犬骨髓間充質干細胞的體外分離培養及鑒定

李 捷，白利鵬，陳 曦，楊 芳，沈留紅，曹隨忠，左之才，任志華，馬曉平，余樹民

(四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130)

犬骨髓間充質干細胞的體外分離培養及鑒定

李 捷，白利鵬，陳 曦，楊 芳，沈留紅，曹隨忠，左之才，任志華，馬曉平，余樹民*

(四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130)

為了體外高效快捷地分離培養犬(canine)骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs)，實驗分別用全骨髓差速貼壁法和密度梯度離心法對犬BMSCs進行分離培養，利用免疫組化和流式細胞術檢測獲得細胞的表面標志抗體，并用成骨和成脂方向的誘導分化等方法對其進行鑒定。結果表明，全骨髓差速貼壁法和密度梯度離心法都能成功培養出犬BMSCs，但后者相對前者獲得的細胞經培養后其原代細胞分布更均勻，原代培養達到傳代所需的時間更短，成活率更高；兩種方法獲得的P3和P8細胞的生長曲線基本保持一致；免疫組化和流式細胞術檢測犬BMSCs表達CD105、CD90和CD29，但是不表達CD34和CD31；且能成功誘導為成骨細胞和脂肪細胞。證明采用全骨髓差速貼壁法和密度梯度離心法均能夠成功分離和培養犬的BMSCs，而密度梯度離心法是一種較全骨髓差速貼壁法更適合犬BMSCs的分離方法。

犬；骨髓間充質干細胞；分離培養

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一群存在于骨髓腔內的非造血干細胞，具有較強的自我更新能力和多向分化潛能，在體外不同的誘導條件下能被誘導分化為成骨細胞、肌肉細胞、神經細胞、內皮細胞、胰島細胞等各胚層細胞[1-2]，且因其有取材方便和低免疫性等優點，目前被廣泛用于細胞及組織多種疾病的替代治療[3-5]。

目前，關于動物來源的BMSCs研究主要集中于鼠[6-7]、兔[8-9]、馬[10-11]、豬[12-13]等實驗動物上，其分離培養條件都比較完善，但由于種屬差異性的存在，在組織工程骨應用于臨床及進行人的病理生理研究前，仍需有其他動物實驗數據為之提供理論依據。

隨著人們生活水平逐步提高，寵物犬貓的飼養數量越來越多。同時，寵物疾病尤其是犬貓的骨折、骨營養不良性關節病、肝臟或腎臟衰竭等逐漸成為影響寵物生活與生存質量的嚴重障礙，對這些寵物疾病的研究和臨床治療日益受到動物醫學研究者和臨床工作者的高度重視，因此我們選擇犬的間充質干細胞作為實驗的細胞來源。犬來源的間充質干細胞(MSCs)可取材于骨髓[14]、脂肪[15]、臍帶[16]、羊水[17]等組織，其分離方法主要包括差速貼壁分離法、密度梯度離心法、酶消化法等。骨髓來源的MSCs因其具有取材方便和較少的倫理道德爭議而被廣大動物醫學研究工作者所接受。但是由于間充質干細胞沒有特異性表面抗體，因此干細胞鑒定成為一大難點。相關研究表明，BMSCs易貼壁生長，呈長纖維形，且隨著年齡的增長，其自我更新和分化能力逐漸降低[18]，表達CD54、CD44、CD90，不表達組織相容性復合物Ⅱ(MHC-Ⅱ)以及CD34和CD45[19]。本研究利用全骨髓差速貼壁法和密度梯度離心法分別分離培養犬BMSCs，并進行了擴增、鑒定及體外向成骨細胞和脂肪細胞的定向分化研究，建立一套較完備而快速的BMSCs培養模式，且證明密度梯度離心法較全骨髓差速貼壁法更適合犬BMSCs的分離培養，可為后續研究及細胞移植治療提供充足的細胞材料，為下一步的深入研究和干細胞移植奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試動物

