二穗短柄草 FRUITFULL1基因表達分析及RNA干擾和過表達載體的構建

李海峰，韓 英，王冰華

(1.新疆農業職業技術學院，新疆昌吉 831100；2.旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，西北農林科技大學 農學院，陜西楊凌 712100)

二穗短柄草 FRUITFULL1基因表達分析及RNA干擾和過表達載體的構建

李海峰1,2，韓 英2，王冰華2

(1.新疆農業職業技術學院，新疆昌吉 831100；2.旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，西北農林科技大學 農學院，陜西楊凌 712100)

為了揭示 BdFUL1的生物學功能，利用生物信息學和分子生物學方法，分析二穗短柄草轉錄因子 FRUITFULL1-2( BdFUL1-2)的結構、序列特征以及與不同植物 AP1/FUL的親緣關系，構建進化樹。利用定量RT-PCR等分子生物學方法，分析非生物逆境和外源激素處理條件下兩個轉錄本 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的表達水平。結果表明： BdFUL1屬于典型的植物MADS-box基因，與小麥的 WFUL1有很近的親緣關系；在高溫、低溫、干旱脅迫以及不同激素ABA、6-BA和SA處理下， BdFUL1-1的表達水平顯著升高，暗示 BdFUL1可能通過激素信號傳導而參與響應非生物脅迫。同時，構建 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的RNA干擾和過表達載體。

短柄草；FRUITFULL；非生物脅迫；RNA干擾；過表達

FUL(FRUITFULL) 基因屬于植物 AP1/FUL的FUL亞家族，是被子植物所特有的[1]。在模式植物擬南芥，糧食作物水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、小麥(Triticumaestivum)，果蔬類作物番茄(Solanumlycopersicum) 基因組中都有FUL同源基因存在。在木本植物桃樹(Prunuspersica)、蘋果(MalusdomesticaBorkh) 和葡萄(Vitisvinifera) 等基因組中也發現有FUL同源基因[2]。

擬南芥中,FRUITFULL(FUL)基因和APETALA1(AP1)以及CAL一起調控花分生組織的發育。同時，在花發育早期和花發育晚期，FUL基因分別調控花序分生組織和心皮及角果的發育[3]。

在普通小麥中有3個FUL-LIKE同源基因： WFUL1(VRN1)、 WFUL2和 WFUL3。 WFUL1(VRN1) 是應答低溫誘導、參與春化作用的特征基因[4]； WFUL2和B類以及E類基因相互作用，可能具有A類基因的功能。進一步研究表明 WFUL1可能通過上調 WFUL3基因，促進植物開花[5]。

水稻基因組中有3個FUL-LIKE亞家族成員，分別為 OsMADS14、 OsMADS15、 OsMADS18。 OsMADS15突變體dep內稃皺縮，嚴重失去內稃的主要結構，而只發育形成兩側的邊緣結構，同時外稃和穎片伸長[6]，這說明 OsMADS15/DEP在內稃的發育上起著主要作用。另外， OsMADS14、 OsMADS15、 OsMADS18和 OsMADS34冗余的調控營養階段向生殖階段的過渡[7]。

二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)是一種廣泛生長在溫帶的一年生草類植物。由于體型矮小，易于種植，生命周期短，基因組比較小等特點，2001年Draper等率先建議把短柄草作為模式植物開展研究[8]。二倍體基因型 Bd-21基因組測序已經完成，預測到25 532個編碼蛋白質的基因[9]。

短柄草基因組中有3個FUL-LIKE基因，分別為 BdFUL1、 BdFUL2a和 BdFUL2b基因[10]。其中 FUL1和水稻中的 OsMADS14同源。在前期研究中，竇艷華等[11]克隆二穗短柄草 BdFUL1基因的cDNA序列，分析該基因的可變剪接和表達模式。在此基礎上，本研究分析高溫、低溫、NaCl、PEG、ABA、6-BA、SA脅迫處理條件下兩個轉錄本的表達，并構建該基因的RNA干擾和過表達載體，為進一步解析該基因的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

