FOXE1基因單核苷酸多態性與甲狀腺乳頭狀癌臨床易感的相關性研究

梁 羽，謝建平，溫琥玲，楊耀午，曹齡之，仇文杰(.四川省醫學科學院·四川省人民醫院超聲科，四川 成都 6007；.川北醫學院附屬醫院核醫學科，四川 南充 63700)

FOXE1基因單核苷酸多態性與甲狀腺乳頭狀癌臨床易感的相關性研究

梁 羽1，謝建平2，溫琥玲2，楊耀午2，曹齡之2，仇文杰2
(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院超聲科，四川 成都 610072；2.川北醫學院附屬醫院核醫學科，四川 南充 63700)

目的 探討四川南充地區漢族人群中FOXE1基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)與甲狀腺乳頭癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)臨床易感的關系。方法 選取150例PTC患者與180例漢族正常人群。以FOXE1基因 rs535522715、rs111482243、rs965513、rs1867277、rs1867278、rs531484350、rs549601899位點作為遺傳標記，用基因測序法檢測FOXE1基因單核苷酸多態性。結果 FOXE1基因rs535522715、rs111482243、rs531484350、rs549601899在甲狀腺乳頭狀癌組及正常人群組均未檢測出突變。與正常人群組的比較，甲狀腺乳頭狀癌組rs1867278等位基因及基因型頻率組間分布差異有統計學意義(P< 0.05)，rs965513、rs1867277等位基因及基因分型頻率組間分布差異無統計學意義(P> 0.05)，且rs1867278在甲狀腺乳頭狀癌組攜帶C等位基因風險是正常人群組的1.92倍(OR=1.92，95%CI=1.244～2.969，P= 0.003)。結論 FOXE1基因rs1867278與甲狀腺乳頭狀癌的臨床易感性具有相關性，rs1867278位點C等位基因是甲狀腺乳頭狀癌的風險等位基因。

甲狀腺乳頭狀癌；FOXE1基因；單核苷酸多態性；相關性

甲狀腺癌(thyroid carcinoma，TC)是內分泌系統常見惡性腫瘤之一。目前，全世界TC發病率處于逐步上升趨勢，女性發病率高于男性，城市發病率高于農村，沿海地區高于內陸地區，而且趨向年輕化發展[1]；不同地域、不同種族發病病理類型及發病年齡存有差異[2]；但是TC的死亡率很低，最近幾年未見明顯波動[3]。研究表明TC發生為多基因、多因素共同作用，但具體確切病因未明。近年來國外文獻報道，由FOXE1基因編碼甲狀腺轉錄因子2與甲狀腺乳頭狀癌(PTC)臨床易感具有相關性[4]，但單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)易受人種、地域、飲食文化等多方面差異影響，在四川南充地區的漢族人種中是否具有類似效應，將是本研究探討的內容，為進一步深入研究、治療、預防TC提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2013年11月至2015年3月川北醫學院附屬醫院核醫學科經病理診斷明確且首次131I清除甲狀腺殘留組織前的PTC患者的血液樣本為甲狀腺乳頭狀癌組(PTC組)共150例，其中女117例，男33例。收集我院體檢中心體檢健康者血液樣本185例為正常人群組(NC組)，其中女145例，男40例。由于用兩種不同引物擴增出兩條不同的基因片段，rs535522715、rs111482243、rs965513三個SNP位點與rs1867277、rs1867278、rs531484350、rs549601899四個SNP位點分別屬于FOXE1基因的兩條基因片段上，各基因片段擴增成功率有所不同，因此分為兩大類數據。見表1。

表1 不同SNP位點兩組一般資料比較 (n)

1.2 方法

1.2.1 血液全基因組DNA提取 血液基因組DNA提取試劑盒(DP319)購自天根生化科技(北京)有限公司。所提取的DNA經凝膠電泳檢測合格后，置-20 ℃冰箱凍存備用。

1.2.2 引物設計 由Primer 5.0引物設計軟件設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，詳見表2、表3。

