優秀單板U型場地滑雪運動員外周血淋巴細胞cDNA文庫構建及ESTs分析

張澤彪+趙玉華+周文婷+汪宇峰+趙晨瓊+關偉軍+朱志強

摘 要：構建一個優秀單板U型場地滑雪運動員血液的cDNA文庫，經測序從中獲取大量的表達序列標簽（Expressed Sequence Tags）ESTs，用于基因篩選和功能預測。方法：通過對多名優秀冰雪運動員血液樣品的總RNA進行提取、混合總RNA，合成雙鏈cDNA、蛋白酶K消化、Sfi1酶切并連接載體、λ噬菌體的包裝，經擴增最終獲得優秀冰雪運動員cDNA文庫；隨后從文庫中隨機挑選500個克隆提交至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序，測序結果利用Chromas軟件去低質量樣品，使用GenBank中的BLAST功能對所獲序列進行比對獲取相關信息，將獲得的ESTs信息提交PANTHR和GO（Gene Ontology）生物信息數據庫進行基本歸類分析，從中獲取運動員cDNA文庫中所涵蓋的重要遺傳信息。結果：得到滴度分別為1.32×106 pfu/mL和1.65×1010 pfu/mL的未擴增文庫和擴增后文庫，擴增后文庫的重組率為90.6%；得到長度在300～1 100 bp序列360個，平均長度606 bp；通過BLAST比對得出201條具有注釋的基因信息，利用PANTHER數據庫基本分析發現這些基因分布在27個pathway上，其中TXN、MDH1、ARL1、ARPC3、ACTG1等基因分別分布在參與新陳代謝、氧化應激反應、心血管系統機能等相關聯的信號通路上，推測其可能與運動能力存在關聯。通過GO分析對所測序列進行歸類得到在該數據庫中具有功能注釋的基因143個，參與31項不同功能，主要包括細胞組分、分子功能和生物過程。結論：構建了一個全長的運動員cDNA文庫，其質量符合構建cDNA文庫的標準。

關鍵詞：單板U型場地滑雪；外周血淋巴細胞；全長cDNA文庫；表達序列標簽

中圖分類號：G 804.2 文章編號：1009-783X（2017）03-0254-05 文獻標識碼：A

Abstract： Objective： The aim of this study is to construct a cDNA library of blood from elite half-pipe snowboarders. And we can get a large number of ESTs （Expressed Sequence Tags） from it by sequencing the genes. We can also use it for gene screening and function prediction. Methods： The cDNA library of blood from elite half-pipe snowboarders was constructed by a series of experiments extracting and mixing Total RNA of several elite ice-snow athletes， synthesizing double-stranded DNA， proteinase K digestion， Sfi 1 enzyme digestion， connecting with vector， packaging phage λ and amplification. Then 500 clones from the library were randomly selected to be sequenced. Low-quality samples in the results of sequence were removed by Chromas software. The relevant information of ESTs was captured by matching gene sequences with BLAST of GenBank. Then the information of ESTs was presented to PANTHR and GO（Gene Ontology）bioinformatics database to make a basic classification and analysis and to get some important genetic information in the cDNA library of athletes. Results： The titer of cDNA library unamplified was 1.32×106pfu/ml， and the titer of cDNA library amplified was 1.65×1010pfu/ml .The recombinant rate of cDNA library amplified was 90.6%. We finally got 360 sequences whose length were between 300bp and 110bp， and the average length was 606bp. 201 Gene information with annotation（BLAST） was distributed on 27 pathways（PANTHER）， including TXN， MDH1， ARL1， ARPC3， ACTG1 and many other genes which were separately distributed on pathways associated with metabolism， Oxidative stress， or Cardiovascular system function. So we speculate that it may be related to physical ability. GO was used to analysis and classify gene sequences， and then 143 Genes with functional annotation in the database were confirmed to participate in different functions which mainly include cellular component， molecular function and biological process. Conclusions： This study has successfully constructed a full-length athletes' cDNA library which conformed to the standard of cDNA library construction.endprint

Keywords： half-pipe snowboarding； Lymphocyte； full-Length cDNA Library； expressed sequence tags