二穗短柄草 Bd-21，剝去外稃和內稃的種子，放置于人工氣候箱的培養皿中，26 ℃、光照16 h催芽萌發；1周后移栽到裝有營養基質的小盆中，4 ℃春化室春化2周，然后移入西北農林科技大學旱區作物逆境生物學國家重點實驗室人工氣候室。生長條件為26 ℃光照16 h；22 ℃暗培養8 h。抽穗后3 d取小穗提取總RNA。脅迫處理選用水培2周的幼苗。培養條件同樣為26 ℃光照16 h；22 ℃暗培養8 h。

1.2 方 法

1.2.1 序列分析 運用NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的Blast搜索同源的蛋白質序列，并進行同源序列比對。運用DNAMAN軟件進行序列多重比對。運用MEGA 5.1軟件構建系統進化樹。

1.2.2 引物的設計 引物設計運用Primer Premier 5 軟件，定量引物BDF1DLPF、BdF1DLPR1、BdF1DLPR2,RNAi載體引物BDF1IFPF1、BDF1IFPR1、BDF1IFPF2、BDF1IFPR2和過表達載體引物BdF1OF、BdF1OR1、BdF1OR2的設計參照 BdFUL1基因組序列以及成熟mRNA BdFUL1-1和 BdFUL1-2的不同拼接位點(表1)。

表1 引物序列

1.2.3 脅迫處理條件下表達水平的分析 選用水培2周的幼苗進行各種非生物脅迫處理。冷脅迫處理為4 ℃，熱脅迫處理為45 ℃，干旱脅迫處理用0.2 g/mL PEG-6000，鹽脅迫處理用 200 mmol/L NaCl，激素處理分別為100 mol/L ABA、20 μmol/L 6-BA和1 mmol/L SA。取材時間點為處理2 h，冷脅迫和熱脅迫處理取幼苗葉片，其他脅迫處理取幼苗的根，提取RNA，26 ℃未脅迫處理的幼苗作為對照。

RNA的提取運用Trizol(上海生工生物工程有限責任公司)方法，按照說明書操作。用反轉錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit,Fermentas,Canada)合成第1鏈cDNA，按照說明書操作。qRT-PCR方法參照文獻[11]，具體如下：用CFX96 Real-time PCR detection Systems,按照SYBR Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus)試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)操作說明進行熒光定量RT-PCR。PCR反應體系15 μL,含0.5 μL cDNA(5.0 ng/μL),7.5 μL SYBR Premix ExTaq(2×,上海生工生物有限工程公司),各0.75 μL上、下游引物(10 pmol/μL),ddH2O 5.5 μL。擴增條件為:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s,55 ℃退火30 s,40個循環; 65 ℃延伸10 s，共61個循環。設3次生物學重復和3次試驗重復。按竇艷華等[11]描述的方法分析數據。

1.2.4 RNAi載體的構建 中間載體選用改造后在多克隆位點連接上GUS內含子的pBSK載體，最終載體選用上海交通大學楊洪全教授實驗室改造的雙元載體pHB。 PCR產物克隆到pMD18-T載體后，先用NotⅠ和BamHⅠ雙酶切，連接到同樣雙酶切的pBSK上。PCR產物再用HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切，連接到同樣雙酶切的上步重組pBSK質粒上。第二步重組的質粒和pHB分別用HindⅢ和SacⅠ雙酶切，連接。陽性克隆分別用菌落PCR或雙酶切鑒定并經測序確認。

1.2.5 過表達載體的構建 載體同樣選用雙元載體pHB，PCR產物克隆到pMD18-T載體后，用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切,連接到同樣雙酶切的pHB載體上。陽性克隆分別用菌落PCR和雙酶切鑒定并經測序確認。

2 結果與分析

2.1 序列分析

根據竇艷華等[11]克隆得到的 BdFUL1基因的序列，NCBI的Blastp分析結果表明 BdFUL1-2屬于MADS-box轉錄因子家族，具有MADS-box和K-box兩個保守的功能結構域(如圖1)。將 BdFUL1基因序列在NCBI數據庫中進行在線分析和BLAST比對發現， BdFUL1-2與小麥、水稻、玉米FUL-LIKE轉錄因子有較高的同源性，其中與小麥 WFUL1同源性最高，達到87%。

