急性髓系白血病中樹突狀細胞疫苗的免疫治療

周 文，李莉娟，王文媛，許麗麗，張連生

(蘭州大學第二臨床醫學院 蘭州大學第二醫院 血液科，甘肅 蘭州 730030)

·綜述·

急性髓系白血病中樹突狀細胞疫苗的免疫治療

周 文，李莉娟，王文媛，許麗麗，張連生

(蘭州大學第二臨床醫學院 蘭州大學第二醫院 血液科，甘肅 蘭州 730030)

急性髓系白血病(AML)中表達白血病相關抗原(LAAs)的白血病細胞來源的樹突狀細胞(DC)及負載LAAs的正常單核細胞來源的DC，均能有效誘導腫瘤特異性細胞毒T淋巴細胞(CTL)反應，有望在治愈AML中發揮重要作用。本文就AML中DC疫苗的培育、分子標記的測定、功能的檢測作一介紹?？偨YDC疫苗治療AML臨床研究的新進展。

白血病， 髓樣， 急性;樹突細胞;免疫療法;疫苗

急性髓系白血病(AML)是白血病干細胞癌基因轉化而來的造血干/祖細胞的惡性腫瘤。盡管大多數患者在標準化療方案的誘導下能夠達到完全緩解，但復發率仍很高。造血干細胞移植是目前最有效的治療手段，但也存在微小殘留引起移植后復發的問題。因此，急需尋找更有效的腫瘤治療方法，進而消除微小殘留病灶，減少白血病復發。以樹突狀細胞為代表的細胞免疫治療有望成為治療腫瘤新方法，與其他免疫治療方法相比，樹突狀細胞(DC)免疫治療的特點主要有主動性免疫、特異性好、持續時間長，能夠針對性地消滅腫瘤干細胞或殘存腫瘤細胞，發揮強大的抗腫瘤免疫效應[1]。在緩解后AML患者外周血單核細胞(MO)中分離得到正常DC(MO-DC)，其不表達白血病分子標志，承載白血病相關抗原后，可有效誘導腫瘤特異性細胞毒T淋巴細胞 (CTL) 對白血病細胞的殺傷作用。在AML中白血病細胞可以直接分化為DC(AML-DC)。這些白血病來源的DC可以表達白血病抗原(LAAs)，有效誘導CTL對自身腫瘤細胞殺傷作用。根據這一原理設計的AML-DC及MO-DC疫苗正在進行臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗。

1 AML患者中DC的來源及體外培養

1.1DC的來源 采用流式細胞術四色射門方法檢測AML患者中DC的表達，結果顯示，69%的初治AML患者發病時檢測不到髓樣樹突狀細胞(mDC)和漿樣樹突狀細胞(pDC)，剩余31%的AML患者DCs水平是正常的或者升高的，在緩解后mDC水平可以恢復，而pDC水平相對較低；研究表明mDC升高或正常的AML-M4/M5較AML-M2/M3患者較常見，而pDC無此區別[2]。已知單核細胞和DC有共同的前體細胞，而AML-M4/M5的發病機制是單核前體細胞惡性病變，突變的細胞可能是分化為巨噬和樹突狀細胞前體細胞的細胞，存在向DC分化的潛能，提示DC來源于白血病細胞。

研究表明Fms樣酪氨酸激酶(FLT3)內部串聯重復序列(ITD)突變陽性的大多數AML患者的mDc和pDC水平明顯高于ITD突變陰性者，從ITD+患者分離所得mDC和pDC均為ITD突變陽性，在體外培養后獲得DC形態，說明其為AML-DC[3]。AML患者完全緩解后分離的外周血MO-DC，用FISH技術(FISH)或者聚合酶鏈反應分析表明DCs無白血病標志，說明其來源于正常前體細胞，對自體白血病細胞有細胞毒性[4]。

AML患者外周血上清液可降低MO-DC的分化成熟及細胞凋亡。說明AML發病時，MO-DC數量減少，AML-DC增多；研究表明，AML患者完全緩解后mDC水平可以恢復[2]。推測可能為正常前體細胞來源DC增加。Danilov等[5]研究表明血管緊張素轉換酶(即CD143)在MO-DC上高表達，而在AML-DC上的表達較低，是第一個能夠區分AML患者DC來源的分子標記。