單板U型場地滑雪于1998年日本長野冬奧會上被設為正式比賽項目[1 ]。研究表明，該項目在完成整套動作中無氧供能占比例較大，但在高山環境中重復的訓練及漫長的賽季使得該項目運動員同樣需要進行大量的有氧耐力訓練 [2-3]。由于該項目開展時間較短，有關的科學研究數量有限，主要集中在生物學監控、技術動作分析、運動損傷與心理調控等方面，其他領域多為空白。近年來有研究表明，遺傳因素在個體間運動能力的差異方面起較大作用。隨著分子生物學研究的深入，大量與運動能力相關的基因被發掘出來，通過生物技術手段對運動員進行研究已成為了當今研究的熱點 [4]。對新興的該項目而言，為持久深入了解運動員遺傳信息在其表達調控過程中所起的作用，勢必面臨運動員遺傳資源有限與持續的功能基因研究間的矛盾問題，鑒于此原因，構建cDNA文庫則成為解決這一矛盾的首選，更為我國2022年北京冬季奧林匹克運動會的備戰起到重要作用。

本研究選擇SMART技術構建單板滑雪運動員cDNA文庫優勢在于減少了起始階段RNA的用量便可獲得比例較高的全長cDNA，且實驗過程快速簡單 [5]。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象

無菌采集優秀單板滑雪運動員靜脈血，所有標本均在運動員知情同意的條件下采集。本研究樣品來源于2010/2011年LG國際雪聯單板滑雪世界杯賽中國國家隊全體男子運動員，共記13名，均參加過國際比賽或在全國錦標賽上取得過名次，符合優秀冰雪運動員特征標準，具體信息見表1。

1.1.2 主要試劑

Trizol購自Invitrogen；SMARTTM cDNA Library Construction Kit購自Clontech；Gigapack Ⅲ Gold-7購自Stratagene，其他試劑為分子生物學實驗室常用試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取

抽取運動員新鮮靜脈血，隨后用淋巴細胞分離液分離出淋巴細胞，經細胞計數約3×106個細胞加入1 mL Trizol，混勻后室溫靜置使其充分裂解，對其進行抽提，混合總RNA，將所有總RNA溶于無Rnase的DEPC處理過的水中，紫外分光光度計測定OD260/OD280，提取總RNA的濃度與純度，隨后進行甲醛變性電泳檢測總RNA的降解情況。

1.2.2 cDNA文庫構建

在運動員外周血淋巴細胞cDNA文庫的構建中ss-cDNA和ds-cDNA 的合成利用SMART cDNA Library Construction Kit，取2 μg總RNA為模板，按試劑盒說明書方法反轉錄合成cDNA第一鏈，經LD-PCR合成ds-cDNA，產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA合成結果。隨后對經檢測符合要求的ds-cDNA依次進行蛋白酶K處理和SfiI酶切消化，利用spin-400純化柱進行分級純化，收集含有cDNA的樣品與λTriplEx2載體16 ℃連接過夜，將連接產物用Gigapack Ⅲ packing extract包裝，得到未擴增文庫。

1.2.3 文庫的擴增

培養VCS257菌液，離心后用10 mol/L MgSO4調OD值為4.0，加入500 μL的過夜菌和足夠形成6～7×104個噬菌斑的包裝產物，將菌液與包裝產物混合液于37 ℃孵育15 min；立即加入LB頂層膠，顛倒混勻并倒入已經準備好的LB固體培養基中；37 ℃孵育過夜直至噬菌斑相互接觸；隨后在平皿中加入SM buffer4 ℃過夜并洗脫表面噬菌斑將其收集純化，從而得到擴增后的cDNA文庫，擴增文庫在4 ℃可以保存6個月，長期保存時需加入7%的DMSO以每管1 mL分裝于-70 ℃保存，且避免反復凍融。

1.2.4 文庫滴度測定

培養VCS257菌液，離心后用10 mol/L MgSO4調OD值為4.0，隨后稀釋包裝產物，未擴增文庫按1∶10 和1∶20稀釋，擴增后文庫按1∶5 000和1∶10 000稀釋；取1 μL稀釋后的包裝產物加到菌液中；將菌液與包裝產物混合37 ℃孵育15 min；加入LB頂層膠顛倒混勻，并立即倒入已經準備好的LB固體培養基中；37 ℃孵育過夜；查找噬菌斑個數，通過文庫克隆數量滴度計算公式：Pfu/mL=（噬菌斑個數×稀釋倍數×103）/鋪板的稀釋噬菌體體積（μL）來推斷未擴增文庫滴度。

1.2.5 確定重組克隆的百分比

利用X-Gal顯色原理，在混有IPTG和X-gal及VCS257菌液的頂層膠的LB/MgSO4的平皿上進行藍白斑篩選，以此檢測未擴增文庫的重組率。37 ℃培養8～18 h，通過白色（重組體）和藍色（非重組體）來推斷cDNA文庫的重組率，重組率=重組體/總克隆×100%。