1歲齡左右健康中華田園犬6只，購于四川省雅安市。

1.2 主要試劑與儀器

LG-DMEM培養基，GIBCO公司；FBS，HyClone 公司；胰蛋白酶，Sigma公司；CD34、CD31、CD105、CD90、CD29抗體，北京博奧森生物技術有限公司；免疫組化染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、胰島素、IBMX、吲哚美辛，sigma分裝；超凈工作臺，蘇州凈化設備集團有限公司；二氧化碳培養箱，Thermo 公司；倒置相差顯微鏡，日本Olympus 公司；流式細胞儀，BD Accuri C6。

1.3 實驗方法

1.3.1 骨髓液的采集

取1歲齡犬，按體質量肌肉注射犬眠寶，全身麻醉后局部剃毛、消毒，做無菌股骨穿刺，用肝素抗凝，抽取一定量的骨髓液。混勻后平均分為2份。

1.3.2 原代培養方法

將采集的肝素-骨髓液注入15 mL離心管中，110g離心10 min，吸棄上清液，加5 mL PBS，混勻，平均分為2份，編號A、B。各重復離心步驟2～3次。棄上清液。A組采用全骨髓差速貼壁培養法分離BMSCs，即將細胞沉淀直接用細胞培養液(LG-DMEM，10%FBS，1%青鏈霉素，2 mmol·L-1L-谷氨酰胺)懸浮細胞，計數后以108～109cells·mL-1的密度接種于一次性塑料培養皿中。B組采用密度梯度離心法分離BMSCs，步驟為：將細胞沉淀加適量LG-DMEM混勻，制備細胞懸液，調整細胞密度為2×108～1×109cells·mL-1。沿管壁加入到含等量淋巴細胞分離液的玻璃離心管中，450g離心20～25 min，收集界面霧狀的單個核細胞，110g離心10 min，加入適量細胞清洗液漂洗2次，離心，棄上清。用培養液懸浮細胞，計數后以5×106～5×107cells·mL-1的密度接種于培養皿中。兩種方法獲得的細胞均放置于37 ℃、5%CO2，飽和濕度條件下培養。72 h后首次換液，之后每3 d換液1次，直到細胞克隆成片后傳代。首次換液后，每天在顯微鏡下仔細觀察細胞形態變化。

1.3.3 細胞傳代培養和增殖

原代培養細胞達到80%～90%融合時，棄去培養液，用PBS沖洗2次，再用胰蛋白酶(0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA)消化，倒置顯微鏡下密切觀察，見大部分細胞突起回縮，形態變圓，細胞間隙變寬后，立即吸去胰酶，加入細胞培養液終止消化。用移液槍輕輕吹打，至細胞脫落，收集細胞懸液，110g離心10 min，吸除上清，加入新的細胞培養液重懸，按1∶2～1∶3進行傳代培養。經2～3 次傳代處理后，即得到純化的BMSCs。

為觀察不同培養方法對細胞增殖的影響，取生長良好的第3代(P3)和第8代(P8)細胞，制成細胞懸液， 經計數后， 以3×104cells·mL-1的密度接種至24孔板，每孔接種0.5 mL，在培養箱中培養8 d，每3 d換液一次，每隔24 h取3 孔用血球計數板計數，連續8 d，求每日均值，以接種時間為橫坐標、細胞數為縱坐標作圖，即為細胞生長曲線，計算對數生長期細胞群體的倍增時間：Td=T×lg2/lg(Nt/N0)。Td，倍增時間(h)；T，細胞數由N0增至Nt所用的時間(h)；Nt與N0分別為t時刻與初始細胞數。

1.3.4 細胞免疫組織化學

取第3代犬BMSCs，調節細胞濃度為105cells·mL-1，接種于96孔板，每孔100 μL培養，待其達到80%匯合，吸棄培養液，PBS 洗滌 2 次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，吸棄固定液，PBS洗滌3次，過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(Streptavidin/Peroxidase)免疫組化染色試劑盒染色。染色步驟參考說明書。染色結束后顯微鏡觀察并照相。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞表面標志