1.2AML-DC的體外培養AML-DC未培養時對自體AML細胞無明顯的殺傷活性，經細胞因子培養成熟后的AML-DC可誘導效應T細胞對自體AML-DC有效殺傷。體外培養時，不同的細胞因子組合誘導AML-DC成熟，其成熟狀態有一定的差異。AML-DC來源于AML白血病細胞，具有正常DC的典型形態、表型和功能。目前，AML白血病細胞培養不能全部獲得AML-DC。Santiago-Schwarz等[6]第一次使用腫瘤壞死因子(TNF)、粒細胞巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)、干細胞因子(SCF)及白介素(IL)6體外培養1例AML患者白血病細胞24小時后，其可分化為AML-DC。目前AML患者白血病細胞分化為AML-DC的最佳體外培養方案為重組GM-CSF聯合重組IL-4，0.7×106的白血病細胞在0.7～1ml的血清培養液中培養6天后可獲得約0.3×106的成熟AML-DC，回收率約28%～50%[7]。

1.3AML-DC的分子標記檢測AML-DC具有AML患者白血病細胞的腫瘤相關抗原，且可遞呈抗原。體外誘導成熟的AML-DC具有DC的形態，使用相差顯微鏡觀察，其胞體較誘導前明顯增大，呈不規則形或樹枝狀突起。透射電子顯微鏡下，可見不規則形細胞核，位于胞漿一側，胞漿豐富及充分發育的高爾基體，且表達Ⅱ型主要組織相容性復合體(MHC)，是典型的成熟DC型態[8]。由AML患者白血病細胞培養所得的未成熟AML-DC較白血病細胞中CD14低表達，CD1a和人類白細胞DR抗原(HLA-DR)高表達；而CD11c，CD40和CD86無明顯差異[8]。AML-DC成熟后較白血病細胞高表達CD83，CD86，CD40，CD11c，CCR7和HLA-DR，CD14表達下調，CD1a和Toll樣受體(TLR)表達無明顯區別[8-9]。

2 AML患者中DC的功能

2.1AML患者不成熟DC的功能 不成熟DC的主要功能為捕捉抗原。DC通過表面表達的c型凝集素樣受體、TLR和螺旋酶等模式識別受體識別壞死的腫瘤細胞，且化療可增強DC識別腫瘤抗原的能力。

不成熟DC主要在骨髓和淋巴結中捕捉AML抗原，AML腫瘤細胞及胞外細胞因子可影響DC捕捉抗原功能。死亡的腫瘤細胞可以被DC捕捉，腫瘤細胞有壞死、凋亡、衰老和自吞噬，其中凋亡細胞影響DC的吞噬和處理，通過表達3種信號，即“發現我”，“吃掉我”和“別吃我”[10]。對于壞死細胞，DC可識別壞死細胞暴露的胞內成分而進行吞噬遞呈。目前不成熟DC對腫瘤自吞噬細胞和衰老細胞的抗原遞呈尚不清楚。

2.2AML成熟DC的功能

2.2.1 成熟DC遞呈抗原的性質AML白血病細胞來源的AML-DC表達LAA。正常細胞來源的DC無白血病抗原，故需要負載AML抗原，負載的抗原包括AML多肽、AML細胞溶解殘余物、AML細胞所有RNA、凋亡的白血病細胞。有研究報道白血病凋亡濾泡是MO-DC最佳負載抗原，可有效激活CD8+T細胞，增強對腫瘤細胞的殺傷作用[11]。Li等[12]應用實時定量聚合酶鏈反應檢測AML-DC的3種白血病抗原表達，即黑色素瘤特異性抗原(PRAME)， 透明質酸介導的運動受體(RHAMM)和wilm腫瘤蛋白1(WT1)，結果顯示，15例AML患者的AML-DC表達至少一種LAA，且其在AML-DC上較白血病細胞表達高。

應用實時定量聚合酶鏈反應檢測AML-DC較白血病細胞LAAs表達水平變化，結果顯示7/12患者AML-DC上PRAME表達上調，6/12患者AML-DC上RHAMM表達上調，2/12患者AML-DC上WT-1表達上調，1/12患者AML-DC上蛋白酶-3表達上調，所有樣本至少高表達一種LAA；采用流式細胞儀觀察，AML-DCs與AML白血病細胞相比，CD40和CD80表達明顯上調，RHAMM、PRAME蛋白陽性[13]。