1.2.6 PCR檢測插入片段

隨機挑選96個噬菌斑樣品加入到96孔培養板中，每孔加入100 μL的SM緩沖液孵育擴增。取1 μL作為模板，以檢測引物cDNAF：CCATTGTGTTGGTACCCGG；cDNAR：ATACGACTCACTATAGGGCGAATT進行PCR。產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析電泳結果用以推斷重組率。重組率=陽性克隆檢出數/測定樣品數。

1.2.7 ESTs獲取

為了在所構建的cDNA文庫中識別和分析更多轉錄本的功能，隨機挑選500個噬菌斑作為模板進行PCR，產物提交至北京諾賽基因組研究中心有限公司，利用ABI3730基因分析儀對待測的500個樣品PCR產物以5端開始進行單項測序（測序引物序列5sequencing primer： CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT）。endprint

1.2.8 ESTs分析

利用Chromas軟件將測序結果中的空載、信號質量雜亂以及小于l00 bp的序列去除，獲得單拷貝EST，將這些ESTs提交至NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），使用GenBank中的BLAST序列比對功能對所測的序列進行相似性檢索比對，根據序列的相似性獲得最佳匹配效果的基因注釋 [6 ]，將匹配的序列通過GO（http：//wego.genomics.org.cn）與PANTHER（http：//www.pantherdb.org）進行相關基因功能歸類及分析 [7-8 ]。

2 結果

2.1 總RNA樣品檢測

提取的總RNA用分光光度計進行檢測，OD260/OD280的比值為1.98，表明所提取的RNA沒有被DNA，蛋白和其他雜質污染。樣品濃度約為3 650 ng/uL。甲醛變性凝膠電泳檢測得到的電泳圖上能觀察到清晰的28 S核糖體RNA與18SRNA及5 S核糖體三條帶，如圖1所示。28 S和18 S兩條帶的灰度值比約為2：1，由此表明，RNA降解較少，保存較為完整，可用于后續文庫的構建工作。

2.2 LD-PCR合成雙鏈cDNA

通過反轉錄和LD-PCR來合成全長雙鏈cDNA，經1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，ds-cDNA應分布在0.1～4 kb，如圖2所示，由此證明合成的cDNA雙鏈覆蓋的范圍很大，基因種類豐富。

2.3 大片段cDNA分離處理

利用CHROMA SPIN-400 column分離純化不同大小的cDNA片段，得到400 bp以上的片段可用于后續連接載體使用。

2.4 cDNA文庫特征

未擴增的文庫和擴增后的文庫滴度分別是：1.32×106 pfu/mL和1.65×1010 pfu/mL。通過PCR技術檢測插入片段的比率和插入片段的平均長度，擴增后文庫的重組率約為90.6%，插入片段在100～1 100 bp，如圖3所示。這些結果表明，插入片段包含大部分的cDNA片段，符合一個標準文庫構建的要求，對進一步研究基因結構、翻譯和表達提供了必要的條件。

2.5 ESTs的生成

為了獲得更多運動員外周血淋巴細胞中ESTs功能性基因的信息，在本研究中，我們共對500個克隆進行測序，去除空載及結果在300 bp以下低質量序列后，得到有效EST序列360個，其核苷酸片段大小分別從300～1 100 bp不等，平均長度606 bp，如圖4所示。

2.6 GO分析

根據GO檢索出該數據庫中的功能基因143個，參與31項生物功能，GO分析的結果主要分3類。根據圖5可以很清晰地觀測到，在GO分類分析結果中與細胞組成方面相關的生物學功能9個，與分子功能方面相關8個，與生物過程方面相關的注釋數量有14個，分別占29.0%、25.5%和45.5%。GO分析可反映同一基因具有的不同分子功能，同時也參與不同的生物學過程，從而反映生命過程的復雜性。

2.7 Pathway分析

將BLAST比對后具有注釋的基因進行PANTHER檢索，在該數據庫中有201個與本次提交信息相關的基因信息，這201個功能被發現參與27個相關的代謝途徑，其中占比率較高的分別為：整合素信號通路（Integrin signalling pathway）、趨化因子和細胞因子介導的炎癥反應信號通路（Inflammation mediated by chemokine and cytokine signaling pathway）、Rho GTPase調節細胞骨架（Cytoskeletal regulation by Rho GTPase）、鈣粘著蛋白信號通路（Cadherin signaling pathway），而其中氧化應激反應（Oxidative stress response）、三羧酸循環（TCA cycle）和HIF激活缺氧反應（Hypoxia response via HIF activation）等通路由于與新陳代謝、氧化應激反應、心血管系統機能相關聯，推測可能與該項目運動存在關聯，如圖6所示。