取第3 代BMSCs，消化，110g離心10 min，PBS 洗滌 2 次后調節細胞濃度為 1×106cells·mL-1，分為 6 份，各管加細胞洗液漂洗，離心后收集細胞，然后將細胞重懸在含10%山羊血清的孵育緩沖液(含2%BSA的PBS)中，室溫封閉10 min。每份分別滴加CD34、CD31、CD105、CD90、CD29 的一抗(以 PBS 代替一抗作為陰性對照)，室溫孵育 30 min 后，孵育緩沖液洗滌 2 次，滴加FITC 標記的羊抗兔 IgG，避光反應 40 min 后，重復洗滌2次，離心回收細胞，將所得細胞重懸在適量PBS中，后經流式細胞儀檢測細胞表面標志物 CD34、CD31、CD105、CD90 、CD29陽性細胞的表達。

1.3.6 細胞的體外誘導分化

選擇生長狀態良好的第3代(P3)犬BMSCs，用胰蛋白酶消化2～3 min，制成單細胞懸液，以3×104cells·mL-1密度接種于24孔培養皿中，每孔設3個重復，同時設置對照組。待細胞長至80% 匯合時分別換成成骨誘導液(地塞米松10 nmol·L-1，維生素C 50 μmol·L-1，β-甘油磷酸鈉10 mmol·L-1，10%FBS，LG-DMEM)和成脂誘導液(地塞米松1 μmol·L-1，胰島素10 mg ·L-1，IBMX 0.1 mmol·L-1，吲哚美辛200 μmol·L-1，10%FBS，LG-DMEM)進行成骨和成脂誘導，每3天換液一次。成骨誘導第7天和第21天分別用堿性磷酸酶和茜素紅進行成骨細胞染色，成脂誘導14 d用油紅O進行脂肪細胞染色。

2 結果與分析

2.1 犬BMSCs的原代培養特征

犬BMSCs全骨髓差速貼壁法原代培養中，接種48 h后，可觀察到有少量細胞形態已有所變化，隨著時間增加，形態變為長纖維形、多邊形等，數量逐漸增多，培養到第6～7天，可見有細胞集落形成，細胞呈螺旋狀排列，多數為長纖維形，少數為多角形，但細胞分布不均勻(圖1)；密度梯度離心法獲得的原代細胞接種48 h后，細胞即出現形態上的改變，呈短梭形或小多角形，折光性較強，第3～5天貼壁細胞增多，并逐漸延伸生長為長梭形，細胞分布均勻，第7天，細胞間界限不清，排列呈漩渦狀(圖1)。以上結果表明，密度梯度離心法在分離培養原代犬BMSCs時，較全骨髓差速貼壁法用時短，得到的細胞也較均一。

2.2 犬BMSCs的傳代培養及生長曲線的繪制

傳代后犬BMSCs迅速貼壁，6 h左右細胞全部貼壁，細胞均勻分布，并開始分裂增殖(圖2-A/a)。3～4 d 細胞鋪滿皿底，即可消化傳代(圖2-B/b)。開始時大多為梭形，增殖速度快，細胞傳代周期較短，待傳至第9 代時，細胞鋪展得寬大而扁薄，胞內顆粒物質增多，增殖速度減慢，細胞傳代周期延長(圖2-D/d)。兩種方法獲得的傳代細胞的生長特點基本一致。

第3代和第8代犬BMSCs生長曲線分別見圖3-1、2。細胞接種后，24 h內為BMSCs細胞潛伏期，數量基本保持不變；此后細胞開始分裂，進入對數生長期，4 d時達到細胞數量峰值；之后細胞數量開始基本保持不變，細胞已進入平臺期甚至衰退期。兩種方法分離的P3和P8代犬BMSCs生長曲線基本一致，說明細胞傳到第8代時，犬BMSCs在體外生長狀態良好，在體外仍能穩定增殖。全骨髓差速貼壁法和密度梯度離心法獲得的犬BMSCs的增殖曲線基本一致，都保持典型的“S”型曲線，且隨著傳代次數的增加，細胞生長速度逐漸下降，已不能在體外穩定增殖。