圖1 BdFUL1-2的保守結構域

采用DNAMAN軟件對短柄草、小麥、水稻、玉米、擬南芥、番茄的FUL-like轉錄因子進行多重序列比對。結果顯示(圖2)，僅氨基末端的MADS-box區域比較保守，其余區域則存在明顯差異(圖2)。結構的相似和差異顯示，FUL蛋白的功能既具有保守性又發生了分化。使用MEGA 5.1軟件中的鄰接法構建系統進化樹(圖3)。結果表明單子葉和雙子葉植物的FUL-like轉錄因子存在差異，單子葉植物的FUL-like轉錄因子蛋白存在3個分支。其中 BdFUL1與小麥WFUL1、水稻 OsMADS14、玉米ZMM4和ZMM15從屬于FUL1分支，可能具有相似功能。

2.2 非生物脅迫處理下 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的表達水平

運用qRT-PCR的方法，分析 BdFUL1-1、 BdFUL1-2的在各種脅迫處理下的表達。結果顯示(圖4)，低溫和高溫脅迫條件下， BdFUL1的兩個可變拼接的表達量均有所上升，特別是 BdFUL1-1的表達水平顯著升高，明顯高于對照和同樣條件處理下 BdFUL1-2的表達水平；ABA、6-BA、SA處理條件下， BdFUL1的兩個可變拼接的表達量也均有所上升，同時 BdFUL1-1表達水平明顯高于 BdFUL1-2；NaCl處理條件下, BdFUL1的兩個可變拼接的表達水平則無明顯變化。

2.3 RNAi載體的構建

為了分別沉默 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的表達，分別設計2對引物，擴增不同的cDNA片段，特異的沉默 BdFUL1-1和 BdFUL1-2。BDF1IFPF1和BDF1IFPR2組合擴增的片段則同時沉默 BdFUL1-1和 BdFUL1-2。圖5-A、5-B、5-C分別顯示RT-PCR擴增得到的的3個cDNA片段，與預期大小一致。圖5-D顯示3個片段克隆到pMD-18T載體后雙酶切驗證的結果。圖6-A～6-C為3個不同的片段反向和正向連接到中間載體后，分別用HindⅢ和SacⅠ雙酶切鑒定的結果，條帶與預期大小一致。圖6-D是連接到pHB上最終的3個重組載體 BdFUL1-RNAi1、 BdFUL1-RNAi2和 BdFUL1-RNAi3分別用HindⅢ和SacⅠ雙酶切的鑒定結果，酶切片段分別和圖5-A～5-C泳道的片段一致。在雙酶切鑒定的基礎上，測序結果顯示序列完全正確，表明成功構建了3個RNAi載體。

圖2 FUL蛋白序列比對

AP1/FUL蛋白質在NCBI數據庫上的登錄號 Accession numbers for AP1/FUL proteins in NCBI：AtAP1：NP_177074；At FUL / At AGL8：NP_568929；At CAL / At AGL10：NP_564243；AtAGL79：NP_189645；SlFUL1：AAM33098；SlFUL2：NP_001294867； OsMADS14：NP_001051300； OsMADS15： NP_001058720 ； OsMADS18：NP_001060225； OsMADS20： AAO92341； BdFUL1/ BdMADS33：AIG21841；BdFUL2/ BdMADS10：ADQ92357； BdFUL3/ BdMADS3：AIG21814 BdMADS31：AIG21840；ZAP1：AAB00081；ZMM3：AAG43200；ZMM4：NP_001105151；ZMM15：ABW84393；WFUL1/VRN1：AAP33790； WFUL2：CAM59049； WFUL3：ABG21009