表2 不同SNP 位點的引物DNA序列、退火溫度、擴增長度

表3 SNP 位點的引物DNA序列、退火溫度、擴增長度

1.2.3 PCR 擴增 25.0 μl反應體系包括DNA模板2.0 μl，上下游引物各1.0 μl，2 ×Master Mix (含染料)11.0 μl，滅菌水10.0 μL。PCR擴增反應采用型號C1000TMThermal cycler(美國Bio-Rad公司)擴增儀。反應流程：95°預變性，4 min；進入循環：變性94°，50 s；退火溫度，35 s；延伸72 ℃，35 s；共35個循環。終末延伸72 ℃，5 min。取PCR產物6 μL在含G0LDVIEW染色液的1.0%瓊脂糖凝膠電泳，以90 V電壓電泳25 min后，將凝膠置于凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)中觀察結果，觀察擴增是否成功。

1.3 PCR擴增產物基因測序 將合格的PCR擴增產物寄至上海生工生物工程股份有限公司進行雙向引物測序，測序結果由專用Chromas看圖軟件分析，并通過BLAST 基因服務站進行同源性對比分析，判斷突變結果。

1.4 統計學方法 使用SPSS 13.0進行統計分析。用擬合優度卡方檢驗驗證SNP的基因型分布頻率是否符合哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg Law)遺傳定律；計數資料組間比較采用卡方檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR產物擴增電泳結果rs535522715、rs111482243、rs965513擴增目的片段420 bp；rs1867277、rs1867278、rs531484350、rs549601899擴增目的片段465 bp。擴增成功基因條帶見圖1、圖2。

圖1 rs535522715、rs111482243、rs965513擴增目的片段

圖2 rs1867277、rs1867278、rs531484350、rs549601899擴增目的片段

2.2 FOXE1基因型分析①FOXE1基因rs535522715g/G、rs1114822 43T/T、rs531484350A/A、rs549601899g/G在甲狀腺乳頭狀癌組及正常人群組均未檢測出突變。②FOXE1基因rs965513A/G位點突變模式是G→A，測序圖見圖3。③FOXE1基因rs1867277 A/G位點突變模式是G→A，測序圖見圖4。④FOXE1基因rs1867278 A/C位點突變模式是C→A，測序圖見圖5。

2.3 FOXE1基因與甲狀腺乳頭狀癌的臨床易感相關性分析 與正常人群組的比較，rs1867278等位基因及基因型頻率在組間分布差異有統計學意義(P< 0.05)，rs965513、rs1867277等位基因及基因分型頻率在組間分布差異無統計學意義(P> 0.05)，且rs1867278在甲狀腺乳頭狀癌組攜帶C等位基因風險是正常人群組的1.92倍(OR=1.92，95%CI=1.244～2.969，P= 0.003)，見表4與表5。

圖3 rs965513測序圖 a：未突變(G/G)，黑色單峰(黑色箭頭)； b：突變(A/G)，綠色與黑色雜峰(紅色箭頭)

圖4 rs1867277測序圖 a：未突變(G/G)，黑色單峰(黑色箭頭)； b：突變(A/G)，綠色與黑色雜峰(紅色箭頭)

圖5 rs1867278測序圖 a：未突變(C/C)，藍色單峰(黑色箭頭)； b：突變(A/A)，綠色單峰(紅色箭頭)

組別rs965513AAAGGGrs1867277AAAGGGrs1867278AAACCCPTC組3241236693669366NC組4301466664896213χ20 0491 4329 029P0 9760 4890 011

表5 三個SNP位點的等位基因比較

3 討論

FOXE1基因位于染色體9q22，大小約3461 bp，只有一個外顯子，其編碼蛋白FOXE1轉錄因子屬于Fox轉錄因子家族之一，廣泛存在于生物界，在人體中主要表達于甲狀腺組織與睪丸組織。FOXEl轉錄因子參與DNA依賴轉錄調控、RNA聚合酶II啟動子轉錄和RNA聚合酶II啟動子轉錄負調控等一系列生物過程[5]，對維持FOXE1基因的轉錄、翻譯均有重要調節作用。而FOXE1基因主要通過基因突變、異常甲基化及基因多態性等三種方式改變導致FOXE1轉錄因子改變，從而影響人類的胚胎發育、細胞的生長分化及腫瘤發生。