3 討論

以往研究表明，cDNA文庫的構建是功能基因組分析不可缺的工具，可為生物體內基因組機制多樣化過程提供更多的詳細信息，隨著科技的進步，cDNA文庫的構建技術已日趨成熟，并在農業、生物、醫學等領域取得了一批珍貴的研究成果，但在體育領域至今仍無人問津。通過構建cDNA文庫不僅可有效保存優秀運動員遺傳資源，分離全長功能基因，還可以從轉錄水平反應運動員特定時期功能基因在個體發育、細胞分化、細胞周期調控、細胞衰老等生命現象的研究過程中起到重要作用，具有更為廣泛的應用價值[9]。由于cDNA便于克隆和表達，從cDNA文庫中篩選得出的目的基因可直接用于該基因的表達，是研究工作中最常使用到的表達基因文庫[10]。

已有研究表明，鑒定cDNA文庫的質量需從3個方面進行：首先根據Clareke公式計算，cDNA 文庫應包含至少1.7×105獨立克隆來確保99%低豐度mRNA會呈現在庫中；其次是插入基因長度應在0.1 kb以上，確保cDNA的富集與完整，最后重組率應達到90%以上，同樣作為一個評價文庫質量的重要指標[4-12]。在本研究中，我們得到未擴增與擴增后滴度分別為1.32×106 pfu/mL和1.65×1010 pfu/mL，插入片段在100～1 100 bp且重組率為90.6%的運動員cDNA文庫，表明該文庫質量良好，可為該項目運動員在轉錄水平的深入研究提供物質基礎。另有研究表明，對于EST分析等功能基因組學的研究而言，大于300 bp的核苷酸序列即可以代表基因信息[13]；所以在對隨機挑選的500個克隆進行測序后除去小于300 bp的序列，余下的360個序列長度分別從300～1 100 bp不等，平均長度為606 bp，從而進一步表明所建文庫效果較好。因此，本研究構建的文庫可以用于EST測序。在本文中我們所構建的單板U型場地技巧運動員全長cDNA文庫符合標準庫的要求。endprint

20世紀末Adams等[14]提出了ESTs的概念，通過構建cDNA文庫可以從中大規模獲得ESTs用于基因的共功能性研究，在本研究通過測序比對得到201個具有功能注釋的基因，參與27個相關的代謝途徑，其中占比率較高的如前所述。通過查詢發現文庫中所得基因TXN、MDH1、ARL1、ARPC3、ACTG1等分別在這些pathway上被注釋，從而推斷可能參與與運動能力相關的機能。利用GO對所測ESTs進行歸類得到具有功能注釋的基因143個，參與31項不同功能，大多與蛋白質調節活動和新陳代謝相關，主要包括細胞組分、分子功能和生物過程，在各功能歸類中細胞組成反映了基本功能基礎，分子功能反應是一個單獨的基因產物的功能，而生物學過程則綜合反映各生命活動過程的復雜性。通過對所獲得的ESTs信息注釋歸類，從而獲得更多與身體機能及運動能力相關的信息為后續對該項目運動員相關機能的研究提供依據。

目前研究表明，從文庫中選擇單克隆進行ESTs測序，已被證明是一種快速高效的用以評估cDNA文庫質量的檢測方法[15]。通過計算某一基因片段在EST文庫中出現的頻率，就可以確定基因表達的差異，隨著越來越多物種全基因組測序的完成，ESTs數據迅速增加，許多通過分析公共數據庫中EST來鑒定cDNA文庫間基因差異表達的網絡資源也發展起來，用EST序列分析來研究基因表達顯示良好的前景[15]。

早在1997年由McPherron等[16]在對小鼠肌肉cDNA文庫進行篩選時發現Myostatin（MSTN）基因，繼而鑒定出MSTN基因可強有力地負向調控骨骼肌的生長發育和使肌肉力量的增加，為人類后期從文庫中篩選與肌肉力量相關基因提供可行性依據。本實驗中，由于外周血淋巴細胞取材便捷且攜帶大量遺傳信息，所以成為實驗取材的首選。據以往研究表明，人類淋巴細胞基因表達譜與多種疾病相關，是一個重要的研究領域，淋巴細胞是免疫活性細胞，分泌白細胞介素等多種重要的細胞因子，其中表達的基因不僅與免疫功能有關，而且與細胞信號轉導、生長發育、血細胞、神經細胞再生等有密切的關系，所以在后續研究中有著廣泛的應用價值[17]。在本研究中，我們構建運動員外周血淋巴細胞cDNA文庫，旨在批量保存優秀運動員功能性基因的基礎上分離出大量的ESTs，以此推斷這些基因是否與某種運動能力存在相關聯系，同時也為以淋巴細胞基因表達譜研究運動員神經系統，在相關基因的調控過程中所起的重要作用提供了更為便捷的途徑，因此，構建運動員外周血淋巴細胞cDNA文庫具有廣泛的應用價值。