CK-L：對照幼苗的葉片 Leaves of control seedlings；C-L：低溫處理幼苗的葉片 Leaves of low temperature-treated seedlings；H-L：高溫處理幼苗的葉片 Leaves of high temperature-treated seedlings；CK-R：對照幼苗的根 Roots of control seedlings；PEG-R、NaCl-R、ABA-R、6-BA-R和SA-R：分別表示PEG、NaCl、ABA、6-BA和SA處理幼苗的根 PEGR,NaClR,ABAR,6-BAR and SAR:represent leaves of treated seedlings by PEG,NaCl,ABA,6-BA and SA,respectively

A:引物BDF1IFPF1和BDF1IFPR1擴增的RT-PCR產物 RT-PCR product amplified with primer BDF1IFPF1 and BDF1IFPR1; B:引物BDF1IFPF2和BDF1IFPR2擴增的RT-PCR產物 RT-PCR product amplified with primer BDF1IFPF2 and BDF1IFPR2; C:引物BDF1IFPF1和BDF1IFPR2擴增的RT-PCR產物 RT-PCR product amplified with primer BDF1IFPF1 and BDF1IFPR2; D:3個重組pMD-18T載體NotⅠ和BamHⅠ雙酶切的結果 NotⅠ and BamHⅠ digestion of three recombinant pMD-18T vectors

A-C：PCR產物反向和正向序列連接到中間載體后HindⅢ和SacⅠ 雙酶切的驗證結果 Verification with double digestion of bridge vectors by HindⅢ and SacⅠ after RT-PCR products were cloned in forward and reverse direction respectively；D：最終載體HindⅢ和SacⅠ 雙酶切的驗證結果 Double digestion of final recombinant vector by HindⅢ and SacⅠ

2.4 過表達載體的構建

在構建RNA干擾載體的基礎上，同時還構建該基因兩個可變拼接的過表達載體，分別命名為pHB- BdFUL1-1和pHB- BdFUL1-2。

圖7-A顯示RT-PCR擴增得到的FUL1-1和 FUL1-2的序列，片段大小與預期的633 bp和732 bp一致。圖7-B顯示2個目的片段已經分別連接到pHB上,切出與圖7-A同樣大小的條帶。經過測序驗證，表明已成功構建 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的過表達載體。

A:編碼cDNA Encoding cDNA；1. BdFUL1-1;2. BdFUL1-2。B：最終重組載體HindⅢ和XbaⅠ 雙酶切結果 Final recombinant vectors digested by HindⅢ and XbaⅠ;3.pHB- BdFUL1-1；4.pHB- BdFUL1-2;M.DNA Marker

3 討 論

3.1FUL-like基因具有廣泛的生物學功能

擬南芥FUL基因調控花序、花分生組織的發育，還影響心皮、角果和葉片的發育[3]。小麥 FUL1響應春化作用[4]。水稻中FUL基因調控內稃的發育，更重要的是通過調控莖端分生組織向花序分生組織的過渡，調控植物的開花時間[6-7]。

為克隆調控開花時間的基因，用來進行分子育種，選取和水稻 MADS14同源的 BdFUL1進行研究。表達分析結果表明該基因特別是可變拼接 BdFUL1-1的表達受高溫、低溫和干旱等非生物脅迫的強烈誘導，暗示該基因可能還參與植物的逆境響應。

3.2 非生物脅迫誘導 BdFUL1可變剪接的產生

可變剪接，即1個mRNA前體經過不同的剪切和拼接產生2個或者多個成熟mRNA的過程。可變剪接是造成生物體內轉錄組和蛋白質組多樣性和復雜性的重要機制[12]。二穗短柄草的基因組較小，重復序列較少，可變剪接普遍發生[13]。研究發現，某些基因在特異的細胞或者組織中，或者在特定發育階段，或者在外界環境改變、受到生物或者非生物脅迫時，發生可變拼接的機率會更高[14]。研究發現，在鹽分、溫度、干旱等環境脅迫下，小麥Wdreb2、水稻OsDREB2B和玉米ZmDREB2A等DREB/CBF類轉錄因子發生可變剪接，從而幫助植物適應上述逆境帶來的組織脫水。這表明，可變拼接是禾本科植物響應逆境脅迫的一種機制，具有重要作用[15-17]。低溫、高溫、干旱脅迫以及激素處理條件下， BdFUL1基因的兩個可變剪接 BdFUL1-1和 BdFUL1-2的表達量發生變化，特別是 BdFUL1-1的表達水平顯著升高，暗示 BdFUL1基因功能可能與應答環境脅迫有關。但是，非生物脅迫通過什么機制誘導 BdFUL1-1水平的升高，還有待深入研究。