倒置顯微鏡觀察細胞形態特征(100×)，A、B、C為全骨髓差速貼壁培養法培養2、4、8 d分離的原代細胞；a、b、c為密度梯度離心法培養2、4、8 d分離的原代細胞Cellular morphology was observed by inverted microscope (100×); A， B， C were primary cells isolated from whole bone marrow differential velocity adherent after cultured for 2, 4, 8 d， respectively; a， b， c were primary cells isolated from density gradient centrifugation after cultured for 2, 4, 8 d， respectively圖1 兩種方法分離的原代犬骨髓間充質干細胞比較Fig.1 Comparison of primary canine bone marrow mesenchymal stem cells derived from two methods

倒置顯微鏡觀察細胞形態特征(100×)； A—D為全骨髓差速貼壁法；a—d為密度梯度離心法。A/a，第3代接種 6 h；B/b，第3代培養3.5 d；C/c，傳代細胞P7；D/d，傳代細胞P9Cellular morphology was observed by inverted microscope (100×); A-D， Cells isolated from whole bone marrow differential velocity adherent; a-d， Cells isolated from density gradient centrifugation. A/a， The 3th cells cultivated for 6 h; B/b， The 3th cells cultivated for 3.5 d; C/c， The 7th cells; D/d， The 9th cells圖2 犬骨髓間充質干細胞培養特征Fig.2 Cultural characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells derived from canine

A、B，全骨髓差速貼壁培養法組； a、b，密度梯度離心法組A and B， Whole bone marrow differential velocity adherent; a and b， Density gradient centrifugation圖3 犬骨髓間充質干細胞P3、P8生長曲線的比較Fig.3 Growth curves of 3th and 8th canine bone marrow mesenchymal stem cells

2.3 犬BMSCs表面抗原鑒定

細胞免疫組織化學分析顯示，犬BMSCs表達CD29、CD90和CD105，不表達CD31、CD34(圖4)。流式細胞術檢測結果如表1和圖5(選取其中一次的流式結果作為代表)。結果表明，2種方法獲得的細胞表面標志物表達情況一致，密度梯度離心法所得的細胞間充質干細胞的標志物表達率顯著高于全骨髓差速貼壁法，即在犬BMSCs純化過程中，前者所獲得的細胞較后者均一。

2.4 犬BMSCs的體外分化潛能檢測

用P3代犬BMSCs進行成骨細胞和成脂細胞的誘導分化。在細胞達到70%匯合后，分別換誘導液。在成骨誘導7 d后，細胞呈短梭形，用堿性磷酸酯酶(ALP)染色呈現陽性細胞(圖6-A/a)，而未經誘導的BMSCs染色陰性：誘導21 d，大多數細胞呈鱗片形，堆積形成鈣化結節，形成的鈣結節茜素紅染色為紅色(圖6-B/b)，未經誘導的無鈣沉積物質出現。表明2種分離方法獲得的犬BMSCs均成功誘導為成骨細胞，成骨分化能力并無明顯差異。

倒置顯微鏡觀察細胞形態特征(100×)。1，對照組；2，CD31；3，CD34；4，CD29；5，CD90；6，CD105Cellular morphological characteristics were observed by inverted microscope (100×). 1， Control; 2， CD31; 3， CD34; 4， CD29; 5， CD90; 6， CD105圖4 犬骨髓間充質干細胞免疫組化結果Fig.4 Immunohistochemical results of mesenchymal stem cells derived from bone marrow of canine

表1 犬骨髓間充質干細胞表面標志物的表達率

Table 1 The expression ratio of surface markers of bone marrow mesenchymal stem cells of canine

分離方法Isolationmethod表達率Expressionratio/%CD29CD90CD105CD31CD34全骨髓差速貼壁法Wholebonemarrowdifferentialvelocityadherent89 27±2 2579 53±1 9683 82±1 565 86±0 524 35±0 38密度梯度離心法Densitygradientcentrifugation94 77±2 0789 53±1 8593 87±1 644 90±0 843 63±0 32