2.2.2 成熟DC的功能Nourizadeh等[7]研究報道15例AML患者中11例患者白血病細胞可分化為DC，其中大多數為M4、M5型，且AML-DC的平均回收率為42%，與上述研究報道相符。未成熟AML-DC經Toll樣受體4和Toll受體7/8聯合刺激后可更好的成熟，成熟的AML-DC經趨化因子介導，向淋巴結遷移，進而更有效的刺激T細胞免疫反應[7]。在體外，Toll樣受體激動劑活化的AML-DC可促進共刺激分子表達，大量分泌IL-12，增強TH1型反應，且能強效誘導特異性CTL靶向殺傷腫瘤作用[8]。

3 AML成熟DC誘導的免疫反應的增強

選擇最恰當的DC疫苗佐劑能夠減少疫苗接種數量、確保其對病原的快速反應、減少所需抗原數量、增強自身抗體免疫反應及確保其對特異性抗原最有效和適當的免疫反應[14]。

3.1AML-DC的免疫反應的增強Brady等[15]研究表明用細胞轉染方法敲除AML-DC的信號轉導與轉錄激活因子基因3(STAT3)，可以增強AML-DC的免疫原性，增加T細胞的增殖及分化，用三氧化二砷(ATO)抑制AML-DC中STAT3的活性，可上調共刺激分子的表達，促進AML-DC的成熟，其誘導T細胞活化作用增強，IL-12p40分泌增加，增強CD8+T細胞對白血病細胞的殺傷作用。研究報道，鋅指蛋白A20負性調節AML-DC的成熟及其免疫刺激效應，估下調AML-DC中的A20或使其變性，可增強AML-DC的分化成熟，并通過核轉錄因子κB(NF-κB)信號同路，誘導自體CTL對AML腫瘤細胞特異性殺傷效應[16]。

在體外，TNF-α，脂多糖及TLR激動劑聯合刺激AML-DC成熟，可很大程度上增強AML-DC的抗原遞呈作用，CTL釋放干擾素-γ增多，增強CTL對AML白血病細胞的清除作用[17]。體外應用佐劑能夠進一步強化AML-DC誘導的免疫反應。Houtenbos等[18]研究報道，在AML-DC與自體或異體T細胞共培養中，加入4-1BBL蛋白可上調共刺激分子的表達，促進CD8+T細胞的增殖及其對白血病的細胞毒作用，誘導干擾素-γ高表達的TH1型反應，顯著增加WT1特異性T細胞，增強T細胞介導的淋巴細胞群對白血病細胞的溶解作用，表明在AML-DC治療AML中，4-1BBL是一種增強AML-DC誘導T細胞免疫反應的有效佐劑。

Schmitt等[19]用定量聚合酶鏈反應檢測到AML-DC高表達TLR2/4，低表達TLR9，加入TLR2配體微生物肽聚糖及脂磷壁酸、TLR4的配體脂多糖和TLR9配體寡核苷酸后可增加TNF-a和IL-6的分泌，促進TH1型反應，加強AML-DC疫苗對腫瘤的殺傷效應，說明微生物配體是增強AML-DC疫苗作用的有效佐劑。已知帶有甘露糖敏感血凝菌毛的銅綠假單胞菌可促進AML-DC的成熟，抑制初始T細胞向調節性T細胞分化，增強AML-DC對調節性T細胞的抑制作用，從而增強機體的抗白血病作用，可作為AML-DC疫苗的免疫佐劑。

3.2MO-DC免疫反應的增強 通過使用有效免疫佐劑增強MO-DC的免疫反應效應，MO-DC可更有效發揮抗腫瘤作用，有效清除腫瘤細胞，改善自體免疫功能。研究報道在體外用RNA電穿孔法使MO-DC生成IL-15，IL-15上調NK細胞的膜分子活性，NK細胞分泌干擾素-γ、顆粒霉素B及穿孔素增加，NK細胞對腫瘤細胞的敏感性及殺傷能力增強[20]。因此，在臨床應用中使用免疫佐劑增強MO-DC免疫功能后，可減少使用疫苗的數量，從而可減少使用疫苗后的臨床不良反應。