目前，SNP作為第三代遺傳標志，人體許多表型差異、對藥物敏感差異、疾病的易感性等都可能與之相關。而在TC眾多危險因素中，FOXE1基因的SNP已經很明確在TC致病過程中發揮重要作用[6]。國外在冰島最先發現FOXE1 基因rs965513與歐洲人患TC的風險高度相關，此位點突變者約比非突變者高出約5.7倍TC患病風險[7]。隨后，國外又發現FOXE1基因rs1867277位點同樣是甲狀腺癌致病位點，然而基因單核苷酸多態性與輻射劑量似乎作為獨立的風險因素增加TC的易感[8]。然而，FOXE1基因片段上SNP位點還有許多，SNP位點受到地域、種族、氣候、電離輻射、病毒、飲食文化、個人生活習慣等差異因素影響，在我國這種差異因素對甲狀腺癌易感風險的影響程度同樣存有差異，這就造成了本次研究的甲狀腺癌中最常見的甲狀腺乳頭狀癌的結果略和國際研究結果產生偏差。

本研究初步探索了四川南充地區漢族人種中FOXE1基因各SNP位點等位基因及基因分型的分布頻率。如FOXE1 基因rs1867278基因分型頻率為A/A(71.4%)、A/C(24.7%)、C/C(3.9%)，等位基因頻率為A(83.8%)、C(16.2%)，這與北方吉林地區李鴻博[9]檢測的FOXE1 rs1867278基因分型頻率為A/A(74.5%)、A/C(23.8%)、C/C(1.7%)，等位基因頻率為A(86.4%)、C(13.6%)略產生了差異。但這也對FOXE1基因 rs1867278在我國的基因分型頻率有了大致了解，為評估PTC的患病風險提供了有效數據。本研究檢測到FOXE1基因rs1867278與PTC臨床易感存在顯著的相關性(P< 0.05)，而rs965513、rs1867277兩TC風險位點與PTC未檢測到相關性(P> 0.05)。鑒于本次研究樣本量所限，在四川南充漢族人種中，rs1867278位點是否可用來評估PTC易感風險，還需繼續探索，同樣對于rs965513、rs1867277兩位點也不能完全排除其對PTC易感風險的影響。

國外研究認為FOXE1基因rs965513、rs1867277與PTC有相關性，而此次研究未體現其相關性。其原因可能是：①SNP受地域、種族、生活環境等差異因素影響。如在歐洲葡萄牙，Tomaz等[10]研究認為rs965513、rs1867277變異位點在增加葡萄牙人家族性及散發性甲狀腺非髓質癌易感性上有強烈的相關，FOXE1基因突變與PTC發病存在關聯。而在日本，Matsuse等[11]認為rs965513明顯增加日本人患PPTC的風險，FOXE1基因SNP與BRAF基因v600e狀態沒有明確關聯，rs1867277并未與PTC發病相關。并且，個人所受輻射劑量的高低對NKX2-1基因rs944289位點易感PTC同樣存有差異[12]，并未提到FOXE1基因的SNP與個人輻射劑量也對PTC發生產生聯系。②PTC致病危險因素復雜多樣，存在相互因素協同作用。如我國朱曉娥等[13]研究認為在放射性環境下，rs965513與中國人PTC發病有關，rs1867277是甲狀腺癌形成的易感因素之一。而英國Jones等[14]研究認為rs965513、rs1867277、rs944289、rs6983267 協同作用與PTC易感有重大關聯，rs965513在PTC形成過程中起主導作用。我國蔣永新等[15]則發現FOXE1基因另一個SNP位點rs944289多態性中的T等位基因可能是PTC易感且轉移的危險因素。然在動物實驗[16]表明：適量FOXE1因子是維持甲狀腺正常結構和功能的關鍵因素，FOXE1因子不直接參與PTC致癌過程，但過度表達會引起小鼠患結節性甲狀腺腫。③研究樣本量局限。SNP在大樣本量的隨機對照試驗上的結果才準確可靠[17]，需隨機擴大樣本量范圍才能最真實反映四川南充地區FOXE1基因SNP分布特征。