A—E為全骨髓差速貼壁培養法；a—e為密度梯度離心法A-E， Whole bone marrow differential velocity adherent; a-e， Density gradient centrifugation圖5 犬骨髓間充質干細胞流式細胞術結果Fig.5 Results of mesenchymal stem cells derived from bone marrow of canine by flow cytometry

A/a，堿性磷酸酶染色(100×)；B/b，礦化結節茜素紅染色(200×)； C/c，脂滴油紅O染色(200×)A/a， ALP staining (100×); B/b， The mineralization crystals by Alizarin red staining (200×); C/c， The lipid droplets by Oil red O staining (200×)圖6 犬骨髓間充質干細胞誘導分化結果Fig.6 The differentiation results of mesenchymal stem cells derived from canine bone marrow

在成脂細胞誘導過程中，細胞由長纖維狀，逐漸變短，胞質內出現發亮的脂滴，在誘導第15天細胞內脂滴可被油紅O染成紅色(圖6-C/c)，未經誘導的無脂滴出現。結果表明，2種分離方法獲得的犬BMSCs均能成功誘導為脂肪細胞，成脂分化能力也無差異。

3 討論

干細胞根據其來源可分為胚胎干細胞和成體干細胞，對成體干細胞的研究不像胚胎干細胞一樣涉及倫理道德方面的問題。在成體干細胞中，間充質干細胞的研究是當今的熱點，典型的MSCs來自于成人的骨髓基質，在新鮮的骨髓中，BMSCs的含量極少，約占有核細胞的0.001%～0.01%[18-19]。

自20世紀70年代Friedenstein等[20]建立BMSCs分離及擴增的方法以來， 人們又提出了多種從骨髓中分離BMSCs的方案， 但對BMSCs的體外分離培養、鑒定還沒有統一公認的標準方法；同時，也尚未見有報道探討不同分離方法對BMSCs體外分離培養的影響。目前，常用于BMSCs 分離的方法有全骨髓差速貼壁篩選法[21]、密度梯度離心法[22]、免疫磁珠法[23]、流式細胞儀分選法[24]等。流式細胞儀和免疫磁珠分選技術雖然可獲得高純度的BMSCs，但對細胞活性和分化能力有較大影響，而且實驗條件要求高，需要骨髓量較大[25]。本研究所用的全骨髓差速貼壁法和密度梯度離心法是公認的較常用的分離BMSCs的方法。作為組織工程的種子細胞，細胞的純度越高越好。全骨髓差速貼壁法是根據BMSCs貼壁生長而造血系細胞懸浮生長的特性對二者進行分離[26]，但所得的細胞成分復雜，需經過多次換液才能純化細胞。密度梯度離心法主要是根據骨髓中各細胞成分比重的不同[18]，利用淋巴細胞分離液提取單個核細胞，操作上較全骨髓差速貼壁分離法煩瑣，得到的細胞數也比后者少，但此方法可排除大量紅細胞對BMSCs 貼壁的影響，得到的原代細胞較純凈。

本研究利用全骨髓差速貼壁法和密度梯度離心法分別對犬BMSCs進行分離培養，試驗結果表明，經原代培養48 h后，鏡下觀察可見全骨髓差速貼壁分離法獲得的細胞僅有極少量呈細長的長纖維形，密度梯度離心法獲得的細胞形態變化的數目明顯較前者多，細胞呈短梭形或小多角形，折光性較強；兩者達到可傳代水平所需的時間，后者也明顯較短。細胞融合時都呈紡錘狀，體積小而密集，螺旋狀或平行排列。通過P3和P8代細胞生長曲線的繪制，發現傳代后兩者得到的BMSCs體外培養時，增殖迅速，沒有明顯差異，說明兩者得到的BMSCs自我更新能力強。對生長曲線的分析可見，犬BMSCs接種后0～2 d為增殖潛伏期，第3天為指數生長期，第4天進入平臺期。經計算，犬BMSCs細胞倍增時間為42 h左右。雖然犬BMSCs在體外容易分離培養并進行多次傳代，但在傳到10代以后，細胞的生長速度有所下降，說明其體外傳代次數也是有限的。

