急性肝衰竭大鼠模型中大黃提取物治療作用分析

葉丹　王鳳玲

[摘要] 目的 探討對急性肝衰竭大鼠模型采用大黃提取物的治療作用。 方法 利用D-氨基半乳糖建立大鼠急性肝功能衰竭模型。選取SD大鼠15只，隨機分為3組（n=5）。A組為健康大鼠，不施加任何試驗處理；B組為肝衰竭大鼠，造模后12 h尾靜脈注射1 mL生理鹽水；C組為大黃提取物治療組，造模后12 h向腹腔注射大黃提取物（10 mL/kg），每日3次，連續注射2 d。各組大鼠均在造模48 h之后注射10%的水合氯醛進行麻醉，取門靜脈血以及肝組織標本進行試驗指標觀測。 結果 B組大鼠造模后出現急性肝衰竭表現，而A組、C組均無或僅有少量癥狀出現。B組大鼠在造模48 h后血清ALT、AST以及TBiL含量均出現顯著上升，而C組出現下降。 結論 大黃提取物有利于促進急性肝衰竭大鼠的恢復，并且能促進骨髓間充質干細胞的增殖，增強BMSCs細胞移植的治療效果。此治療方法能夠促進肝細胞的再生和修復，為肝功能障礙患者提供一定的治療。

[關鍵詞] 大黃提取物；急性肝衰竭；大黃素

[中圖分類號] R575.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）12-0032-03

[Abstract] Objective To explore the therapeutic effect of rhubarb extract in the model of rats with acute liver failure. Methods D-galactosamine was used to establish the model of rats with acute liver failure. A total of 15 SD rats were selected and randomly divided into 3 groups（n=5）. Group A was healthy rats without any experimental treatment； group B was the rats with liver failure， and the rats were injected with 1 mL normal saline at caudal vein 12 hours after modeling； group C was the treatment group of rhubarb extract， at 12 hours after modeling at caudal vein， rhubarb extract（10 mL/kg） was intraperitoneally injected 3 times a day for a continuous injection of 2 days. Rats in each group were injected with 10% of chloral hydrate after anesthesia for 48 hours. Portal vein blood samples and liver tissue specimens were collected for the observation of test indices. Results Rats in group B showed acute liver failure after modeling， and group A， group C were without or only with a small number of symptoms. The levels of serum ALT， AST and TBiL in group B 48 h after modeling were significantly increased， and the levels were reduced in group C. Conclusion Rhubarb extract is beneficial to promoting the recovery of acute liver failure rats， and can promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells and enhance the therapeutic effect of BMSCs transplantation. This therapy can promote the regeneration and repair of liver cells， and provide certain treatment for the patients with liver dysfunction.

[Key words] Rhubarb extract； Acute liver failure； Emodin

急性肝功能衰竭（acute liver failure，ALF）是指由一系列復雜原因造成患者肝臟細胞大量壞死，導致肝功能急劇喪失并出現黃疸、腹水等一系列并發現象的肝功能障礙[1-4]。急性肝功能衰竭的病因多種多樣，在我國主要是由急性肝炎所致，不過藥物或者毒物中毒也是很重要的一個病因[5-7]。目前針對ALF患者的主要治療方式為肝臟移植，不過這種方式也有很大的弊端，主要包括費用昂貴、肝源不足等。由于治療急性肝衰竭的關鍵在于增加正常肝細胞的數量以及減少壞死的肝細胞數量，因此目前也可以采用干細胞移植方式對患者進行治療[8，9]。大黃提取物的主要成分為大黃素（emodin，EMD），研究表明大黃素可以抑制癌細胞的DNA、RNA和蛋白質的生物合成，抑制癌細胞的氧化脫氫；同時大黃素對于微生物生長也有一定的抑制作用[10]。有研究表明，向大鼠腹腔注射大黃素可以降低大鼠的免疫系統功能、減少抗體產生、降低白細胞數目并抑制吞噬細胞的吞噬功能[11]。因此本試驗探討大黃提取物治療方法對急性肝功能衰竭大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 清潔級健康雌性SD大鼠共15只，體重均在200 g左右，實驗大鼠來自溫州醫科大學實驗動物中心。

1.1.2 試驗試劑 D-氨基半乳糖購自上海潤成生物科技有限公司，大黃素購自南京普怡生物科技有限公司，胎牛血清及低糖DMEM培養液購自Hyclone公司，ELISA試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司。

1.2 方法

將15只試驗大鼠隨機分為3組，每組各5只。A組為健康大鼠，不施加任何試驗處理；B組為肝衰竭大鼠，造模后12 h尾靜脈注射1 mL生理鹽水；C組為大黃提取物治療組，造模后12 h于腹腔注射大黃提取物（10 mL/kg），每日3次，連續注射2 d。各組大鼠均在造模48 h之后注射10%的水合氯醛進行麻醉，取門靜脈血以及肝組織標本進行試驗指標檢測。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般觀察 各組大鼠處死之前，連續觀察大鼠的精神狀態、采食情況以及活動狀態，記錄大鼠鞏膜以及小便顏色等情況。

1.3.2 肝功能檢測 通過門靜脈采取大鼠血清標本，利用全自動生化分析儀檢測常見肝功能指標：血清丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBiL）。

1.3.3 肝組織病理學觀察 取肝組織，用10%的甲醛固定后脫水制作石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察。采用半定量分析法評價肝組織病變：0分為正常，標記為“-”；1分表示肝細胞點狀壞死，標記為“+”；2分表示肝細胞少量壞死，標記為“++”；3分表示肝小葉肝細胞大量壞死，標記為“+++”；4分表示肝細胞幾乎全部壞死，標作“++++”。