4 AML臨床中應用的DC疫苗

DC疫苗已進行臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗。臨床上使用免疫佐劑可有效增強DC疫苗的抗腫瘤效應，明顯改善非M3型AML患者的預后(圖1)。造血前體細胞來源DC和MO-DC可皮下或靜脈給藥，因其趨化到淋巴組織的能力強，而AML-DC趨化到淋巴組織的能力弱，估需要直接注射到淋巴結。AML-DC凍存長達21個月后仍然有效[21]。研究報道AML-DC疫苗用于臨床實驗治療非M3型的AML患者，3例患者在5.5～13個月期間保持病情穩定，2例患者病情迅速進展死亡，未觀察到不良反應[21]。研究表明，在臨床實驗中MO-DC疫苗與AML-DC疫苗相比，能更有效活化AML患者中的腫瘤特異性T細胞的免疫反應[4]。

圖1 DC疫苗的臨床應用

新一代的MO-DC疫苗是由Toll樣受體在3天內誘導成熟的，并且載有白血病相關抗原WT1蛋白及PRAME，從而誘導AML特異性的T細胞的免疫反應，已用于緩解后復發AML患者的Ⅰ/Ⅱ期臨床實驗[22]。研究表明在AML患者中有一種特異的DC亞型DC8a，可靶向先天免疫系統，改善免疫耐受，靶點為Toll樣受體、CD47及STAT3，提示在先天免疫水平上，可抑制腫瘤細胞的免疫逃避，從而有益于患者[23]。

5 結語

雖然DC的研究已經很深入，尤其是在體外的研究，但是仍然存在很多問題及不足，尚需進一步研究。我們還需探討決定DC成為耐受型或免疫原性DC的具體機制；準確評估臨床實驗DC疫苗的安全性；探索臨床應用中安全有效的DC疫苗劑量，密切注意尚未觀察到的臨床不良反應。對這些問題的深入研究將很大程度提高DC在AML免疫治療中的臨床應用，降低患者的復發及病死率。

[1] 李莉娟，張連生.樹突狀細胞免疫治療:困惑與希望[J].白血病·淋巴瘤，2013，22(7):398-400.

[2]DerolfAR，LaaneE，Bj?rklundE，etal.Dendriticcellsinbonemarrowatdiagnosisandafterchemotherapyinadultpatientswithacutemyeloidleukaemia[J].ScandJImmunol， 2014， 80(6): 424-431.

[3]RickmannM，KrauterJ，StamerK，etal.ElevatedfrequenciesofleukemicmyeloidandplasmacytoiddendriticcellsinacutemyeloidleukemiawiththeFLT3internaltandemduplication[J].AnnHematol， 2011， 90(9): 1047-1058.

[4]DraubeA，BeyerM，WolfJ.Activationofautologousleukemia-specificTcellsinacutemyeloidleukemia:monocyte-deriveddendriticcellscoculturedwithleukemicblastscomparedwithleukemia-deriveddendriticcells[J].EurJHaematol， 2008，81(4): 281-288.

[5]DanilovSM，SadovnikovaE，ScharenborgN，etal.Angiotensin-convertingenzyme(CD143)isabundantlyexpressedbydendriticcellsanddiscriminateshumanmonocyte-deriveddendriticcellsfromacutemyeloidleukemia-deriveddendriticcells[J].ExpHematol， 2003，31(12): 1301-1309.

[6]Santiago-SchwarzF，CoppockDL，HindenburgAA，etal.Identificationofamalignantcounterpartofthemonocyte-dendriticcellprogenitorinanacutemyeloidleukemia[J].Blood， 1994，84(9): 3054-3062.

[7]NourizadehM，MasoumiF，MemarianA，etal.SynergisticeffectofToll-likereceptor4and7/8agonistsisnecessarytogeneratepotentblast-deriveddendriticcellsinacutemyeloidleukemia[J].LeukRes， 2012，36(9): 1193-1199.