此外，FOXE1基因在PTC致病過程中的作用機制，多數研究[18，19]認為對PTC的侵襲轉移肯定起一定作用，更多是與PAX-8、NKX2等基因協同作用，FOXE1基因并不是主要致癌基因。若單一特異性沉默FOXE1基因，則可能通過PTC細胞株TPC-1細胞上皮間質轉化增強PTC細胞的侵襲潛能[20]。同時，FOXE1基因異常甲基化是另一致癌原因，在PTC中是低甲基化、高表達的異常表達模式，FOXE1啟動子區域高甲基化則是PTC的一個保護因素[21]。FOXE1基因rs965513位點突變是由遠范圍內的至少3種增強子元件調控失調引起[22]；這3種增強元件至少包含rs7864322、rs12352658、rs7847449、rs10759944這四個位點。因此，FOXE1基因對PTC致病機制應該是多SNP位點聯合作用，同樣需要聯合其它相關基因做全基因組關聯研究才能獲得PTC確切的分子生物學致病機制。

綜上所述，FOXE1基因rs1867278與PTC的臨床易感性具有相關性，rs1867278位點C等位基因是PTC的風險等位基因。FOXE1基因 rs535522715、rs111482243、rs965513、rs1867277、rs531484350、rs549601899位點單核苷酸多態性在本研究中與PTC臨床易感可能不存在明顯的相關性。但FOXE1基因rs965513、rs1867277兩位點在PTC的患病風險評估、致癌機制、病理特征等方面的作用需要進一步探索印證。

[1] Malandrino P，Pellegriti G，Attard M，et al.Papillary thyroid microcarcinomas：a comparative study of the characteristics and risk factors at presentation in two cancer registries[J].J Clin Endocrinol Metab，2013，98(4)：1427-1434.

[2] 黃風玲，劉攀，毛睿，等.新疆地區甲狀腺癌臨床流行病學特征[J].山東醫藥，2015，55(37)：19-21.

[3] 姚杏娟，李貴英，董惠斌，等.常州市2011-2013年甲狀腺癌流行現況調查[J].中國全科醫學，2014，17(36)：4346-4349.

[4] Gao Y，Chen F，Niu S，et al.Replication and meta-analysis of common gene mutations in TTF1 and TTF2 with papillary thyroid cancer[J].Medicine，2015，94(36)：e1246.

[5] Takahashi M，Saenko VA，Rogounovitch TI，et al.The FOXE1 locus is a major genetic determinant for radiation-related thyroid carcinoma in Chemobyl[J].Hum Mol Genet，2010，19(12)：2516-2523.

[6] Zhuang Y，Wu W，Liu H，et al.Common genetic variants on FOXE1 contributes to thyroid cancer susceptibility：evidence based on 16 studies[J].Tumour Biol，2014，35(6)：6159-6166.

[7] Gudmundsson J，Sulem P，Gudbjartsson DF，et al.Common variants on 9q22.33 and 14q13.3 predispose to thyroid cancer in European populations [J].Nat Genet，2009，41(4)：460-464.

[8] Damiola F，Byrnes G，Moissonnier M，et al.Contribution of ATM and FOXE1 (TTF2) to risk of papillary thyroid carcinoma in Belarusian children exposed to radiation.[J].Int J Cancer，2014，134(7)：1659-1668.

[9] 李鴻博.FOXE1基因多態性與乳頭狀甲狀腺癌遺傳易感性的研究[D].吉林大學，2013.

[10]Tomaz RA，Sousa I，Silva JG，et al.FOXE1 polymorphisms are associated with familial and sporadic non medullary thyroid cancer susceptibility[J].Clin Endocrinol (Oxf)，2012，77(6)：926-933.

[11]Matsuse M，Takabashi M，Mitsutake N，et al.The FOXE1 and NKX2—1 loci are associated with susceptibility to papillary thyroid carcinoma in the Japanese population[J].J Med Genet，2011，48(9)：645-648.