1.3.4 血清IL-1及TNF-α的含量檢測 采用ELISA雙抗夾心法進行檢測，按照試劑盒說明書進行操作。

1.4統計學處理

數據采用SPSS19.0 統計學軟件進行處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般觀察

與A組大鼠進行比較，造模12 h后B組大鼠表現出肝功能衰竭的癥狀，如食欲減退、活動減少、精神不振以及嗜睡現象，少數大鼠還出現了尿色深黃現象。造模24 h后B組大鼠出現持續昏睡現象，對于外界刺激反應不明顯，偶有口腔鼻腔出血現象。造模48 h后B組大鼠開始進入深度昏迷，幾乎喪失生命癥狀。C組大鼠與A組大鼠相比幾乎沒有上述現象出現，或僅有少量大鼠出現輕微的癥狀，且持續時間很短。

2.2 各組肝功能檢測比較

與A組大鼠相比，B組大鼠在造模48 h后血清ALT、AST以及TBiL含量均出現顯著上升。與B組相比，C組大鼠血清各指標含量下降且有統計學差異。見表1。

2.3 肝組織病理學觀察

大鼠肝組織損傷觀察主要從肝小葉結構、肝細胞壞死以及出血情況進行評分，采用半定量分析法進行判定。與A組對比，B組觀測到肝小葉結構被明顯破壞，肝細胞形態膨脹，出現大面積的細胞壞死現象，肝竇擴張并且伴有出血現象。C組可觀測到部分肝小葉結構被破壞，肝細胞出現點狀壞死，部分區域出現炎細胞浸潤，但相對于B組仍然有較多正常的肝細胞，見表2，細胞鏡下觀察圖片見封三圖3。

2.4各組血清IL-1及TNF-α含量檢測

與A組相比，B組、C組大鼠血清炎癥指標均在造模后48 h迅速上升，組間差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3。

3討論

急性肝功能衰竭主要是由于大量的肝細胞壞死導致的，臨床表現為出現意識障礙并伴隨黃疸現象，呼氣有特殊的甜酸味，偶有腸胃出血現象，并發其他器官出現功能性障礙如腎功能降低等[12]。目前肝衰竭的治療方法僅有肝移植，可是肝移植也有很大的弊端，如肝源的短缺以及患者的免疫排斥反應、手術風險大、費用昂貴等[13]。但是隨著細胞移植技術的不斷成熟，現在針對肝衰竭的治療方法包括骨髓間充質干細胞移植，這種治療方式不僅可以增加患者正常肝細胞數量，也可以對等待進行肝移植的患者起到緩解作用，防止患者在等待期間肝細胞大量壞死而導致肝臟功能完全喪失，不過目前這種治療方式仍然處于研究階段。

大黃提取物的主要成分為大黃素，研究表明大黃素具有抗腫瘤和抑制免疫功能等作用，研究發現[14]，大黃素能減少肝損傷后肝組織中炎癥細胞的分泌，抑制肝細胞壞死。大黃素為蓼科植物虎杖的干燥根莖和根，屬植物型藥劑，有多種藥理藥效。其中包括：（1）抗腫瘤活性作用：大黃素可以抑制小鼠肝癌、乳腺癌等多種癌癥，通過抑制癌細胞遺傳物質和蛋白質的生物合成控制腫瘤的發展和擴散；（2）抗微生物生長作用；（3）免疫抑制作用；（4）小劑量對離體蟾蜍心臟有興奮作用，而大劑量則有抑制作用[15，16]。

在本次研究中，大黃素注入治療后，C組大鼠表現為輕微的肝功能衰竭現象，且血清ALT、AST以及TBiL相對于B組大鼠下降，說明大黃素對急性肝功能衰竭大鼠的肝臟有一定的修復作用。其原因可能在于大黃素刺激骨髓間質干細胞分化形成正常的肝細胞，補充因為大量肝細胞壞死而導致的肝功能代償性喪失，以及由于進入肝臟組織的大黃提取物含有微量物質，可能會促進肝細胞分泌活性物質以及生長因子，這些物質也可以促進肝臟細胞的自我修復從而緩解肝損傷[17-19]。C組大鼠血清中炎性因子出現一定程度的下降，說明大黃提取物可以抑制肝組織的炎癥反應，減少炎性細胞的產生和浸潤，可能由于促進肝細胞分泌多種細胞因子和生長因子抑制炎癥反應[20]。有研究表明大黃素可以通過抑制巨噬細胞的激活減少炎性因子的釋放，所以能更大程度地修復受損的肝細胞，分析大黃素能修復受損肝細胞的原因還可能包括大黃素可以調控細胞纖維化過程。有研究發現，大黃素能夠促進凋亡蛋白的表達調控細胞凋亡過程，而大黃素通過這一過程可促進肝細胞凋亡降低肝細胞的纖維化。曾有研究表明，炎性因子TNF-α在肝損傷的過程中起到重要的作用[15，16]，在本研究中也證明了以上觀點：肝損傷程度與炎性因子TNF-α含量呈正相關，因此在臨床治療上，可以盡量抑制肝臟的炎癥反應以減少對肝組織的損傷。

綜上所述，大黃提取物可以對肝衰竭起到一定的治療作用，通過大黃提取物可以改善肝臟內環境，減少炎性因子的分泌，治療肝衰竭以及促進肝細胞再生。

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（收稿日期：2017-01-23）