inMycoplasmaovipneumoniaeand its immunologic activity evaluation [J].JournalofAgriculturalBiotechnology,2012,20(3):275-282 (in Chinese with English abstract).

[9] 王建昌.綿羊肺炎支原體山東株的分離鑒定和標(biāo)準(zhǔn)株外膜蛋白特性研究 [D].山東泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

WANG J CH.Isolation and identification ofMycoplasmaovipneumoniaefrom Shandong and studies on out membrane protein of standard strain Y98 [D].Tai’an Shandong:Shandong Agricultural University,2007(in Chinese with English abstract).

[10] MA X M,ZHOU X T,ZHU Y J,etal.The prediction of T-and B-combined epitope and tertiary structure of the Eg95 antigen ofEchinococcusgranulosus[J].ExperimentalandTherapeuticMedicine,2013,6(3):657-662.

[11] SHARP P M,LI W H.Codon usage in regulatory genes inEscherichiacolidoes not reflect selection for ‘rare’ codons [J].NucleicAcidsResearch,1986,14(19):7737-7749.

[12] 裴艷濤.綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株Y98蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜的構(gòu)建及其抗原性研究 [D].河北保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

PEI Y T.The establissshment of two-dimensional electrophoresis and study on the Antigenicity ofMycoplasmaovipneumoniaeY98 [D].Baoding Hebei:Agricultural University of Hebei Province,2004(in Chinese with English abstract).

[13] 許 健,儲(chǔ)岳峰,高鵬程,等.綿羊肺炎支原體免疫蛋白質(zhì)組學(xué)的初步研究 [J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2012,42(2):150-153.

XU J,CHU Y F,GAO P CH,etal.Preliminary study on immunoproteomics ofMycoplasmaovipneumoniae[J].ChineseVeterinaryScience,2012,42(2):150-153(in Chinese with English abstract).

[14] PAUL S,PIONTKIVSKA H.Discovery of novel targets for multi-epitope vaccines:screening of HIV-1 genomes using association rule mining [J].Retrovirology,2009,6 (1):1-12.

[15] LI P,CAO R B,ZHENG Q S,etal.Enhancement of humoral and cellular immunity in mice against Japanese encephalitis virus using a DNA prime-protein boost vaccine strategy [J].VeterinaryJournal,2010,183(2):210-216.

[16] SANTIVANEZ S J,ARIAS P,PORTOCARRERO M,etal.Serological diagnosis of lung cystic hydatid disease using the synthetic p176 peptide [J].ClinicalandVaccineImmunology,2012,19(6):944-947.

[17] 何 玲,陳瑞愛(ài),羅滿林,等.多表位基因工程疫苗的研究進(jìn)展 [J].廣東畜牧獸醫(yī)科技,2011,36(2):3-5.

HE L,CHEN R A,LUO M L,etal.Advance on research of transgenic multi-epitope vaccine [J].GuangdongJournalofAnimalandVeterinaryScience,2011,36(2):3-5(in Chinese).

[18] 張有峰,王紅寧,黃 勇,等.多表位疫苗的構(gòu)建策略及其在動(dòng)物疫苗中的應(yīng)用 [J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2008,10(2):29-33.

ZHANG Y F,WANG H N,HUANG Y,etal.Construction strategy for multi-epitope vaccine and its application in animal vaccine [J].JournalofAgriculturalScienceandTechnology,2008,10(2):29-33(in Chinese with English abstract).

[19] 朱翠明.肺炎支原體P1C蛋白免疫學(xué)活性及plcDNA融合疫苗的初步研究 [D].長(zhǎng)沙:中南大學(xué),2012.

ZHU C M.Study on immunocompetence ofMycoplasmapneumoniaeP1C protein and plc DNA vaccine fused with interleukine 2 or B subunit ofEscherichiacoliheat-labile enterotoxin [D].Changsha:Central South University,2012(in Chinese with English abstract).

[20] 吳紹強(qiáng),李亞靜,王彩霞.南非Ⅱ型口蹄疫病毒抗原表位的篩選及抗原性分析 [J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2010,30(12):1638-1641.

WU SH Q,LI Y J,WANG C X.Screening of major epitopes of foot-and-mouth disease virus type SATⅡ and their antigenicity analysis [J].ChineseJournalofVeterinaryScience,2010,30(12):1638-1641(in Chinese with English abstract).

[21] 張 軒.綿羊肺炎支原體多表位疫苗的研究及免疫試驗(yàn) [D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2013.

ZHANG X.Research and immune experiments of multi-epitope vaccine ofMycoplasmaovipneumoniae[D].Beijing:Chinese Academy of Agricultural Sciences,2013(in Chinese with English abstract).

(責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Construction,Expression and Reactionogenicity of Multi-epitope Fusion Gene ofMycoplasmaovipneumoniae

TIAN Lulu1,MENG Qingling1,QIAO Jun1,CHEN Cheng1,LIU Tianli1,Lü Haiting1, ZHANG Xingxing1,GONG Shasha1,CAI Xuepeng2and CHEN Chuangfu1

(1.College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi Xinjiang 832003,China; 2.Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730046,China)

To develop highly specific and sensitive antigen ofMycoplasmaovipneumoniae(MO),the dominant linear antigen epitopes of EF-P,PDHA,P97-like protein and EF-Ts using ABCpred softwares were analyzed,and then multi-epitope fusion gene MO-meAg1 was constructed.It was synthesized and subcloned to pET-32a (+) to generate pET-32a(+)- MO-meAg1.Then the pET-32a(+)- MO-meAg1 was transformed into competent cells ofE.coliBL21 (DE3) for expression after inducing by IPTG.The reactogenicity and immunogenicity of recombinant were analyzed,respectively.The results of SDS-PAGE showed that expressed MO-meAg1 was about 35.4 ku.The analysis of Western blot showed that recombinant MO-meAg1 can be specifically recognized by anti-MO positive serum,displaying strong reactionogenicity.The results of immunization test in mice showed that recombinant MO-meAg1 had high immunogenicity,which can induce the specific antibody with indirect hemagglutination titer of 1∶128.The results showed that MO-meAg1 is a promising antigen,which provided a potentially valuable antigen for the development of the immunological diagnostic method and vaccine against MO infection.

Mycoplasmaovipneumoniae; Antigen epitopes; Multi-epitope fusion gene; Expression

TIAN Lulu,female,master student.Research area:pathogenic molecular biology.E-mail:928929323@qq.com

QIAO Jun,male,Ph.D,professor.Research area:pathogenic molecular biology.E-mail:qj710625@163.com

日期：2017-05-22

2016-04-27

2016-05-12

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)(2014DFR31310)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31360596，30960274)。

田路路，女，碩士研究生，從事病原分子生物學(xué)研究。E-mail:928929323@qq.com

喬 軍，男，博士，教授，主要從事畜禽病原分子生物學(xué)研究。E-mail:qj710625@163.com

S858.26

A

1004-1389(2017)05-0678-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170522.0857.010.html

Received 2016-04-27 Returned 2016-05-12

Foundation item The International Science and Technology Cooperation Program of China(No.2014DFR31310);National Natural Science Foundation of China (No.31360596，30960274).