BMSCs 的鑒定問題是目前的難點之一，其原因主要在于對BMSCs 的特異性表面標記物仍存在爭議[19]。在體外，BMSCs 以易于貼附于塑料培養板為特征，未分化的基質細胞呈梭形或成纖維細胞形，通常采用其特征性的形態以及分化為其他基質細胞系的功能來鑒定。因此在2005年，ISCT(the International Society for Cellular Therapy)定義了BMSCs 的最低標準：首先，BMSCs 在標準培養條件下必須具備貼塑料壁生長的特點；其次，BMSCs 表達CD105、CD73 和 CD90，而 CD45、CD34、CD14 或CD11b、CD79a或 CD19 及 HLA-DR 表面分子表達陰性；第三，經體外誘導，BMSCs 必須能向成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞分化[27]。本研究結果表明，獲得的犬BMSCs符合骨髓間充質干細胞的特點：第一，無論是全骨髓差速貼壁分離法還是密度梯度離心法，獲取的BMSCs 開始貼壁生長時，呈短梭形或多角形，具有長短不等的數個細胞突起，在細胞密集區表現為渦旋狀，隨著培養時間的延長，相互重疊成多層；第二，2種方法分離出的貼壁細胞，經免疫組化和流式細胞術檢測結果均表明所得細胞表達CD90和CD105，不表達CD34和CD31；第三，向成骨細胞和成脂細胞分別誘導分化后，用成骨細胞特異標記物(茜素紅)及成脂細胞特異標記物(油紅O)染色，均出現陽性細胞。綜上所述，從犬骨髓中分離和純化培養獲得的貼壁細胞，經細胞形態、膜表面抗原和誘導能力檢測，均證明為純化的BMSCs。本研究為犬BMSCs進一步誘導分化和臨床應用研究奠定了基礎。

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(責任編輯 盧福莊)

Isolation， cultivation and identification of canine bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)invitro

LI Jie， BAI Lipeng， CHEN Xi， YANG Fang， SHEN Liuhong， CAO Suizhong， ZUO Zhicai， REN Zhihua， MA Xiaoping， YU Shumin*

(CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

In order to explore which way can be more efficient and faster to isolate， culture and identifiy the canine bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)invitro， the BMSCs were isolatedinvitroby whole bone marrow differential velocity adherent and density gradient centrifugation. Immunohistochemistry and flow cytometry were used to examine the surface markers of the cells， and induced their differentiation into osteoblasts and adipocytes. The results showed that canine BMSCs were successfully cultivated by whole bone marrow differential velocity adherent and density gradient centrifugation. Compared with the former， primary cells from the latter method was more uniform after cultivation， and cost shorter time for primary cells proliferation into full confluency along with higher survival rate. The growth curves of undifferentiated cells in P3 and P8 were similar from the both methods. Immunohistochemistry and flow cytometry showed that CD105， CD90 and CD29 were expressed in the cells and could be induced into osteoblasts and adipocytes， respectively， while CD34 and CD31 were not expressed. These results indicated that canine BMSCs could be isolated and cultivated by the both methods， and the density gradient centrifugation method was better compared to the whole bone marrow differential velocity adherent.

canine; bone marrow mesenchymal stem cell; isolation and cultivation

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.05.10

2016-11-22

國家自然科學基金(31172379)

李捷(1990—)，女，河南南陽人，碩士研究生，主要從事干細胞與動物生殖生物學研究。E-mail: hnlijiec@126.com

*通信作者，余樹民，E-mail:yayushumin@163.com

S829.2；Q2-33

A

1004-1524(2017)05-0751-09

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(5): 751-759

李捷，白利鵬，陳曦，等. 犬骨髓間充質干細胞的體外分離培養及鑒定[J].浙江農業學報，2017，29(5): 751-759.