4 結論

單板U型場地雪上技巧作為一項開展不久的運動項目，相關的科學研究目前十分有限，本研究通過構建cDNA文庫，以基因組的形式對此類運動員遺傳信息進行永久保存，解決以往實驗研究的接力式進行與標本的暫時性采集中存在的矛盾，以便有效地對同一研究對象進行持久的連續性研究，為日后深入探索該項目運動員遺傳及發育特點提供可持續利用資源，此外，本研究結合測序技術得到大量的ESTs，從中篩選出相關基因，推測其可能與運動能力存在聯系，更是為備戰2022年我國冬季奧林匹克運動會前運動員的科學選材、運動基因的篩選及基因功能研究提供了一種新的思路與方法，對運動科學更好地開展起著促進作用。

參考文獻：

[1] TURNBULL J， KEOGH J W L， KILDING A E. Strength and Conditioning Considerations for Elite Snowboard Half Pipe[J]. Open Sports Medicine Journal， 2011， 5（1）： 1.

[2] GABBETT T J， DOMROW N. Relationships between training load， injury， and fitness in sub-elite collision sport athletes[J]. Journal of sports sciences， 2007， 25（13）： 1507.

[3] KIPP R W. Physiological Analysis and Training for Snowboard's Halfpipe Event[J]. Strength & Conditioning Journal， 1998， 20（4）： 8.

[4] WILLIAMS A G， FOLLAND J P. Similarity of polygenic profiles limits the potential for elite human physical performance[J]. The journal of physiology， 2008， 586（1）： 113.

[5] XIAO HONG C， ZHI C， HANG PING Y， et al. Construction and characterization of a cDNA library from human liver tissue with chronic hepatitis B[J]. Journal of Zhejiang University Science B， 2005， 6（4）： 288.

[6] LI J Y， WANG H Y， LIU J， et al. Transcriptome analysis of a cDNA library from adult human epididymis[J]. DNA research， 2008， 15（3）： 115.

[7] YING S Y. Complementary DNA libraries[J]. Molecular biotechnology， 2004， 27（3）：245.endprint

[8] GUO Y， LIU C， LU T， et al. Generation and analysis of a large-scale expressed sequence tags from a full-length enriched cDNA library of Siberian tiger[J]. Gene， 2014， 541（2）： 75.

[9] SAYERS E W， BARRETT T， BENSON D A， et al. Database resources of the national center for biotechnology information[C]//Haptics Symposium，IEEE， 2010：199.

[10] THANH T， CHI V T Q， ABDULLAH M P， et al. Construction of cDNA library and preliminary analysis of expressed sequence tags from green microalga Ankistrodesmus convolutus Corda[J]. Molecular biology reports， 2011， 38（1）： 177.

[11] LIU C Q， LU T F， FENG B G， et al. Construction of cDNA library and preliminary analysis of expressed sequence tags from Siberian tiger[J]. International journal of biological sciences， 2010， 6（6）： 584.

[12] LIU C， LIU D， GUO Y， et al. Construction of a Full-Length Enriched cDNA Library and Preliminary Analysis of Expressed Sequence Tags from Bengal Tiger Panthera tigris tigris[J]. International journal of molecular sciences， 2013， 14（6）： 11072.

[13] PRATT L H， LIANG C， SHAH M， et al. Sorghum expressed sequence tags identify signature genes for drought， pathogenesis， and skotomorphogenesis from a milestone set of 16，801 unique transcripts[J]. Plant physiology， 2005， 139（2）： 869.

[14] ADAMS M D， KELLEY J M， GOCAYNE J D， et al. Complementary DNA sequencing： expressed sequence tags and human genome project[J]. Science， 1991， 252（5013）： 1651.

[15] RICHMOND T， SOMERVILLE S. Chasing the dream： plant EST microarrays[J]. Current opinion in plant biology， 2000， 3（2）： 108.

[16] BELLINGE R H S， LIBERLES D A， IASCHI S P A， et al. Myostatin and its implications on animal breeding： a review[J]. Animal Genetics， 2005， 36（1）： 1.

[17] MEZEY E， CHANDROSS K J， HARTA G， et al. Turning blood into brain： cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow[J]. Science， 2000， 290（5497）： 1779.endprint