[12]Maillard S，Damiola F，Clero E，et al.Common variants at 9q2233，14q133，and ATM loci，and risk of differentiated thyroid cancer in the French Polynesian population[J].PloS one，2015，10(4)：e0123700.

[13]朱曉娥，袁耿彪，范永增，等.甲狀腺癌中BRAF、RET、MEN1、FOXE1等基因相關SNP位點的篩選及臨床價值[J].重慶醫學，2012，41(34)：3580-3582.

[14]Jones AM，Howarth KM，Martin L，et al.Thyroid cancer susceptibility polymorphisms：confirmation of loci on chromosomes 9q22 and 14q13，validation of a recessive 8q24 locus and failure to replicate a locus on 5q24[J].J Med Genet，2012，49(3)：158-163.

[15]]劉岑鳥，蔣永新，陳燦，等.FOXE1rs944289基因多態性與云南人甲狀腺乳頭狀癌的相關性研究[J].現代腫瘤醫學，2013，21(9)：1958-1963.

[16]Nikitski A，Saenko V，Shimamura M，et al.targeted foxe1 overexpression in mouse thyroid causes the development of multinodular goiter but does not promote carcinogenesis[J].Endocrinology，2016，157(5)：2182-2195.

[17]李家兵，張盼，林世慶，等.CYP2E1基因RsaI/PstI多態性與膀胱癌遺傳易感性的Meta分析[J].實用醫院臨床雜志，2015，12(5)：241-245.

[18]樊友本.轉錄因子FOXEl在甲狀腺癌侵襲轉移中的作用及其機制的研究[D].復旦大學，2013.

[19]李玉芬，張立琴.FOXE1基因突變與甲狀腺發育不全[J].中國兒童保健雜志，2012，20(2)：149-150.

[20]丁政.FOXE1基因在甲狀腺癌細胞上皮間質轉化中的功能研究[D].上海交通大學，2014.

[21]徐寬.FOXE1和RASSF2甲基化異常在甲狀腺乳頭狀癌中的研究[D].復旦大學，2012.

[22]He H，Li W，Liyanarachchi S，et al.Multiple functional variants in long-range enhancer elements contribute to the risk of SNP rs965513 in thyroid cancer[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2015，112(19)：6128-6133.

Association of single nucleotide polymorphism of FOXE1 gene with clinical susceptibility of papillary thyroid carcinoma

LIANGYu1，XIEJian-ping2，WENHu-ling2，YANGYao-wu2，CAOLing-zhi2，QIUWen-jie2
(1.DepartmentofUltrasound，SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China； 2.DepartmentofNuclearMedicine，TheAffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege，Nanchong637000，China)

Objective To investigate the correlation between FOXE1 single nucleotide polymorphisms (SNP) and papillary thyroid carcinoma (PTC) in a Han population of Sichuan Nanchong area.Methods A case control study was used to select 150 cases of papillary thyroid carcinoma and 180 cases of normal subjects of Han nationality.The rs535522715，rs111482243，rs965513，rs1867277，rs1867278，rs531484350 and rs549601899 loci of FOXE1 gene were used as genetic markers.The gene sequencing method was used to detect FOXE1 gene SNP.Results No mutation in FOXE1 gene at rs535522715，rs111482243，rs531484350 and rs549601899 loci was found in the carcinoma group or the normal group.Frequency distribution of rs1867278 allele in the carcinoma group was different from the control group (P< 0.05) while frequency distribution of rs965513 and rs1867277 alleles was not significant between the two groups (P> 0.05).Moreover，gene risk of rs1867278 in the carcinoma group carrying 'C' was 1.92 times as high as that of the normal group (OR=1.92，95%CI=1.244 ～ 2.969，P = 0.003).Conclusion FOXE1 gene rs1867278 is associated with the clinical susceptibility of papillary thyroid carcinoma，and the "C" allele of the rs1867278 locus is a risk allele for this type of carcinoma.

Papillary thyroid carcinoma； FOXE1 gene； Single nucleotide polymorphism； Correlation

R736.1；R394.3

A

1672-6170(2017)02-0029-05

2016-06-15；

2016-11-25)