3.3 RNA干擾基因功能常用的方法

在研究雙子葉模式植物擬南芥和單子葉模式植物水稻基因功能時，研究者一般采用正向或者反向遺傳學策略，去分離鑒定目的基因的突變體，根據突變體的表型去分析基因的生物學功能。

短柄草是新型的禾本科模式植物，短柄草基因功能的研究剛剛開始，突變體庫比較少。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是基于雙鏈RNA能夠降解序列特異的目標基因mRNA的技術[18-19]。該技術問世后在動物植物方面得到廣泛應用。運用RNA干擾一次可以沉默一個基因的表達，也可以同時沉默幾個序列同源基因的表達。Cui等[20]一次就沉默水稻4個E類基因的表達，Kobayashi等[21]同時沉默3個水稻A類基因的表達。在克隆 BdFUL1的cDNA序列，分析其可變拼接和表達模式的基礎上，為了研究解析其生物學功能，構建3個 BdFUL1的RNAi載體，以期通過轉基因的方法去研究 BdFUL1-1和 BdFUL1-2功能上的差別。

致謝：感謝西北農林科技大學陳明訓博士對論文修改所提的建議。

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(責任編輯：郭柏壽 Responsible editor:GUO Baishou)

Expression Analysis and Construction of RNA Interference and Over-expression Vectors ofBrachypodiumdistachyonFRUITFULL1

LI Haifeng1,2,HAN Ying2and WANG Binghua2

(1.College of Xinjiang Agricultural Vocational & Technical,Changji Xinjiang 831100，China; 2.State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas,College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)

To explore the biological function of transcription factor FRUITFULL1( BdFUL1) fromBrachypodiumdistachyon,we analyzed the structure and the sequence feature of BdFUL1-2,and then constructed phylogenetic tree with methods of bioinformatics and molecular biology to show its genetic relationship with AP1/FUL family genes from other plant species. Moreover,the expression level of BdFUL1-1 and BdFUL1-2 which were under different abiotic stresses and treated with different exogenous plant hormones was analyzed by quantitative RT-PCR. The results indicated that BdFUL1 as a typical MADS-box transcription factor had a close genetic relationship with WFUL1 from wheat. Besides, BdFUL1-1 was significantly induced by different abiotic stresses including heat,coldness,and drought,and different plant hormones such as ABA,6-BA,and SA,it suggested that BdFUL1 should be involved in the response to abiotic stresses through the hormone signaling pathway. In addition,RNA interference and overexpression constructing BdFUL1-1 and BdFUL1-2 were successfully created.

Brachypodiumdistachyon; FRUITFULL; Abiotic stress; RNA interference; Over-expression

LI Haifeng,male,Ph D,professor.Research area:plant molecular biology.E-mail:lhf@nwsuaf.edu.cn

日期：2017-05-22

2016-05-05

2016-06-10

國家自然科學基金(31571657);中央高校基本科研業務費(2014ZZ009);新疆農業職業技術學院科研項目(XJNZYKJ201501和XJNZYKJ201512)。

李海峰，男，博士，教授，研究方向為作物分子生物學。E-mail:lhfxn@sina.cn

Q94; Q7

A

1004-1389(2017)05-0767-08

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170522.0857.032.html

Received 2016-05-05 Returned 2016-06-10

Foundation item The National Natural Science Foundation of China(No.31571657);the Fundamental Research Funds for the Central Universities(No.2014ZZ009)；Funds of Xinjiang Agricultural Vocational and Technical College(No.XJNZYKJ201501，No.XJNZYKJ201512).