[8]NourizadehM，MasoumiF，MemarianA，etal.Invitroinductionofpotenttumor-specificcytotoxicTlymphocytesusingTLRagonist-activatedAML-DC[J].TargetOncol， 2014，9(3): 225-237.

[9]GogolakP，RethiB，SzatmariI，etal.DifferentiationofCD1a-andCD1a+monocyte-deriveddendriticcellsisbiasedbylipidenvironmentandPPARgamma[J].Blood， 2007，109(2): 643-652.

[10]OthT，VanderlochtJ，VanElssenCH，etal.Pathogen-associatedmolecularpatternsinducedcrosstalkbetweendendriticcells，Thelpercells，andnaturalkillerhelpercellscanimprovedendriticcellvaccination[J].MediatorsInflamm，2016，2016(12): 5740373-5740395.

[11]RubenJM，vandenAnckerW，BontkesHJ，etal.Apoptoticblebsfromleukemiccellsasapreferredsourceoftumor-associatedantigenfordendriticcell-basedvaccines[J].CancerImmunolImmunother， 2014，63(4): 335-345.

[12]LiL，SchmittA，ReinhardtP，etal.ReconstitutionofCD40andCD80indendriticcellsgeneratedfromblastsofpatientswithacutemyeloidleukemia[J].CancerImmun， 2003，3(2): 8-15.

[13]LiL，ReinhardtP，SchmittA，etal.Dendriticcellsgeneratedfromacutemyeloidleukemia(AML)blastsmaintaintheexpressionofimmunogenicleukemiaassociatedantigens[J].CancerImmunolImmunother， 2005，54(7): 685-693.

[14]HoutenbosI，WestersTM，OssenkoppeleGJ，etal.IdentificationofCD14asapredictorforleukemicdendriticcelldifferentiationinacutemyeloidleukemia[J].Leukemia， 2003，17(8): 1683-1684.

[15]BradyMT，MillerA，SaitSN，etal.Down-regulationofsignaltransducerandactivatoroftranscription3improveshumanacutemyeloidleukemia-deriveddendriticcellfunction[J].LeukRes， 2013，37(7): 822-828.

[16]ZhangX，SuY，SongH，etal.AttenuatedA20expressionofacutemyeloidleukemia-deriveddendriticcellsincreasedtheanti-leukemiaimmuneresponseofautologouscytolyticTcells[J].LeukRes， 2014，38(6): 673-681.

[17]ZhongR，LiH，MesserK，etal.AugmentationofautologousTcellreactivitywithacutemyeloidleukemia(AML)blastsbyToll-likereceptor(TLR)agonists[J].CancerImmunolImmunother， 2015，64(6): 737-744.

[18]HoutenbosI，WestersTM，DijkhuisA，etal.Leukemia-specificT-cellreactivityinducedbyleukemicdendriticcellsisaugmentedby4-1BBtargeting[J].ClinCancerRes， 2007，13(1): 307-315.

[19]SchmittA，LiL，GiannopoulosK，etal.QuantitativeexpressionofToll-likereceptor-2， -4，and-9indendriticcellsgeneratedfromblastsofpatientswithacutemyeloidleukemia[J].Transfusion， 2008，48(5): 861-870.

[20]VandenBerghJ，WillemenY，LionE，etal.Transpresentationofinterleukin-15byIL-15/IL-15RalphamRNA-engineeredhumandendriticcellsboostsantitumoralnaturalkillercellactivity[J].Oncotarget， 2015，6(42): 44123-44133.

[21]TanYF，SimGC，HabsahA，etal.Experimentalproductionofclinical-gradedendriticcellvaccineforacutemyeloidleukemia[J].MalaysJPathol， 2008，30(2): 73-79.

[22]SubkleweM，GeigerC，LichteneggerFS，etal.Newgenerationdendriticcellvaccineforimmunotherapyofacutemyeloidleukemia[J].CancerImmunolImmunother， 2014，63(10): 1093-1103.

[23]CurranE，CorralesL，KlineJ.Targetingtheinnateimmunesystemasimmunotherapyforacutemyeloidleukemia[J].FrontOncol， 2015，5(7): 83-101.

張連生，Email:zls170@yahoo.com

R

A

1004-583X(2017)06-0549-04

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.06.024

2017-02-14 編輯:王秋紅