人工養殖王錦蛇糞源大腸桿菌耐藥性檢測分析*

鄒琴 謝能君 喻世剛 廖娟 王鋼

（樂山師范學院生命科學學院，四川樂山 614000）

人工養殖王錦蛇糞源大腸桿菌耐藥性檢測分析*

鄒琴 謝能君 喻世剛 廖娟 王鋼**

（樂山師范學院生命科學學院，四川樂山 614000）

采取人工養殖王錦蛇的糞便，進行大腸桿菌的分離鑒定，將分離的桿菌接種在瓊脂平板后，按照CLSI推薦的K—B藥敏紙片法進行18種抗生素的耐藥性檢測，其結果表明：頭孢唑啉、氧氟沙星、頭孢曲松、慶大霉素、阿米卡星、環丙沙星、氯霉素、卡那霉素、恩諾沙星、利福平、氟苯尼考、強力霉素、復方新諾明、鏈霉素是低度敏感；頭孢哌酮、妥布霉素、頭孢噻肟中度敏感；諾氟沙星耐藥。

人工養殖王錦蛇；大腸桿菌；抗生素；耐藥性

大腸桿菌（Escherichia coli）為埃希氏菌屬(Escherichia)代表菌，人和許多動物腸道中最主要且數量最多的一種細菌，主要寄生在大腸內。同時大腸桿菌也是耐藥基因的重要傳播介體[1]。王錦蛇（Elaphe carinata）屬脊索動物門，脊椎動物亞門，爬行綱，有鱗目，蛇亞目，游蛇科，錦蛇屬的動物[2]，廣泛分布于我國南方各省。王錦蛇屬無毒蛇，已被列入國家林業局2000年8月1日發布的《國家保護的有益的或者有重要經濟、科學研究價值的陸生野生動物名錄》。多年來因被大量捕殺和對其棲息環境的破壞，野外種群數量呈不斷下降之勢[3]，因此，大力開展王錦蛇的人工養殖是必經之路，而抗生素在人工蛇養殖過程中已成為不可或缺的手段，但是長期大量使用抗生素造成的藥物殘留、耐藥菌株出現等問題愈演愈烈，造成耐藥細菌的種類不斷增加，甚至導致多重耐藥性。本研究對人工養殖蛇糞源中大腸桿菌的耐藥性進行研究，為今后進一步研究和追蹤人工養殖王錦蛇大腸桿菌耐藥性的變化奠定基礎，也對人工養殖王錦蛇疫病的防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 培養基

營養瓊脂粉、麥康凱瓊脂均購自于杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 抗生素

18 種抗菌藥藥敏紙片：頭孢唑啉、氧氟沙星、頭孢曲松、慶大霉素、阿米卡星、環丙沙星、氯霉素、卡那霉素、恩諾沙星、利福平、氟苯尼考、強力霉素、復方新諾明、鏈霉素、頭孢哌酮、妥布霉素、頭孢賽肟、諾氟沙星，上述材料均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 樣品來源

1月5 號中午采集人工常規養殖的1齡王錦蛇糞便。

1.4 大腸桿菌的分離純化和鑒定

稱取糞源樣品5 g，加入1 mL無菌水，搖勻，震蕩，并吸取100 μ mL涂布平板，37℃培養24 h，隨時觀察菌落的生長情況。待麥康凱瓊脂平板上形成粉紅色菌落后，挑取典型的單個菌落進行革蘭氏染色并鏡檢，初步對分離菌進行鑒定，將符合大腸桿菌特點的菌落接種于營養瓊脂平板上，于37℃培養24 h后4℃冰箱保存備用；采用腸桿菌科細菌生化編碼微量鑒定管進一步鑒定。

1.5 藥敏測試

將錐形瓶、培養皿、槍頭、試管、生理鹽水置于高壓滅菌鍋中滅菌；稱8.4g營養瓊脂粉溶于200mL蒸餾水中，錐形瓶定容；在試管中取用生理鹽水稀釋后的大腸桿菌液1 mL接種于培養基，涂布均勻，并貼上抗菌藥藥敏紙片，放入恒溫培養箱中培養24 h；測抑菌圈直徑，測3次，取平均值，得出每種抗生素耐藥性結果。

判斷標準[4]：抑菌圈直徑為≥20 mm為高敏；抑菌圈直徑在15～20 mm之間為中敏；抑菌圈直徑≤15 mm為低敏；無抑菌圈為耐藥。

2 結果

由不同抗生素抑菌圈平均直徑與耐藥性（表1）可知：頭孢唑啉、氧氟沙星、頭孢曲松、慶大霉素、阿米卡星、環丙沙星、氯霉素、卡那霉素、恩諾沙星、利福平、氟苯尼考、強力霉素、復方新諾明、鏈霉素是低敏；頭孢哌酮、妥布霉素、頭孢賽肟是中敏；諾氟沙星是耐藥。

表1 不同抗生素抑菌圈平均直徑與耐藥性

3 討論

大部分抗生素對人工養殖蛇已經是低敏，這是否與長期使用抗生素有關，還有待進一步研究。但此結果為進一步研究人工養殖蛇腸道抗生素耐藥性奠定了基礎。因此，在選擇藥物時，最好選擇幾種比較敏感的藥物聯合或交替使用，減少單一藥物的使用劑量或使用時間，從而減少腸道菌群耐藥性的產生，也可通過推廣健康養殖、生態養殖，嚴格控制抗生素的使用，延緩或控制耐藥菌的出現。

［1］楊宇宸，崔澤林，郭曉奎，等.常見養殖淡水魚腸道細菌耐藥性研究［J］.國醫生物制品學，2011，34(1):1673-4211.

［2］湖南省人民政府.湖南省地方重點保護野生動物名錄［R］.2002-09-05．

［3］陶吉興，劉安興，楊友金,等.浙江重點蛇類資源數量與生態分布研究［J］.浙江大學學報：農業與生命科學版，2003，29(5)：563-568．

［4］王俊麗，張要齊，孫雪峰.18種中藥對豬大腸桿菌的體外抑菌活性的測定方法比較［J］.安徽農業科學，2012，40 (26)：12 947-12 948．

第1作者簡介：鄒琴（1995-），女，本科在讀，動植物檢驗檢疫專業。

Resistance Testing Analysis of Fecal E.coli of Artificial Culturing Elaphe carinata

ZOUQin
（Leshan Normal University,SichuanLeshan157009）

Method The stool samples of artificial culturing Elaphe carinata were collected for isolation and identification of E.coli applying pathogenic assay method.Antimicrobial susceptivity test were conducted by using the Kirby-Bauer method recommended by CLSI to examine the sensitivity against 18 antibiotics.It needs label paper of antibiotics to nutrient medium,culture for 24 hours,and measure the diameter of bacteriostaticcircle.TheresultsShowedthatCefazolin,ofloxacin,ceftriaxoneandqingdatoxin, ciprofloxacin,andamikacin,chloramphenicol,kanamycin,andenrofloxacin,rifampicin,florfenicoland doxycycline,Co-trimoxazole and streptomycin is less sensitive;Cefoperazone,tobramycin,cephalosporins oxime is moderately sensitive;Norfloxacin is resistance.

Artificial culturing Elaphe carinata;E.coli;Antibiotics;Antibiotic resistance

Q939.121,Q959.3

A

王鋼（1979-），男，副教授，碩士，主要從事動物疫病檢測與防控、養殖業廢棄物處理與資源化利用。

2017-03-03

（責任編輯：李丹）

*樂山師范學院校地合作項目（Z1530）

1001-9499（2017）03-0013-02